Eine In vitro- Modell, die Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamische Therapie auf Staphylococcus Aureus Biofilm zu studieren
16. April 2018
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll, um die antimikrobielle Wirkung von 5-Aminolevulinic Säure-vermittelten die photodynamische Therapie (ALA-PDT) auf Staphylococcus Aureus Biofilm untersuchen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um ein in-Vitro Modell zur Untersuchung der Behandlung von bakteriellen Biofilmen mit PDT in der Zukunft zu entwickeln.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die antimikrobielle Wirkung einer Fünf-Aminolävulinsäure- oder ALA-vermittelten photodynamischen Therapie auf einen Staphylococcus aureus-Biofilm zu untersuchen. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der bakteriellen Biofilme beantworten, wie die photodynamische Zellreparatur als alternative Behandlung zur Kontrolle von Biofilminfektionen eingesetzt werden könnte. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es das Potenzial hat, mit minimaler Anpassung auch für andere Bakterien verwendet zu werden.
Um einen Biofilm in einer 96-Well-Platte zu erzeugen, inokulieren Sie zunächst einen minus 80 Grad Celsius ThOD Staphylococcus aureus USA dreihundert in drei Biofilm-bildenden klinischen Stammkulturen in einzelnen 14-Milliliter-Rundbodenröhrchen, die fünf Milliliter Trypton-Sojabrühe oder TSB-Medium enthalten, in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und schütteln Sie ihn über Nacht. Wenn die Kulturen die stationäre Phase erreicht haben, zentrifugieren Sie die Bakterienzellen und suspendieren die Pellets und PBS wieder auf eine zweimalige 10 bis neunte koloniebildende Einheit pro Milliliter. Verdünnen Sie diese bakteriellen Suspensionen im Verhältnis eins zu 200 und TSB-Medium, ergänzt mit null Komma fünf Prozent Glukose und säen Sie 200 Mikroliter Bakterienzellen pro Vertiefung in drei Vertiefungen pro Stamm pro Versuchsgruppe in einer mit Polystyrol-Zellkultur behandelten 96-Well-Mikroplatte für eine 24-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Sauerstoff. ohne zu schütteln.
Waschen Sie die Vertiefungen am nächsten Tag dreimal vorsichtig mit PBS, ohne die Biofilme zu stören. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter frisch zubereitetes ALA in die entsprechenden Versuchsvertiefungen und stellen Sie die Platte eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius lichtgeschützt auf. Bestrahlen Sie die Platte dann eine Stunde lang mit einer Leuchtdiode mit einer Lichtintensität von 100 Milliwatt pro Quadratzentimeter.
Um die Anzahl der lebensfähigen Bakterien pro Gruppe am Ende der Phototherapie-Behandlung zu zählen, waschen Sie jede Vertiefung vorsichtig dreimal mit PBS, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Kratzen Sie dann mit einer Pipettenspitze die anhaftenden Bakterien vom Boden jeder Vertiefung ab. Ziehen Sie die Zellen aus jeder Gruppe in ein Eppendorf-Röhrchen pro Versuchsbedingung und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Die Pellets werden in einem Milliliter 0,25 Prozent Pankreatinenzym und PBS für eine 90-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius resuspendiert, gefolgt von einer weiteren Zentrifugation. Die Pellets werden in 200 Mikrolitern PBS resuspendiert und eine bis 10 serielle Verdünnungen jeder Gruppe vorgenommen, wobei fünf Mikroliter der seriell verdünnten Probe auf einzelne Trypton-Soja-Agar-Platten gegeben werden. Dann inkubieren Sie die Platten 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und zählen Sie die Anzahl der Bakterienkolonien pro Gruppe.
Zur Beurteilung der Biofilme mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie werden die Biofilme wie gezeigt erzeugt und bestrahlt. Waschen Sie die bestrahlten Biofilme mit PBS und färben Sie die lebenden und toten Zellen mit einem Milliliter eines grün fluoreszierenden Zellmembran-permeablen Farbstoffs für nukleare und prokaryotische Zellmembranen bzw. mit einem Milliliter eines mikromolaren Propidiumiodids. Entfernen Sie nach 20 Minuten den überschüssigen Fleck und bilden Sie die Biofilme durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie unter einer 63-fachen 1,4-NA-Ölimmersionsobjektivlinse ab.
