Name: Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Erfahren Sie die transkriptomische Analyse von Bacillus mycoides bei Exposition gegenüber Kartoffelwurzelausscheidungen. Diese Methode identifiziert bakterielle Gene für Pflanze-Mikroben-Interaktionen.

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Wir danken Jakob Viel für seine hilfreichen Kommentare und Vorschläge. Wir danken auch Anne de Jong für seine Hilfe bei der Analyse der Bioinformatik. Yanglei Yi und Zhibo Li werden von der China Scholarship Council (CSC) unterstützt. Wir bedanken uns bei NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) für ihre finanzielle Unterstützung auf OPK.

(1) keimenden Kartoffel unter sterilen Bedingungen
<ol><li>Spülen Sie die Kartoffel-Oberfläche mit sterilem Wasser. Baden Sie die Kartoffel in 70 % igem Ethanol und dann in 3 % Natriumhypochlorit für 5 min. Spülen Sie ihn wieder mit sterilem Wasser, alle übrigen Natriumhypochlorit zu entfernen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Materialien für das Keimen und wachsen Kartoffelknollen benötigt; die Kunststoff-Töpfe, Engraftment Körbe, Vermiculit, sterilisieren und wässern durch Autoklavieren bei 121 ° C für 20 Minuten. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle verwendeten Materialien autoklavierbar sind. Andernfalls verwenden Sie andere Sterilisation Methoden.</li>
	<li>Setzen Sie die Oberfläche sterilisiert Kartoffel in den Engraftment Korb, und platzieren Sie diese in einem Autoklaven Pot mit nassen Vermiculit.</li>
	<li>Halten Sie den Topf in einer Klimakammer bei 24 ° C für drei Wochen. Setzen Sie ihn auf Zyklen von 16 h Licht (120 µmol m-2s-1) und 8 Stunden der Dunkelheit. Um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie ein großes Glasfaser Feld um den Pot zu decken.</li>
</ol>2. Sammeln von Kartoffel Wurzelausscheidungen
<ol><li>Wenn die Triebe sprießen, Transfer der Korb mit die ganze Kartoffel in einen sterilen Becher mit 150 mL autoklaviert deionisiertes Wasser gefüllt, mit der Kartoffel Knollen platziert oberhalb der Wasseroberfläche und die Wurzeln in das Wasser getaucht (siehe Abbildung 1). Halten Sie den Keimling in der Klimakammer, und verwenden Sie dieselben Einstellungen wie zuvor [24 ° C; Zyklen von 16 h Licht (120 µmol m-2s-1), 8 h der Finsternis].</li>
	<li>Ab dem zweiten Tag auf sammeln Sie das Wasser mit den Ausscheidungen und Nachfüllen Sie den Becher mit sterilem deionisiertes Wasser. Führen Sie die Probenahme jeden Tag bis zum siebten Tag nach der Übertragung des Keimlings.</li>
	<li>Jede Probe separat bei 4 ° c Lagern Für jede Probe verteilt 100 µL auf ein Luria-Bertani (LB; 1 % Tryptone, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl) nährbodenplatte für mikrobielle Kontaminationen zu überprüfen. Entsorgen Sie die kontaminierten Proben.</li>
	<li>Kombinieren Sie die gesammelten Proben von einem Sämling, und durch Gefriertrocknung sie bei-40 ° C zu einem Endvolumen von 150 mL zu konzentrieren.</li>
</ol>(3) wachsenden Bakterien
<ol><li>Streifen Sie eine B. Mycoides Belastung aus einem-80 ° C Glycerin bestand auf eine LB-Agar-Platte, und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C über Nacht.</li>
	<li>Impfen Sie eine LB-Flüssigmedium mit eine einzige Kolonie von der Platte zu, und wachsen Sie die Kultur in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min über Nacht bei 30 ° C.</li>
</ol>4. Behandlung und Beprobung von Bakterien
