Polysome Profilerstellung in Leishmaniose, menschliche Zellen und Maus Hoden

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, die Interaktion einzelner mRNAs mit Polysomen während der Translation zu untersuchen. Polysomen-Profiling ist eine leistungsstarke Technologie zur Untersuchung der mRNA-Interaktion mit Ribosomen und Polysomen. Die Technik ist wichtig für die Untersuchung der Regulation der Proteinsynthese, der Translationsaktivierung und der Repression

Hier stellt unser Team die Techniken zur polysomalen Fraktionierung und Analyse von Fraktionen am Beispiel von drei Organismen vor. Parasit Leishmania major, kultivierte menschliche Zellen und ein tierisches Gewebe. Dieser Ansatz besteht aus vier Hauptschritten: der Lysatvorbereitung, der Saccharosegradientenvorbereitung und der Ultrazentrifugation, der Polysomenfraktionierung und der Probenentnahme.

Analyse der Fraktionen. Zellen aus verschiedenen Quellen werden gesammelt, gewaschen und in Lysepuffer lysiert, indem sie durch eine Nadel oder einen Dounce-Homogenisator geleitet werden. Die Zentrifugation wird verwendet, um Zelltrümmer zu entfernen, die das Lysat klären.

Ein kontinuierlicher Saccharosegradient wird durch das Mischen von 10%igen und 50%igen Saccharoselösungen in einem Gradientenmacher gebildet. Lysat wird am oberen Rand des Gradienten geladen. Durch die Ultrazentrifugation werden mrNAs getrennt, die mit einer unterschiedlichen Anzahl von Ribosomen assoziiert sind.

Diese wird während der Fraktionierung von einem UV-Detektor überwacht und bildet unterschiedliche Absorptionsmittelspektren. Zubereitung von Lysat. Je nach Quelle gibt es einige Unterschiede in der Zubereitung des Lysats.

Nach der Lysatvorbereitung sind die Verfahren unabhängig von der Herkunft der Probe identisch. Leishmania major Zytoplasmatisches Lysat Präparat. Platzieren Sie die Leishmania-Hauptzellen in 30 Milliliter Medium mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Milliliter.

Dieser Schritt wird in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Stellen Sie den Kolben mit der Leishmania-Kultur in den Inkubator und züchten Sie die Zellen bei 27 Grad Celsius bis zur logarithmischen Phase. In der Regel dauert es etwa zwei Tage, um zu wachsen.

Die Hauptzellen der Leishmania sind unter dem Mikroskop gut sichtbar. Geben Sie Cycloheximid in die gezüchtete Leishmania-Kultur bis zu einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter, um Ribosomen auf translatierten mRNAs zu stoppen. Legen Sie die Zellen für zehn Minuten bei 27 Grad Celsius zurück in den Inkubator.

Nach Abschluss der Cycloheximid-Behandlung übertragen Sie die Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und schleudern es 8 Minuten lang um 1.800 g. Überstand verwerfen. Waschen Sie die Zellen mit 30 Millilitern pbs und zentrifugieren Sie.

Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter pbs. Nehmen Sie ein Aliquot von Zellen und mischen Sie es mit der Formaldehydlösung. Zählen Sie dann die Zellen mit dem Hämozytometer.

Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in ein Mikrofuge-Röhrchen. Schleudern Sie die Zellen bei 1.800 g für 8 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie dann den Überstand.

Suspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter Lysepuffer, der Proteaseinhibitoren und RNAsin enthält. Führen Sie die Zellen dreimal durch eine 23-Gauge-Nadel. Nach dem Passieren der Nadel wird das Lysat transparent.

Bei 11.200 g zehn Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um das Lysat zu klären. Übertragen Sie das geklärte Lysat in ein frisches Mikrofugenröhrchen und bewahren Sie es bis zur Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation auf Eis auf. Zytoplasmatische Lysatzubereitung aus kultivierten menschlichen Zellen.

Züchten Sie HeLa-Zellen in einer großen Platte im Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2. Geben Sie Cycloheximid zu gezüchteten HeLa-Zellen bis zu einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter, um die Ribosomen auf translatierten mRNAs zu stoppen. Inkubieren Sie die Zellen zehn Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2.

Medium ansaugen und Platte zweimal mit kaltem PBS auf Eis waschen. Geben Sie 500 Mikroliter Lysepuffer auf die Platte und kratzen Sie die Zellen ab. Übertragen Sie die lysierten Zellen in das Mikrofuge-Röhrchen.

Führen Sie die Zellen dreimal durch eine 23-Gauge-Nadel. Bei 11.200 g acht Minuten lang schleudern, um das Lysat zu klären. Bewegen Sie die Röhrchen nach der Zentrifugation auf Eis und übertragen Sie den Überstand auf das neue Röhrchen.