Die Lebensfähigkeit von Biofilmbakterien nimmt nach einer Doppelbehandlung mit ALA-Phototherapie im Vergleich zur Kontrolle mit einer oder einer unbehandelten Biofilmbakterienbehandlung und allen vier getesteten Stämmen ab. Die Visualisierung der Biofilme durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie bestätigt diesen Befund, wobei die meisten Zellen positiv für Propidiumiodid waren, die in der ALA-Phototherapie-Doppelbehandlungsgruppe beobachtet wurden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die gesamte ALA-behandelte Bakterienmanipulation im Dunkeln durchgeführt werden sollte und der Materialbiofilm schonend behandelt werden sollte, um eine Störung des gebildeten Biofilms zu vermeiden.
Diese Botschaft kann von den Forschern auf dem Gebiet der bakteriellen Infektion angewendet werden, um die antimikrobielle Wirkung der photodynamischen Therapie auf den bakteriellen Biofilm in vitro zu untersuchen.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung der antimikrobiellen Wirkung der 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamischen Therapie (ALA-PDT) auf einen Staphylococcus aureus-Biofilm. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich bakterieller Biofilme zu alternativen Behandlungsansätzen zur Kontrolle von Biofilm-Infektionen beantworten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Photodynamische Therapie
- Biofilmforschung
Hintergrund
- Staphylococcus aureus ist ein häufiger Erreger, der mit Biofilminfektionen assoziiert ist.
- Die photodynamische Therapie (PDT) ist eine Behandlungsmethode, die lichtaktivierte Verbindungen zur Abtötung von Bakterien verwendet.
- 5-Aminolävulinsäure (ALA) ist ein Vorläuferstoff bei der Synthese von Photosensibilisatoren, die in der PDT eingesetzt werden.
- Ziel dieser Studie ist die Entwicklung eines In-vitro-Modells zum Testen der ALA-PDT an bakteriellen Biofilmen.
Zweck der Studie
- Beurteilung der antimikrobiellen Wirkung der ALA-vermittelten PDT auf Biofilme von Staphylococcus aureus.
- Untersuchung des Potenzials der PDT als alternative Therapie bei Biofilminfektionen.
- Entwicklung eines Protokolls, das für andere bakterielle Stämme angepasst werden kann.
Verwendete Methoden
- Inokulation von Staphylococcus aureus in Trypton-Soja-Brühe (TSB) zur Biofilmbildung.
- Inkubation der Kulturen bei 37 Grad Celsius, um die stationäre Phase zu erreichen.
- Zentrifugation und Neususpension der Bakterienzellen in PBS.
- Aussaat der Bakterienzellen in eine 96-Well-Mikroplatte für die PDT-Behandlung.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll erzeugt erfolgreich Biofilme, die für die Untersuchung der ALA-PDT geeignet sind.
- Die ALA-PDT zeigte potenzielle antimikrobielle Wirkungen gegen Biofilme von Staphylococcus aureus.
- Die Methode kann mit geringen Anpassungen auf andere bakterielle Stämme übertragen werden.
- Weitere Studien sind erforderlich, um die Behandlungsbedingungen zu optimieren.
Schlussfolgerungen
- Die ALA-PDT ist ein aussichtsreicher Ansatz zur Behandlung bakterieller Biofilme.
- Diese Studie liefert eine Grundlage für zukünftige Forschung in der photodynamischen Therapie.
- Das Verständnis der Wirkmechanismen der PDT kann zu verbesserten Behandlungsstrategien bei biofilmassoziierten Infektionen führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses In-vitro-Modell ermöglicht die mechanistische Bewertung der photodynamischen Therapie (PDT) bei biofilmassoziierten Infektionen, einer zunehmenden Herausforderung in der antimikrobiellen Wirkstoffentwicklung. Durch die Quantifizierung koloniebildender Einheiten und die Visualisierung der Vitalität mittels konfokaler Mikroskopie liefert der Test reproduzierbare, quantitative Ergebnisse, um PDT-Kandidaten frühzeitig in der Entdeckungsphase zu bewerten. Die Plattform unterstützt die Zielvalidierung und die Identifizierung führender Wirkstoffe für Anti-Biofilm-Strategien, insbesondere relevant für Staphylococcus aureus und andere biofilmbildende Pathogene.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft die therapeutische Hypothese zur Wirksamkeit der ALA-PDT gegen S. aureus-Biofilme anhand der Reduktion koloniebildender Einheiten und der Vitalitätsfärbung.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung, indem die Aktivierung des Photosensibilisators mit bakteriziden Mechanismen in einem kontrollierten Biofilmmodell verknüpft wird.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt präklinische Go/No-Go-Entscheidungen, indem dosis- und zeitabhängige antimikrobielle Effekte unter standardisierten Bedingungen nachgewiesen werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt reife, reproduzierbare S. aureus-Biofilme im 96-Well-Format, die für das Hochdurchsatz-Screening von PDT-Wirkstoffen geeignet sind.