<ol><li>Um die Wachstumskurve der Bakterien mit Wurzelausscheidungen behandelt, um eine Negativkontrolle zu vergleichen, bereiten Sie eine Reihe von Flaschen mit 50 mL LB-Flüssigmedium. Alle Flaschen 0,5 mL die Übernachtung Bakterienkultur hinzu, und fügen Sie 0 %, 5 %, 10 % oder 15 % (V/V) Wurzel Exsudat oder sterilen deionisiertes Wasser bzw. auf das Medium.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Kultur mit entionisiertem Wasser anstelle von Wurzelausscheidungen als Kontrolle. Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) jeweils 1 h danach. Generieren einer Wachstumskurs von Plotten die OD600 Werte im Vergleich zur Zeit. Hinweis: Wir haben gesehen, dass 10 % der die Wurzelausscheidungen keinen Einfluss auf das Wachstum von B. Mycoides (siehe Abbildung 2). Dieses Verhältnis wurde für RNA-Seq Experimente verwendet.</li>
	<li>Verdünnen Sie eine Übernachtung B. Mycoides -Kultur mit 90 mL vorgewärmten LB-Medium auf die anfängliche OD600 von ~ 0,05 in eine 300 mL Flasche. Die Kultur 10 mL Wurzelausscheidungen hinzu und bei 30 ° C für 1 h inkubieren.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 10 mL sterilem deionisiertes Wasserbehandlung als Kontrolle. Sammeln Sie Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation bei 9.000 x g für 2 min bei 4 ° C. Den überstand verwerfen und sofort das Pellet in flüssigem Stickstoff eingefroren, dann bis zur Verwendung bei-80 ° C lagern.</li>
</ol>(5) RNA-Isolation
Hinweis: Bevor Sie beginnen die Isolation, bereiten Sie die Werkbank, Racks und Pipetten mit einer RNase Dekontaminationslösung reinigt (siehe Tabelle der Materialien). Tragen Sie Handschuhe bei aller Zeiten, und sicherstellen, dass alle Rohre, Tipps und Lösungen sind RNase-freie. Halten Sie die Proben auf Eis wenn möglich.
<ol><li>Reinstwasser (100 µL DEPC pro 100 mL Lösung) 0,1 % (V/V) von Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC) hinzufügen, gut vermischen und über Nacht bei Zimmertemperatur aufbewahren. Autoklaven die Mischung, die DEPC nach Behandlung über Nacht zu inaktivieren. Diese DEPC-behandeltem Reinstwasser zur Vorbereitung der TE-Puffer verwenden [10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA] und einer 10 % igen SDS (w/V) Lösung.</li>
	<li>Die Zelle-Pellets auf dem Eis Auftauen und jeweils in 400 µL TE (DEPC) Puffer auszusetzen. Übertragen Sie die Suspensionen in 2 mL Schraubverschluss Rohre.</li>
	<li>Premix 300 µL Chloroform Isoamyl Alkohol (24:1 V/V) und 300 µL Phenol (saure Phenol, RNA-Klasse), und die Mischung für 5 min stehen lassen. Nehmen Sie 500 µL der oberen organischen Phase die resuspendierte Zellen hinzu. Dann fügen Sie 50 µL 10 % SDS und 0,5 g Glasperlen (0,5 µm) in die Röhre.</li>
	<li>Schließen Sie den Deckel fest und legen Sie das Rohr in eine Rührwerksmühle Homogenisator (siehe Tabelle der Materialien). Führen Sie eine 3 × 45 s Puls Homogenisierung mit einem Intervall von 1 min auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben für 10 min bei 11.000 x g (4 ° C) und übertragen Sie die obere Phase auf einen neuen Schlauch.</li>
	<li>Die obere Phase ab Schritt 5.5 500 µL Chloroform Isoamyl Alkohol (24:1) hinzu und Zentrifugieren Sie die Mischung für 5 min bei 11.000 x g (4 ° C). Hinweis: Die folgenden Schritte wurden geändert von Anweisungen des Herstellers eine kommerzielle Glasfaser filterbasierte RNA Isolation kit (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Übertragen Sie 500 µL der oberen Phase auf einem frischen Rohr, fügen Sie 2 Bände (1 mL) eines Puffers Lyse/Bindung hinzu und mischen Sie es durch pipettieren rauf und runter.</li>
	<li>Kombinieren Sie die Filter und Sammlung Röhrchen (aus dem RNA-Isolierung-Kit) und pipette die Mischung aus Schritt 5.7 mit dem Filter-Rohr. Zentrifugieren Sie die Rohre für 15 s bei 8.000 x g und entsorgen der durchströmten.</li>