Nehmen Sie ein Aliquot, verdünnen Sie es und messen Sie die Absorption bei 260 Nanometern mit einem Nanotropfen. Wenn es sich um mehrere Proben handelt, stellen Sie die Lysate auf die gleiche optische Dichte ein und halten Sie die Proben bis zur Saccharose-Gradienten-Ultrazentrifugation auf Eis. Zytoplasmatische Lysatzubereitung aus dem Hoden der Maus.

Präpariere den Hoden der Maus. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Tunica albugenia und sammeln Sie die Samenkanälchen des Hodens und übertragen Sie sie in das konische Röhrchen, das fünf Milliliter PBS enthält. Mischen Sie das Taschentuch kräftig an.

Und lassen Sie das Taschentuch fünf Minuten lang auf Eis ruhen. Entfernen Sie den Puffer und waschen Sie ihn noch zwei Mal mit PBS. Übertragen Sie die Samenkanälchen in ein zwei Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie sie eine Minute lang bei 500 g herunter.

Entfernen Sie den Überstand. Geben Sie 500 Mikroliter Lysepuffer in die Tubuli und verwenden Sie eine Pipette, um das Gewebe aufzubrechen. Übertragen Sie die Suspension in einen Homogenisator mit kleinem Volumen.

Brechen Sie das Gewebe mit sieben bis acht Schlägen des Glasstößels auf. Übertragen Sie das Lysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Die Probe wird acht Minuten lang bei 12.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert, um das Lysat zu reinigen.

Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und auf Eis legen. Fahren Sie dann mit der Vorbereitung des Saccharosegradienten fort. Vorbereitung des Saccharosegradienten.

Setzen Sie ein Ultrazentrifugenröhrchen in den Mikroblock ein und ziehen Sie die Linie entlang der oberen Ebene des Blocks. Setze das Rohr dann in ein stabiles Gestell um. Nehmen Sie eine Zehn-Milliliter-Spritze mit aufgesetzter Legevorrichtung und füllen Sie die Spritze mit 10%iger Saccharoselösung.

Lassen Sie es vorsichtig am Boden des Ultrazentrifugenröhrchens los, bis die Saccharoselösung die Markierung erreicht. Füllen Sie eine weitere Spritze mit 50%iger Saccharoselösung und führen Sie die Schichtvorrichtung vorsichtig durch die 10%ige Saccharoseschicht bis zum Boden des Röhrchens ein. Setzen Sie die Saccharoselösung vorsichtig von unten bis zur Markierung auf der Tube frei.

Verschließen Sie dann das Röhrchen mit der mitgelieferten Kappe. Um den Saccharose-Farbverlauf vorzubereiten, schalten Sie das Verlaufsersteller ein. Nivellieren Sie dann die Platte mit den Auf- oder Ab-Tasten und drücken Sie Fertig.

Nach dem Nivellieren der Blechpresse grad. Gehen Sie zur Liste der Gradientenmenüs und wählen Sie den SW41-Rotor aus. Wählen Sie dann den gewünschten Saccharose-Gradienten.

Drücken Sie auf Gebrauch. Platzieren Sie den Rohrhalter mit Magnetbasis auf dem Gradient Maker. Übertragen Sie dann das Rohr in die Halterung.

Es können bis zu sechs Gradienten gleichzeitig vorbereitet werden. Drücken Sie auf Ausführen. Der Gradient Maker dreht die Rohre mit der Programmgeschwindigkeit und den Winkeln und bildet so einen linearen Gradienten.

Es dauert nur wenige Minuten, um den Farbverlauf vorzubereiten. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, legen Sie das Rohr in ein Gestell. Das Volumen, das dem Probenvolumen entspricht, wird von der Oberseite der Ultrazentrifugenröhrchen mit Saccharosegradienten entfernt.

Laden Sie vorsichtig 500 Mikroliter des Lysats darauf. Legen Sie die Rohre in Rotorbecher und balancieren Sie sie aus. Zentrifugieren Sie bei 260.000 g für zwei Stunden bei vier Grad Celsius.

Polysomenfraktionierung und Probenentnahme. Legen Sie die Röhrchen nach der Ultrazentrifugation in die Rotoreimer auf Eis. Schalten Sie den Fraktionssammler und den Fraktionator ein.

Klicken Sie im Menü des Fraktionators auf Scannen. Stellen Sie ein Gestell mit Auffangröhrchen in den Fraktionssammler. Füllen Sie einen Spülbehälter an der Seite des Fraktionators mit entionisiertem Wasser.

Drücken Sie die Spültaste zehn Sekunden lang, um die Pumpe zu spülen. Befestigen Sie für die Kalibrierung einen Spüladapter mit der mit Wasser gefüllten Spritze am Kolben. Öffnen Sie die Fraktionator-Software auf dem Computer.

Drücken Sie auf Kalibrieren. Verwenden Sie die Standardeinstellung und drücken Sie Ok.Be, um Wasser aus der Spritze zu injizieren. Drücken Sie OK, um die Kalibrierung durchzuführen.