- Quantitative Ausgabe: Liefert Koloniebildende-Einheiten-Zählungen (CFU) und Daten der konfokalen Mikroskopie als voneinander unabhängige Messgrößen zur Beurteilung der Wirkstoffpotenz und Biofilmpenetration.
- Plattformnutzung: Durch minimale Anpassungen des Protokolls an andere Bakterienstämme und Photosensibilisatoren anpassbar, wodurch breite Anwendungen im Antiinfektiva-Screening ermöglicht werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Bedeutung für die Krankheit: Modelliert klinisch relevante Biofilminfektionen durch S. aureus und verbindet dabei in vitro-Ergebnisse mit der präklinischen Validierung von PDT-basierten Antiinfektiva.
- Mechanistische Ent风险评估: Klärt den PDT-Wirkmechanismus durch Vitalfärbung (live/dead staining) auf und reduziert damit Unklarheiten bezüglich der Biofilmentfernungspfade.
- Translationale Kontinuität: Unterstützt Entscheidungen zur Weiterentwicklung, indem reproduzierbare Daten zur Biofilmhemmung über mehrere Stämme und experimentelle Wiederholungen hinweg bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test eignet sich für den gesamten Kontinuum der antibakteriellen Wirkstoffentwicklung – von der Zielvalidierung über die Lead-Optimierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung – insbesondere für modalitäten, die auf Biofilme abzielen.
- Entdeckungsbiochemie: Überprüft mechanistische Hypothesen zur PDT-induzierten Biofilmentstörung und zum Verlust der bakteriellen Vitalität in einem physiologisch relevanten Modell.
- Screening: Ermöglicht die standardisierte Bewertung von Photosensibilisatoren und Lichtdosisparametern hinsichtlich ihrer anti-biofilmbildenden Wirkung.
- Analytik: Stellt CFU-Reduktions- und fluoreszenzbasierte Vitalitätsparameter bereit, um Behandlungsbedingungen zu vergleichen und struktur-aktivitätsbezogene Beziehungen abzuleiten.
- Translationale Forschung: Verbindet die in vitro Biofilminhibition mit präklinischen Wirksamkeitsmodellen durch quantifizierbare und reproduzierbare Endpunkte.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine modulare Biofilm-PDT-Plattform, die auf mehrere pathogene Zielstrukturen und Photosensibilisatoren-Chemotypen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Unschärfe bei PDT-Biofilm-Interaktionen durch direkte Visualisierung und Quantifizierung des bakteriellen Abtöteffekts.
- Operationaler Wert: Bietet einen standardisierten, lichtgeschützten Arbeitsablauf mit definierten Inkubations-, Bestrahlungs- und Auslese-Schritten für eine über Laborgruppen hinweg reproduzierbare Durchführung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungssicherheit hinsichtlich der Weiterentwicklung von PDT-Kandidaten, indem frühzeitige Wirksamkeitsdaten in einem klinisch relevanten Biofilmmodell bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von PDT-Programmen, indem Verbindungen identifiziert werden, die nachweislich in Biofilme eindringen und antimikrobielle Aktivität aufweisen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in mikrobiologischen Techniken, Biofilmkultur und photobiologischen Sicherheitsprotokollen.
- Benötigt kontrollierte Lichtexpositionsausrüstung (z. B. LED-Bestrahlungsstärkemessgerät) sowie Fluoreszenzmikroskopie oder Plattenlesegerät für die Auswertung der Koloniebildenden Einheiten (CFU) und bildgebende Verfahren.
- Erfordert die Standardisierung der ALA-Herstellung, Inkubationszeiten und Lichtdosierung über alle Versuchsgruppen hinweg, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Die Übertragung auf andere Bakterienstämme kann eine Optimierung der Biofilmbildungsbedingungen und der Aufnahmeeffizienz des Photosensibilisators erfordern.
- Praktische Einschränkung: Die Empfindlichkeit von Biofilmen kann je nach Wachstumsphase und Matrixzusammensetzung variieren, was sorgfältige Kontrollen für vergleichende Studien notwendig macht.