	<li>Bereiten Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 µL DNase Puffer, 10 µL der DNase I und 5 µL RNase-Inhibitor (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie die fertige Lösung mischen auf dem Filter der Filter-Röhre, und 20-30 Minuten bei 15-25 ° c inkubieren</li>
	<li>Der Wasch-Schritte nach Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 50 µL eines Puffers Elution, um die RNA zu eluieren.</li>
	<li>Speichern der eluierten RNS bei-80 ° C und einen Kunststoff Paraffin Film um ihn herum. Zum gleichen Zeitpunkt übertragen Sie wenige Mikroliter der Probe zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch einen Qualitäts-Check durchführen.</li>
</ol>(6) RNA-Qualitäts-Check und Sequenzierung
<ol><li>Überprüfen Sie die RNA mit einem Microvolume Spektrophotometer. Hinweis: Extinktion Verhältnisse bei 260/280 sollte über 1,8 und Kennzahlen auf 260/230 sollte über mindestens 1,8, vorzugsweise über 2.0.</li>
	<li>Lauf die gereinigte RNA in automatisierte Elektrophorese Instrument mit der empfehlen-RNA-Analyse kit (siehe Tabelle der Materialien); die RNA-Integrität-Anzahl (RIN) muss mindestens über 7 um fortzufahren.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Gesamtbetrag von 3 µg RNA pro Probe, um Bibliotheken mit einer RNA-Seq-Bibliothek-Vorbereitung zu generieren kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Empfehlungen des Herstellers. Hinweis: Die Bibliothek Vorbereitungen wurden auf einer Plattform von Hochdurchsatz-Sequenzierung sequenziert und gepaart Ende liest generiert wurden.</li>
</ol>(7) Datenanalyse mit Hilfe den Web-basierten Pipeline T-REx
<ol><li>Führen Sie eine Qualität Filterung mit dem FASTX-Toolkit Version 0.0.13 (Phred Qualitätsfaktoren von > 20). Schneiden Sie die rohen RNA-Seq liest aus dem Adapter-Sequenzen mit dem Trimmomatic-Werkzeug. Hinweis: Die nachfolgenden Analysen beruhten auf saubere Daten mit hoher Qualität.</li>
	<li>Laden Sie die B. Mycoides ATCC 6462 NCBI-Genom-Datenbank (NCBI Beitritt Nr.: CP009692.1) und verwenden Sie es als eine Referenz-Genom für die Zuordnung der sauberen liest mit Bowtie2/2.2.3.</li>
	<li>Verwendung HTSeq v0.6.1 liest Zahlen zählen, jedes Gen zugeordnet und die Lesevorgänge pro Kilobase Abschrift pro million zugeordneten liest (RPKM) jedes Gens basierend auf der Länge der Anzahl der Gene und liest dieses Gen zugeordnet.</li>
	<li>Für die Analyse der Daten von der T-REx-Pipeline, verwenden Sie die RPKM-Tabelle als Eingabe sowie drei beschreibenden Dateien: (i) eine Datei Faktoren zu beschreiben, das Experiment in Faktoren, (Ii) eine Kontraste-Datei zu definieren, welche Faktoren für differenzielle Genexpression verglichen werden , und (Iii) eine Klassendatei um Gruppen von Genen von Interesse zu beschreiben. Hinweis: Die beschreibenden Dateien sind in.txt Format. Beispiele finden Sie auf der Webseite von T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Eine detaillierte Anleitung für die Datenanalyse mit T-REx finden Sie in einer früheren Publikation von de Jong Et al. 14.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Pflanze-Mikroben-Interaktionen haben vermutet, um durch ein fein abgestimmtes Gleichgewicht zwischen Bakterien und Pflanzen bestimmt werden. Solche Interaktionen sind sehr komplex und schwierig zu studieren in ein natürliches System, umfasst verschiedene Mikrobenarten, potenziell als Konsortien. Dieses Whitepaper beschreibt ein vereinfachtes Protokoll, um die bakterielle Reaktion auf Wurzelausscheidungen unter kontrollierten Bedingungen zu studieren. Das Transkriptom-Profil des standarddüngung, bei Kontakt mit Wurzelauss...

Pflanzen können Exsudat bis zu 20 % des Kohlenstoffs in der Rhizosphäre1, d. h., die schmale Zone des Bodens in der Nähe der Wurzeln während der Photosynthese durch Wurzeln fixiert. Durch die höhere nährstoffverfügbarkeit ist die Rhizosphäre einen geeigneten Lebensraum für verschiedene Mikroorganismen, einschließlich der Förderung des Pflanzenwachstums Bakterien. Die Wurzelausscheidungen enthalten eine Reihe von anorganischen Verbindungen wie Ionen, anorganische Säuren, Sauerstoff und Wasser. Jedoch wird der Großteil der Wurzelausscheidungen von organischen Materialien, gebildet, in niedermolekulare Verbindungen und hochmolekularen Verbindungen unterteilt werden kann. Die niedermolekularen Verbindungen enthalten Aminosäuren, organische Säuren, Zucker, Phenolverbindungen, Fettsäuren und eine Reihe von sekundären Pflanzenstoffen. Die hochmolekularen Verbindungen bestehen aus Schleim und Proteine,2,3. Rhizosphäre Mikroorganismen können einige dieser Verbindungen als Energiequelle für Wachstum und Entwicklung. Die Wurzelausscheidungen spielen eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Wurzelbakterien Gemeinschaft, da die Pflanze produziert Verbindungen in die Exsudate durch Einwirkung auf die Expression bestimmter Gene das Verhalten der Rhizosphäre-assoziierte Bakterien beeinflussen können.
Verständnis der bakteriellen Antwort auf Wurzelausscheidungen ist ein wichtiger Schritt bei der Entschlüsselung wechselwirkungsmechanismen Pflanze-Mikroben. Da die bakterielle Reaktion auf Pflanze-Mikroben-Interaktionen das Produkt der differentiellen Genexpression, kann es durch die Transkriptom-Analyse untersucht werden. Mit dieser Methode, identifiziert frühere Studien mehrere wichtige Gene in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen. In Pseudomonas Aeruginosawurden Gene, die im Stoffwechsel, Chemotaxis und Typ II-Sekretion zur Beantwortung von Zuckerrüben Wurzel Exsudate4gezeigt. Ventilator Et Al. 5 studierte die transkriptomischen Profilierung der B. Amyloliquefaciens FZB42 als Reaktion auf Mais Wurzelausscheidungen. Ihre Ergebnisse zeigen, dass die Gene, die stark durch die Wurzelausscheidungen induziert, Stoffwechselwege in Bezug auf Nährstoff Auslastung, Chemotaxis, Motilität und nicht-ribosomale Synthese von antimikrobiellen Peptiden und Polyketides mehrere Gruppen beteiligt sind.
Die Genauigkeit dieser Studien stützt sich auf die Sammlung von Wurzelausscheidungen. Obwohl mehrere Methoden der Sammlung von Wurzelausscheidungen für verschiedene Zwecke beschrieben haben, entweder verlangen ausgeklügelte Instrumente oder sind nicht in kontrollierten Bedingungen6,7,8durchgeführt. Darüber hinaus können Hemmung der Rhizosphäre Mikroorganismen Wurzel Exsudat Zusammensetzung beeinflussen, indem Pflanze Zellmembran Durchlässigkeit beeinträchtigen und schädigen die Wurzel Gewebe, insbesondere im Falle von Konsortien von Mikroorganismen9. Bei der Untersuchung der mikrobiellen auf Wurzelausscheidungen ist es wichtig, genau definierte Bedingungen zu verwenden, um Veränderung der Verbindungen durch andere Mikroorganismen10zu vermeiden. Darüber hinaus ist qualitativ hochwertige RNA erforderlich für RNA-Seq Transkriptom-Studien. Jedoch haben beim Umgang mit nicht-Modell-bakterielle Belastungen, die standard-Protokolle oder kommerziellen Kits in der Regel eine geringe Effizienz durch unbekannte Faktoren oder spezielle Wachstumseigenschaften.