Beginnen Sie sofort mit dem Einspritzen von Wasser für die nächsten fünf Sekunden. Das Zeichen Nullkalibrierung abgeschlossen wird angezeigt. Entfernen Sie einen Spüladapter mit der Spritze und befestigen Sie eine Spitze am Kolben des Fraktionators.

Öffnen Sie das Messing-Luftventil und drücken Sie die Lufttaste zehn Sekunden lang, um den Luftschlauch und die Durchflusszelle zu trocknen. Schließen Sie das Luftventil. Nehmen Sie das Gradientenrohr aus dem Rotorbecher und legen Sie es in das Gestell.

Setzen Sie die Kappe des Röhrchenhalters auf die Oberseite des Röhrchens, schieben Sie das Röhrchen vorsichtig in den Röhrchenhalter und verriegeln Sie ihn. Platzieren Sie den Halter unter dem Kolben. Oft können polysomale Banden mit dem Auge gesehen werden.

Geben Sie die gewünschten Einstellungen für Bruchzahlen und Volumen ein. Benennen Sie die Datei und drücken Sie OK, dann gehen Sie zur Schaltfläche Diagramm. Drücken Sie im nächsten Fenster auf Scan starten.

Die Einstellungen werden angezeigt und drücken Sie OK.Der Auffangbehälter bewegt sich von der Rinne zur ersten Fraktion und der Kolben bewegt sich in das Rohr. Wenn der Kolben den oberen Rand des Gefälles erreicht, verlangsamt er sich auf die von Ihnen gewählte Geschwindigkeit und die Fraktionen werden gesammelt. In der Regel sammeln wir 24 Fraktionen zu je 500 Mikrolitern.

Wenn dies abgeschlossen ist, bewegt sich der Kolben aus dem Gradientenrohr heraus. Öffnen Sie das Messing-Luftventil. Drücken Sie die Lufttaste am Fraktionator, um den letzten Bruch abzurufen.

Am Ende des Laufs siehst du das Absorptionsprofil des Gradienten. Analyse der Fraktionen. Die erhaltenen Fraktionen können für die RNA- und Proteinanalyse verwendet werden.

RNA kann durch Elektrophorese gefolgt von Northern Blot analysiert oder für die cDNA-Produktion verwendet werden, gefolgt von einer RT-qPCR-Reaktion, um die Assoziation einzelner mRNAs mit Polysomen zu analysieren. Next Generation Sequencing kann verwendet werden, um den Translationsstatus von mRNAs auf einer Transkriptomskala zu analysieren. Für die Proteinanalyse polysomaler Fraktionen werden Proteine mit Triglurizedinsäure gefällt, um sie zu konzentrieren.

Dann werden die Proteine durch Western Blot oder durch Massenspektrometrie auf Proteomebene analysiert. Befund. Hier präsentieren wir die Ergebnisse der Polysomenfraktionierung und -analyse am Beispiel von drei Organismen. Leishmaniose, kultivierte menschliche Zellen und Mausgewebe.

Die Polysomenfraktionierung wurde verwendet, um die Assoziation von Sherp- und Tubulin-mRNA mit Ribosomen während der Translation und der Leishmania major zu untersuchen. Das Absorptionsdiagramm für die Fraktionierung hat eine deutliche Form mit typischen Peaks für die Ribosomen-Untereinheiten 40S und 60S, die Monosomen 80S und die Polysomen. Die Aliquots der Fraktionen wurden in drei Gruppen zusammengefasst.

Prä-Polysomen, leichte Polysomen und schwere Polysomen. Die relativen mRNA-Spiegel wurden durch eine quantitative Echtzeit-PCR untersucht. Die Daten deuten darauf hin, dass die Tubulin-mRNA aktiv translatiert wird.

Da es meist mit schweren und leichten Polysomen assoziiert war. Während die Translation von Sherp-mRNA weniger aktiv ist. Es wurde meist in Verbindung mit Prä-Polysomen und leichten Polysomen gefunden.

Somit zeigt dieses Experiment deutlich die Fähigkeit der Technik, eine individuelle mRNA-Beteiligung in der Translation zu untersuchen. Diese Abbildung zeigt ein typisches Absorptionsdiagramm der Polysomenfraktionierung der HeLa-Zellen. Die Proteine wurden durch Fällung mit 10%iger Trichloressigsäure konzentriert.

Die kleine Untereinheit ribosomales Protein RPS6 und die große Untereinheit ribosomale Protein RPL11 wurden mittels Western Blot nachgewiesen. Ihre Verteilung korrelierte gut mit den unterschiedlichen Peaks im Absorptionsspektrum. In dieser Abbildung zeigen wir ein Beispiel für den Nachweis ribosomaler RNAs durch Elektrophorese in fraktionierten Polysomen aus dem Hoden der Maus. Schlüsse.

Polysomales Profiling ist eine vielseitige Technik, die verwendet werden kann, um den Translationszustand einzelner mRNAs zu analysieren, Ribosomen-assoziierte Proteine zu untersuchen und die translationale Regulation in verschiedenen Modellorganismen unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen.