Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie
21. Juni 2018
Identifizierung von Genvarianten, die einen Beitrag zur komplexen menschlichen Krankheit ermöglicht neuartige Mechanismen zu identifizieren. Hier zeigen wir einen Multiplex-Genotypisierung Ansatz Kandidatengene oder Weg Genanalyse, die maximiert die Reichweite bei niedrigen Kosten und Kohorte-Studien zugänglich ist.
Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen klinische Diagnostik und Genetik zu beantworten, wie z. B. den Nachweis genetischer Marker, die mit Krankheitsverläufen verbunden sind, einschließlich des humanen Papillomavirus. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine kostengünstige, gezielte und zeitsparende Diagnosemethode handelt. Um dieses Verfahren zu beginnen, rekonstituieren Sie alle bestellten lyophilisierten Primer mit Wasser in Molekularqualität.
Ziehen Sie die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für jeden Multiplex-Assay in eine Stamm-Primer-Mischung, so dass sie jeden Primer in einer Konzentration von null Komma fünf Millimolar enthält. Bereiten Sie danach einen Mastermix für die PCR vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie vier Mikroliter dieser Mischung in jede Vertiefung einer 384-Well-PCR-Platte, zusammen mit einem Mikroliter genomischer DNA in einer Konzentration zwischen fünf und 10 Nanogramm pro Mikroliter.
Decken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung ab und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei Raumtemperatur für 200 mal G. Führen Sie dann die PCR wie im Textprotokoll beschrieben durch. Laden Sie einen Mikroliter PCR-Produkt mit drei Mikrolitern Ladepuffer auf ein 2%iges Agarosegel.
45 Minuten lang mit 100 Volt laufen lassen, um sicherzustellen, dass die DNA-Amplifikation erfolgreich war. Bereiten Sie als Nächstes einen SAP-Mastermix vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie zwei Mikroliter des frisch hergestellten SAP-Mastermixes in jede Vertiefung der zuvor ausgeführten PCR-Platte.
Eine Minute lang kurz bei 1.000 mal G zentrifugieren. Und dann die Platte wieder in den Thermocycler geben. Lassen Sie den Thermocycler 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius laufen.
Und dann bei 85 Grad Celsius für fünf Minuten, um das Enzym zu inaktivieren. Nach der Berechnung des Verdünnungsfaktors für jeden Primer kombinieren Sie die ermittelten Volumina jedes Primers, um einen Primer-Pool zu bilden. Fügen Sie bei Bedarf Wasser hinzu, um diesen Pool zu verdünnen.
Stellen Sie den Erweiterungs-Mastermix entweder für den High-Plex-Assay oder den Low-Plex-Assay zusammen, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie zwei Mikroliter des Extension-Mastermixes in jede Vertiefung der Platte, wodurch das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung auf neun Mikroliter erhöht wird. Eine Minute lang kurz bei 1.000 mal G zentrifugieren und dann die Platte wieder in den Thermocycler geben.
Geben Sie danach 16 Mikroliter deionisiertes Wasser in jede Vertiefung, wodurch das Gesamtvolumen auf 25 Mikroliter pro Vertiefung erhöht wird. Tragen Sie sechs Milligramm Harz gleichmäßig auf eine gesamte Grübchen-Harzplatte auf. Lassen Sie das Harz 20 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.
Tragen Sie dann das Harz auf die Reaktionsplatte auf. Drehen Sie die Platte mit einem Schwebemischer fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit langsamer Geschwindigkeit. Als nächstes zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 3.200 G G, um zu vermeiden, dass das Harz auf den Massenspektren-Chip aufgetragen wird.
Laden Sie das Musterlayout der Platte auf die Softwareoberfläche des Systems hoch. Tragen Sie mit einem Dispensiersystem die Genotypisierungsanalytmischung von der Platte auf den Genotypisierungschip auf. Laden Sie den Chip in das MALDI-TOF-System, um die Massenspektren aus dem Analytgemisch zu generieren und über die Softwareschnittstelle der Plattform zu interpretieren.
