Name: Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Lernen Sie die Polysom-Profilerstellung zur Analyse der mRNA-Translation in Leishmania major, menschlichen Zellen und Maus-Hoden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinbiosynthese-Regulationsmechanismen.

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Die Autoren danken für die Hilfe mit Audioaufnahme Ching Lee. Die Forschung wurde durch das Startkapital von Texas Tech University Health Sciences Center unterstützt und durch das Center of Excellence für translationale Neurowissenschaften und Therapeutika (CTNT) gewähren, PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; Teil von NIH Grant R01AI099380 K.Z James C. Huffman und Kristen R. Baca waren CISER (Zentrum für die Integration von Mint-Ausbildung & Forschung) Gelehrten und wurden vom Programm unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Polysome Fraktionierung von Saccharose Farbverlauf in Kombination mit RNA und Protein-Analyse der Fraktionen ist eine leistungsfähige Methode, translationale Status der einzelnen mRNAs oder die ganze Translatome sowie Rollen der Protein Faktoren translational Regelung zu analysieren Maschinen während der normalen physiologischen oder Krankheit Zustand. Polysomal die Profilerstellung ist eine besonders geeignete Technik studieren translational Regelung in Organismen wie Trypanosomatids einschließlich Leishmaniose...

Regulation der Genexpression in den Zellen wird durch transkriptionelle, posttranskritionelle und posttranslationale Mechanismen gesteuert. Fortschritte in der Tiefe RNA Sequenzierung ermöglichen die Untersuchung der stationären mRNA-Niveaus auf einer genomweiten Skala auf einem noch nie da gewesenen Niveau. Neuere Erkenntnisse ergaben jedoch, dass stationäre mRNA Ebene nicht immer mit Protein Produktion1,2 korreliert. Das Schicksal eines einzelnen Niederschrift ist sehr komplex und hängt von vielen Faktoren wie interne/externe Reize, Stress, etc.. Regulation der Genexpression während der Proteinsynthese bietet eine weitere Schicht von Expressions notwendig für eine schnelle Reaktion in wechselnden Bedingungen. Polysome (oder "Polyribosome"), die Profilierung, die Trennung und Visualisierung von Ribosomen, aktiv zu übersetzen ist eine leistungsfähige Methode, die Regulierung der Proteinsynthese zu studieren. Obwohl die ersten experimentellen Anwendungen in den 1960er Jahren3erschien, ist Polysome Profilerstellung derzeit eine der wichtigsten Techniken in Protein Übersetzung Studien4. Einzelnen mRNAs kann durch mehrere Ribosomen führt zur Bildung von einem Polysome übersetzt werden. Protokolle können auf Ribosomen mit Cycloheximide5 ins Stocken geraten und mRNAs mit unterschiedlichen Anzahlen von Polysomes getrennt werden können, in den Prozess der Polysome Fraktionierung von Saccharose gradient Ultrazentrifugation6,7 , 8 , 9. RNA Analyse der polysomal Brüche dann erlaubt Messung von Veränderungen in der translationalen Staaten der einzelnen mRNAs auf Genom-weite Skala und bei verschiedenen physiologischen Bedingungen4,7, 10. die Methode wurde auch verwendet, um offenbaren die Rollen von 5' UTR und 3' UTR-Sequenzen in der Steuerung von mRNA Übersetzbarkeit11, untersuchen die Rolle der MiRNAs in translational Repression12, entdecken Mängel im Ribosom Biogenese13 , und die Rolle des Ribosom-assoziierte Proteine mit menschlichen Krankheiten14,15verstehen. Während des letzten Jahrzehnts entstanden eine immer größere Rolle für die Regulation der Genexpression während der Übersetzung, die ihre Bedeutung im menschlichen Krankheiten zeigt. Der Beweis für translational Control in Krebs, Stoffwechselstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen ist überwältigend15,16,17,18. Z. B. Dysregulation eIF4E-abhängige translational Steuerung trägt zum Autismus im Zusammenhang mit Defiziten15 und FMRP engagiert sich in der Ribosomen im Zusammenhang mit Autismus14mRNAs abwürgen. Polysomal Profilierung ist somit ein sehr wichtiges Instrument, um Mängel in translational Regelung in mehrere menschliche Krankheiten zu studieren.
Protein-Analyse der polysomal Brüche unter verschiedenen physiologischen Bedingungen seziert die Funktion der Faktoren im Zusammenhang mit Ribosomen während der Übersetzung. Die Polysome Profilerstellungs-Technik ist in vielen Arten wie Hefe, Säugetier-Zellen, Pflanzen und Protozoen10,19,20,21verwendet worden. Protozoen-Parasiten wie Trypanosomen und Leishmanien begrenzte transkriptionelle Kontrolle der Genexpression aufweisen. Ihre Genome sind in Polycistronic Gen-Cluster organisiert, die Promoter-regulierte Transkription22fehlt. Developmental Genexpression wird hingegen überwiegend auf der Ebene der Protein-Übersetzung und mRNA Stabilität in Trypanosomatid Arten23,24gesteuert. Deshalb Verständnis für translationale Kontrolle bei fehlender transcriptional Regelung für diese Organismen besonders wichtig. Polysomal die Profilerstellung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur posttranskritionelle Regulation der Genexpression in Leishmaniose25,26,27,28zu studieren.
Die jüngste Fortschritte in der Erkennung der einzelnen mRNAs Ebenen von Real time quantitative PCR (RT-qPCR) und volle Transkriptom Sequenzierung der nächsten Generation sowie Proteomics Technologien, Auflösung und Vorteile des polysomal profiling auf ein neues Niveau bringt. Die Verwendung dieser Methoden kann durch Analyse der einzelnen polysomal Fraktionen durch tiefe RNA-Sequenzierung zusammen mit Proteomic Analyse der translationalen Statusüberwachung von Zellen in einer genomweiten Skala erweitert werden. Dies ermöglicht die Identifizierung neuer molekularer Spieler Regulierung Übersetzung unter verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen. Hier präsentieren wir eine universelle Polysome Profilierung auf drei verschiedenen Modellen verwendete Protokoll: die Parasiten Leishmania großen, kultivierten menschlichen Zellen und tierischen Geweben. Beratung präsentieren bei der Vorbereitung der Zelle Lysates wir aus verschiedenen Organismen, Optimierung der Gradientenbedingungen, Auswahl von RNase-Inhibitoren und Anwendung von RT-qPCR, Western-Blot und RNA-Elektrophorese Polysome Brüche in dieser Studie zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Instruments:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gradient Master</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td></td> 108-Kolben-Gradientenfraktionator <td></td></tr><tr><td></td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td>152</td><td></td></tr><tr><td>Fraktionssammler</td><td>Gilson, Inc.</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2-FL/Ts2</td><td></td></tr><tr><td>2720 Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems by Life Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Panasonic Healthcare Co.</td><td>MCO-170A1CUV</td><td></td></tr><tr><td>HERATHERM Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063</td><td></td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank, Klasse II, Typ A2</td><td>NuAire Inc.</td><td>NU-543-400</td><td></td></tr><tr><td>Revco Gefrierschrank</td><td>Revco Technologies</td><td>ULT1386-5-D35</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L8-M Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>L8M-70</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge Rotor SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Ausschwingrotor</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td></td></tr><tr><td>Festwinkelrotor</td><td>Eppendorf</td><td>F-45-30-11</td><td></td></tr><tr><td>Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR Maschine 285880228</td><td>Applied Biosystems by life technologies</td><td>4470661</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td><starke>Software&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triax Software&nbsp;</td><td>Biocomp Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materialien:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zählobjektträger, Doppelkammer für Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Offene polyklare Zentrifugenröhrchen, (14 mm x 89 mm)</td><td>Seton Scientific</td><td>7030</td><td></td></tr><tr><td>Spritze, 5 mL</td><td>BD</td><td></td><td></td>309646</tr><tr><td>BD Spritze 3 mL23 Gauge 1 Zoll Nadel</td><td>BD</td><td>10020439</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Auflegeplatte, 14 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>168381</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta Auflegeplatte, 9 cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Schnelldurchfluss 90 mm Filtereinheit, 500 mL, 0,2 aPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 75 cm3 Kolben</td><td>Thermo Scientific</td><td>130193</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalien:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol LS</td><td>Ambion von Life Technologies</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1378-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium-High Glucose (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F0926-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung ( DPBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2x6H2O)</td><td>Acros Organics</td><td>AC413415000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 (NP-40)</td><td>Fluka (Sigma-Aldrich)</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter Rnasin-Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>H3993-1MU</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-freie Proteasehemmer</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0551</td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximid</td><td>Sigma</td><td>C7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>Dithiotreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1302-10</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumdehydrat (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>Scientific S316-212</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Life Technologies</td><td>22600050</td><td></td></tr><tr><td>Puromycindihydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>P8833-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3KG</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Hgh Kapazität cDNA Reverse Transkriptase Kit</td><td>Angewandte Biosysteme von life technologies</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Angewandte Biosysteme von life technologies</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Sigma</td><td>221473-500G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RPL11 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab79352</td><td></td></tr><tr><td>Ribosomales Protein S6 (C-8) Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-74459</td><td></td></tr><tr><td>1xM199</td><td>Sigma</td><td>M0393-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Lithium-Clorid</td><td>Sigma</td><td>L-9650</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Ladepuffer II</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäure (TCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A322-100</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Chemilumineszenzsubstrat</td><td>Thermo Scientific</td><td>34580</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L5750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5&prime;-triphosphat Dinatriumsalzhydrat (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Cytosin 5'-triphosphat Dinatriumsalzhydrat (CTP)</td><td>Sigma</td><td>C1506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Uridin 5'-triphosphat trinatriumsalzhydrat (UTP)</td><td>Sigma</td><td>U6625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Guanosin-5'-triphosphat-Natriumsalzhydrat (GTP)</td><td>Sigma</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>Pyrophoshatase</td><td>Sigma</td><td>I1643-500UN</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma</td><td>S0266-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

polysome profilerstellung in leishmaniose, menschliche zellen und maus hoden

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Richtige Protein-Expression zum richtigen Zeitpunkt und in der richtigen Menge ist die Grundlage der normalen Zellfunktion und Überleben in einer sich schnell verändernden Umgebung. Für eine lange Zeit dominierten die genexpressionsstudien Forschung auf transkriptioneller Ebene. Jedoch die Steady-State Ebenen der mRNAs nicht korrelieren gut mit Protein-Produktion und die Übersetzbarkeit von mRNAs variiert stark je nach Bedingungen. In einigen Organismen, wie den Parasiten Leishmaniaist die Proteinexpression vor allem auf der translationalen Ebene geregelt. Jüngste Studien gezeigt, dass dieses Protein Übersetzung Dysregulation mit Krebs, Stoffwechselstörungen, neurodegenerativen und anderen Krankheiten des Menschen verknüpft ist. Polysome Profilerstellung ist eine leistungsfähige Methode, Protein Übersetzung Verordnung zu studieren. Es ermöglicht die translationalen Status der einzelnen mRNAs zu messen oder Übersetzung auf einer genomweiten Skala zu untersuchen. Die Grundlage dieser Technik ist die Trennung von Polysomes, Ribosomen, deren Untereinheiten und kostenlose mRNAs bei der Zentrifugation von einer zytoplasmatischen lysate durch einen Farbverlauf von Saccharose. Hier präsentieren wir Ihnen eine universelle Polysome Profilerstellung verwendete Protokoll auf drei verschiedenen Modellen - Parasiten Leishmania großen, kultivierten Zellen der menschlichen und tierischen Geweben. Leishmaniose Zellen wachsen frei schwebend und kultivierte menschlichen Zellen wachsen in adhärenten Monolage während Maus Hoden eine tierisches Gewebeprobe darstellt. Somit ist die Technik an all diese Quellen angepasst. Das Protokoll für die Analyse der polysomal Brüche beinhaltet Erkennung von einzelnen mRNA-Niveaus von RT-qPCR Proteine durch Western-Blot und Analyse der ribosomalen RNAs durch Elektrophorese. Die Methode kann durch Untersuchung der mRNAs Association mit dem Ribosom auf Transkriptom Ebene durch tiefe RNA-Seq und Analyse des Ribosom-assoziierte Proteine durch Massenspektroskopie der Fraktionen erweitert werden. Die Methode ist leicht zu anderen biologischen Modellen einstellbar.

In dieser Studie beschreiben wir die Anwendung der polysomal Profilerstellung Technik zu drei verschiedenen Quellen: parasitäre Leishmaniose großen, kultivierten menschlichen Zellen und Maus Hoden. Leishmaniose Zellen frei wachsen in den flüssigen Medien in der Schwebe, kultivierte menschlichen Zellen wachsen in die anhaftende Monolage auf Tellern und Maus Hoden stellt eine Gewebeprobe. Die Methode kann leicht auf andere Arten von frei gewachsene Zellen in Suspension, ve...

Das übergeordnete Ziel der Polysome Profilerstellung Technik ist Analyse der übersetzerischen Tätigkeit der einzelnen mRNAs oder Transkriptom mRNAs während der Proteinsynthese. Die Methode ist für Studien von Protein-Synthese-Verordnung, Übersetzung Aktivierung und Repression in Gesundheit und mehrere menschliche Krankheiten wichtig.

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, die Interaktion einzelner mRNAs mit Polysomen während der Translation zu untersuchen. Polysomen-Profiling ist eine leistungsstarke Technologie zur Untersuchung der mRNA-Interaktion mit Ribosomen und Polysomen. Die Technik ist wichtig für die Untersuchung der Regulation der Proteinsynthese, der Translationsaktivierung und der Repression.Hier stellt unser Team die Techniken zur polysomalen Fraktionierung und Analyse von Fraktionen am Beispiel von drei Organismen vor. Parasit Leishmania major, kultivierte menschliche Zellen und ein tierisches Gewebe. Dieser Ansatz besteht aus vier Hauptschritten: der Lysatvorbereitung, der Saccharosegradientenvorbereitung und der Ultrazentrifugation, der Polysomenfraktionierung und der Probenentnahme.Analyse der Fraktionen. Zellen aus verschiedenen Quellen werden gesammelt, gewaschen und in Lysepuffer lysiert, indem sie durch eine Nadel oder einen Dounce-Homogenisator geleitet werden. Die Zentrifugation wird verwendet, um Zelltrümmer zu entfernen, die das Lysat klären.Ein kontinuierlicher Saccharosegradient wird durch das Mischen von 10%igen und 50%igen Saccharoselösungen in einem Gradientenmacher gebildet

polysome-profiling-in-leishmania-human-cells-and-mouse-testis

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Ein Parasit-Rettungs-und Transformations-Assay mit THP1 Zellen...

