Eine In vitro- Modell, die Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-vermittelten photodynamische Therapie auf Staphylococcus Aureus Biofilm zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die antimikrobielle Wirkung einer Fünf-Aminolävulinsäure- oder ALA-vermittelten photodynamischen Therapie auf einen Staphylococcus aureus-Biofilm zu untersuchen. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der bakteriellen Biofilme beantworten, wie die photodynamische Zellreparatur als alternative Behandlung zur Kontrolle von Biofilminfektionen eingesetzt werden könnte. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es das Potenzial hat, mit minimaler Anpassung auch für andere Bakterien verwendet zu werden.

Um einen Biofilm in einer 96-Well-Platte zu erzeugen, inokulieren Sie zunächst einen minus 80 Grad Celsius ThOD Staphylococcus aureus USA dreihundert in drei Biofilm-bildenden klinischen Stammkulturen in einzelnen 14-Milliliter-Rundbodenröhrchen, die fünf Milliliter Trypton-Sojabrühe oder TSB-Medium enthalten, in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und schütteln Sie ihn über Nacht. Wenn die Kulturen die stationäre Phase erreicht haben, zentrifugieren Sie die Bakterienzellen und suspendieren die Pellets und PBS wieder auf eine zweimalige 10 bis neunte koloniebildende Einheit pro Milliliter. Verdünnen Sie diese bakteriellen Suspensionen im Verhältnis eins zu 200 und TSB-Medium, ergänzt mit null Komma fünf Prozent Glukose und säen Sie 200 Mikroliter Bakterienzellen pro Vertiefung in drei Vertiefungen pro Stamm pro Versuchsgruppe in einer mit Polystyrol-Zellkultur behandelten 96-Well-Mikroplatte für eine 24-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Sauerstoff. ohne zu schütteln.

Waschen Sie die Vertiefungen am nächsten Tag dreimal vorsichtig mit PBS, ohne die Biofilme zu stören. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter frisch zubereitetes ALA in die entsprechenden Versuchsvertiefungen und stellen Sie die Platte eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius lichtgeschützt auf. Bestrahlen Sie die Platte dann eine Stunde lang mit einer Leuchtdiode mit einer Lichtintensität von 100 Milliwatt pro Quadratzentimeter.

Um die Anzahl der lebensfähigen Bakterien pro Gruppe am Ende der Phototherapie-Behandlung zu zählen, waschen Sie jede Vertiefung vorsichtig dreimal mit PBS, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Kratzen Sie dann mit einer Pipettenspitze die anhaftenden Bakterien vom Boden jeder Vertiefung ab. Ziehen Sie die Zellen aus jeder Gruppe in ein Eppendorf-Röhrchen pro Versuchsbedingung und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Die Pellets werden in einem Milliliter 0,25 Prozent Pankreatinenzym und PBS für eine 90-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius resuspendiert, gefolgt von einer weiteren Zentrifugation. Die Pellets werden in 200 Mikrolitern PBS resuspendiert und eine bis 10 serielle Verdünnungen jeder Gruppe vorgenommen, wobei fünf Mikroliter der seriell verdünnten Probe auf einzelne Trypton-Soja-Agar-Platten gegeben werden. Dann inkubieren Sie die Platten 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und zählen Sie die Anzahl der Bakterienkolonien pro Gruppe.

Zur Beurteilung der Biofilme mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie werden die Biofilme wie gezeigt erzeugt und bestrahlt. Waschen Sie die bestrahlten Biofilme mit PBS und färben Sie die lebenden und toten Zellen mit einem Milliliter eines grün fluoreszierenden Zellmembran-permeablen Farbstoffs für nukleare und prokaryotische Zellmembranen bzw. mit einem Milliliter eines mikromolaren Propidiumiodids. Entfernen Sie nach 20 Minuten den überschüssigen Fleck und bilden Sie die Biofilme durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie unter einer 63-fachen 1,4-NA-Ölimmersionsobjektivlinse ab.

Die Lebensfähigkeit von Biofilmbakterien nimmt nach einer Doppelbehandlung mit ALA-Phototherapie im Vergleich zur Kontrolle mit einer oder einer unbehandelten Biofilmbakterienbehandlung und allen vier getesteten Stämmen ab. Die Visualisierung der Biofilme durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie bestätigt diesen Befund, wobei die meisten Zellen positiv für Propidiumiodid waren, die in der ALA-Phototherapie-Doppelbehandlungsgruppe beobachtet wurden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die gesamte ALA-behandelte Bakterienmanipulation im Dunkeln durchgeführt werden sollte und der Materialbiofilm schonend behandelt werden sollte, um eine Störung des gebildeten Biofilms zu vermeiden.

Diese Botschaft kann von den Forschern auf dem Gebiet der bakteriellen Infektion angewendet werden, um die antimikrobielle Wirkung der photodynamischen Therapie auf den bakteriellen Biofilm in vitro zu untersuchen.