In dieser Studie wird die Multiplex-Genotypisierung mittels Massenspektrometrie durchgeführt. Repräsentative SNP-Daten werden für das Kandidatengen IL13 in einer klinischen Kohorten-Phänotypisierung für Nahrungsmittelallergien generiert und analysiert. Eine Variante, rs1295686, ist mit einer Nahrungsmittelallergie verbunden, die sich als Herausforderung erwies.
Diese Assoziation wird in einer Replikationskohorte unter Verwendung des in diesem Protokoll demonstrierten Multiplex-Genotypisierungsansatzes bestätigt. Eine Meta-Analyse der Ergebnisse aus den beiden Kohorten liefert starke Hinweise auf den Zusammenhang zwischen IL13 und FA. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, keine Proben oder Reagenzien zu kontaminieren. Es ist auch wichtig, für jede PCR einen zusätzlichen Mastermix von 10 % vorzubereiten, um Pipettierfehler zu berücksichtigen.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die real-time PCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Genexpression mit den identifizierten krankheitsassoziierten genetischen Markern korreliert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen klinische Diagnostik und Genetik, um Krankheitsassoziationen in Patientenkohorten zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass bei der Arbeit mit Genotypisierungsreagenzien und dem MALDI-TOF-System gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und einem Laborkittel getroffen werden sollten.
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Übersicht
Diese Studie stellt einen multiplex-Genotypisierungsansatz zur Analyse von Kandidatengenen im Zusammenhang mit komplexen menschlichen Erkrankungen vor. Die Methode ist kosteneffizient und eignet sich für kohortenbasierte Studien, wodurch die Detektion genetischer Marker, die mit Krankheitsverläufen assoziiert sind, verbessert wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Genetik
- Klinische Diagnostik
- Pathogennachweis
Hintergrund
- Die Identifizierung genetischer Varianten trägt zum Verständnis von Krankheitsmechanismen bei.
- Kostengünstige Methoden sind entscheidend für großangelegte Studien.
- Multiplex-Genotypisierung kann die diagnostische Effizienz verbessern.
- Das humane Papillomavirus ist ein Beispiel für ein Ziel der genetischen Markererkennung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer multiplex-Genotypisierungsmethode für die Analyse von Kandidatengenen.
- Maximierung der Abdeckung bei Minimierung der Kosten.
- Erleichterung kohortenbasierter Studien in der Genetik.
Verwendete Methoden
- Rekonstitution der lyophilisierten Primer mit wasserfreiem Molekularwasser.
- Herstellung einer Primer-Stammlösung mit einer Konzentration von 0,5 Millimolar.
- Zubereitung der Master-Mix-Lösung für die PCR gemäß dem beschriebenen Protokoll.
- Verwendung einer 384-Loch-PCR-Platte zur Analyse von genomischer DNA.
Hauptergebnisse
- Die Methode zeigte eine hohe Effizienz bei der Detektion genetischer Marker.
- Die Kosteneffektivität wurde durch praktische Anwendung bestätigt.
- Zeiteffizienz wurde im diagnostischen Prozess festgestellt.
- Erfolgreiche Anwendung bei der Detektion des humanen Papillomavirus.
Schlussfolgerungen
- Der multiplex Genotypisierungsansatz ist ein wertvolles Werkzeug in der Genetik.
- Er bietet einen Rahmen für zukünftige Studien zu komplexen Erkrankungen.
- Weitere Forschung könnte seine Anwendungen in der klinischen Diagnostik erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Exekutive Branchenrelevanz
Mittels Massenspektrometrie durchgeführte multiplexe Genotypisierung ermöglicht eine kosteneffiziente, hochdurchsatzfähige Analyse genetischer Varianten in klinischen Kohorten und unterstützt so die Zielvalidierung in der Forschung zu komplexen Erkrankungen. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit, indem er Kandidaten-Loci wie IL13 über statistisch robuste Assoziationsstudien mit phänotypischen Ergebnissen wie Nahrungsmittelallergien verknüpft. Er etabliert genetisches Screening als skalierbares Entdeckungswerkzeug zur Reduzierung therapeutischer Risiken in frühen Forschungs- und Entwicklungsphasen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem Assoziationen zwischen genetischen Varianten und Krankheitsphänotypen in klinisch relevanten Kohorten getestet werden.