A Parasite Rescue and Transformation Assay auf leishmanientötende Screening gegen intrazelluläre<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Menschliche Akute Monozytenleukämie Cell Line

Hier beschreiben wir ein Verfahren, um Veränderungen in der mRNA-Translationsinitiation eukaryontischer Zellen in Reaktion auf Stress-Bedingungen zu untersuchen. Dieses Verfahren basiert auf der Geschwindigkeit Trennung auf Saccharosegradienten übersetzen Ribosomen nicht übersetzen Ribosomen basiert.

Analyse der Translation Initiation Während Stress-Bedingungen durch Polysomprofile Profiling

Die Fähigkeit der Zellen, sich an Stress anzupassen, ist entscheidend für ihr Überleben. Die Regulation der mRNA-Translation ist eine solche Anpassungsstrategie, die eine schnelle Regulation des Proteoms ermöglicht. Hier stellen wir ein standardisiertes Polysomen-Profiling-Protokoll zur Verfügung, um spezifische mRNAs zu identifizieren, die unter Stressbedingungen selektiv translatiert werden.

Bewertung der Selective mRNA Translation in Säugerzellen durch Polysomen Profilieren

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Extraktion und Fraktionierung von Transkripten aus pflanzlichem Gewebe auf der Grundlage der Anzahl der gebundenen Ribosomen. Es ermöglicht eine globale Abschätzung der Translationsaktivität und die Bestimmung des Translationsstatus spezifischer mRNAs.

Eine einfache Methode für Pflanzen Polysomen Profilieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Polysome Profilierung auf das Herz isoliert PERFUNDIERTEN Maus durchführen. Wir beschreiben Methoden für Herz Perfusion, Polysome Profilierung und Analyse der Polysome Fraktionen in Bezug auf mRNAs, MiRNAs und Polysome Proteom.

Dynamische Proteomic und MiRNA Analyse des Polysomes von isolierten Maus Herz nach Langendorff Perfusion

Hier stellen wir ein eCLIP-Protokoll vor, um die wichtigsten RNA-Ziele von RBP-Kandidaten in Hoden zu ermitteln.

Verbesserte Vernetzung der Immunoptierungsmethode (eCLIP) zur effizienten Identifizierung der proteingebundenen RNA in Mäusetestis

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

Dieses Protokoll beschreibt, wie ein Polysomenprofil generiert wird, ohne automatisierte Gradientenerzeuger oder Gradientenfraktionierungssysteme zu verwenden.

Polysomenprofilierung ohne Gradientenerzeuger oder Fraktionierungssysteme

In dieser Arbeit beschreiben wir die Methodik, die zur Generierung von L. panamensis- und L . donovani-Stämmen verwendet wird, die das Gen für eGFP als stabiles integriertes Transgen unter Verwendung des pLEXSY-Systems exprimieren. Transfizierte Parasiten wurden unter Begrenzung der Verdünnung kloniert, und Klone mit der höchsten Fluoreszenzintensität in beiden Spezies wurden für die weitere Verwendung in Wirkstoff-Screening-Assays ausgewählt.

Entwicklung von Leishmania-Speziesstämmen mit konstitutiver Expression von eGFP

In dieser Arbeit präsentieren wir eine longitudinale Auswertung von Goldhamstern, die intraperitoneal (IP) oder intragingival (IG) mit L. infantum-Luc infiziert wurden, mittels biolumineszierender Bildgebung und mittels PCR. Hamster wurden 1 Tag nach der Infektion (1 dpi), 1 Woche nach der Infektion (8 dpi) und 3 Wochen nach der Infektion (22 dpi) untersucht und bei der 50. dpi und 8 Monate nach der Infektion euthanasiert.

Im lebenden Organismus Bildgebung von mit Leishmania infantum infizierten Hamstern durch gingivale Inokulation von axenischen Amastigoten, die Luciferase exprimieren

Lernen Sie die Polysom-Profilerstellung zur Analyse der mRNA-Translation in Leishmania major, menschlichen Zellen und Maus-Hoden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinbiosynthese-Regulationsmechanismen.

Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

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