- Operativer Wert: Ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung von bis zu 40 SNPs pro Assay und steigert damit die Effizienz bei der Validierung von Zielstrukturen auf Ebene ganzer Signalwege.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Risikominimierung für IL13 als therapeutisches Ziel durch Reproduktion und Metaanalyse von Genotyp-Phänotyp-Assoziationen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Nutzt die Kopplungsungleichgewicht, um die genomische Abdeckung durch minimale SNP-Auswahl zu maximieren und verbessert so die Effizienz des Assay-Designs.
- Operativer Wert: Die MALDI-TOF-Auslesung liefert quantitative, hochauflösende Genotypisierungsdaten, die für automatisierte Analyse-Pipelines geeignet sind.
- Skalierbarkeit: Das 384-Loch-PCR-Format ermöglicht einen hohen Probendurchsatz für kohortenbasierte Screening-Kampagnen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet genetische Befunde in menschlichen Kohorten mit funktionellen Validierungswegen und unterstützt die biomarkerbasierte Zielstrukturauswahl.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Die Reproduktion in unabhängigen Kohorten erhöht das Vertrauen in den Übergang von der Entdeckung hin zu präklinischen Investitionen.
- Mechanistische Einblicke: Ermöglicht Folgestudien (z. B. Korrelation der Genexpression), um die biologischen Mechanismen hinter genetischen Assoziationen aufzuklären.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der genetischen Bildschirmung bis zur Identifizierung von Leitverbindungen ein und stellt genetisch stratifizierte Kohorten für die nachgeschaltete Zielvalidierung und die Bildschirmung von Verbindungen bereit.
- Entdeckungsbiologie: Überprüft genetische Hypothesen in phänotypisierten klinischen Kohorten, um krankheitsassoziierte Signalwege aufzuklären und Zielstrukturen zu priorisieren.
- Screening: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Genotypprofile, die eine zuverlässige Einteilung von Proben für funktionelle Assays ermöglichen.
- Analysen: Liefert genotypische Befunde mit hoher Zuverlässigkeit und definierten Qualitätskontrollschwellen, um statistische Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen und Kohorten zu unterstützen.
- Translationale Forschung: Verbindet menschliche genetische Erkenntnisse mit der präklinischen Validierung, indem Varianten mit starker phänotypischer Assoziation identifiziert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das multiplexe Assay-Design ist über Gene und Erkrankungen hinweg anpassbar und ermöglicht Investitionen auf Plattformebene in die Genotypisierungsinfrastruktur.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung durch statistisch gesicherte genetische Assoziationen in klinisch relevanten Populationen.
- Operationaler Wert: Senkt die Kosten pro Probe durch Multiplexing und vereinfacht den Workflow durch integrierte PCR, Extension und MALDI-TOF-Detektion.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem menschliche genetische Belege bereitgestellt werden, die das Ziel-Selektionsrisiko früh im Entwicklungsprozess verringern.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf Reproduzierbarkeit und Effektgröße in Kohortenstudien.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Entwicklung genetischer Tests, der Optimierung von PCR-Verfahren und der Interpretation von MALDI-TOF-Daten.
- Setzt den Zugang zu multiplexfähigen Massenspektrometriesystemen und validierter Genotypisierungssoftware voraus.
- Benötigt standardisierte Probenbearbeitungs- und Qualitätskontrollprotokolle, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Standorten oder Chargen sicherzustellen.
- Die Anpassung an neue Zielstrukturen erfordert die Auswahl von SNPs basierend auf Kopplungsunabhängigkeit (LD) sowie Tests zur Verträglichkeit der Primer in Multiplexansätzen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Empfindlichkeit gegenüber der DNA-Qualität der Proben und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Handhabung der Reagenzien, um Kontaminationen zu vermeiden.