Das hier beschriebene Protokoll wurde mit B. Mycoides, das ist ein grampositives, Spore bildet Bakterium Firmicute Phylum überprüft. Es ist allgegenwärtig in der Rhizosphäre der verschiedenen Pflanzenarten. Für diese Spezies, einschließlich Induktion des systematischen Widerstandes (ISR) in Zuckerrüben11, Hemmung der Dämpfung-off-Erregers Pythium Gurke12sowie Stickstoff wurden mehrere Pflanze Förderung Wachstumseigenschaften gemeldet. Fixierung in der Sonnenblume Rhizosphäre13. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Interaktion mit einer Wirtspflanze nicht gut untersucht.
Das Ziel der hier vorgestellten Experimente ist es, die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert B. Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Kurzum, das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: zunächst sammeln Kartoffeln Wurzelausscheidungen unter sterilen Bedingungen. Ziehen Sie dann, qualitativ hochwertige RNA aus Bakterienzellen mit Wurzelausscheidungen behandelt. Der letzte Schritt ist die Analyse der Daten mithilfe der webbasierten T-REx Pipeline14. Dieses Protokoll wurde verwendet, um B. Mycoides Gene zu identifizieren, die zeigen eine Verschiebung im Ausdruck Niveaus beim Kontakt mit Wurzelausscheidungen und damit möglicherweise eine wichtige Rolle in Pflanze-Mikroben-Interaktionen.

<table><tbody><tr><td>Natriumhypochlorit</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; CAS: 7681-52-9&nbsp;</td><td>10-15%&nbsp; aktives Chlor</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td> Bouillon-Inkubator <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Genesys 20</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff-Glasperlen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0,5 &micro; m</td></tr><tr><td>2,0 ml Röhrchen mit Schraubverschluss</td><td></td><td></td><td>RNasefrei</td></tr><tr><td>1,5 ml und 2,0 ml Eppendorf Röhrchen</td><td></td><td></td><td>RNase frei</td></tr><tr><td>Kugelmühlen-Homogenisator</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td>Mini_beadbeater</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonat (DEPC)</td><td>sigma</td><td>CAS: 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>sigma</td><td>CAS: 151-21-3&nbsp;</td><td>10%ige Lösung, hergestellt mit DEPC-behandeltem MQ-Wasser</td></tr><tr><td>TE-Puffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td></td><td>RNA-Qualität</td></tr><tr><td>Chloroform-Isoamylalkohol</td><td></td><td></td><td>24:1 Chloroform:Isoamylalkohol herstellen, bei Raumtemperatur lagern</td></tr><tr><td>Isolationskit für hochreine RNA</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>RNase Dekontaminationslösung</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNase-Zap</td></tr><tr><td>Automatisiertes Elektrophoresegerät</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Bioanalysator</td></tr><tr><td>Mikrovolumen-Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Qualitätsanalyse-Kit</td><td>Agilent</td><td>RNA 6000 Nano-Kit&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RiboLock</td><td></td></tr><tr><td>Gerichtete RNA-Bibliothek Vorbereitungskit</td><td>NEB</td><td>Ultra</td><td>für Illumina</td></tr></tbody></table>

pflanze-mikroben-interaktion: transcriptional antwort des bacillus mycoides auf kartoffel wurzelausscheidungen

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Pflanze-assoziierte Bakterien spielen eine wichtige Rolle bei der Förderung von Wachstum und Verhütung von Krankheiten bei Pflanzen. Die Anwendung der Pflanze wachstumsfördernde standarddüngung (PGPR) als biodüngemittel oder Biocontrol Mittel geworden eine effektive Alternative zu der Verwendung von herkömmlichen Düngemitteln und Ernte-Produktivität bei geringen Kosten zu erhöhen. Pflanze-Mikroben-Interaktionen abhängig Host Pflanze abgesondert Signale und eine Reaktion hereon durch ihre assoziierten Bakterien. Die molekularen Mechanismen der wie nützlichen Bakterien reagieren jedoch auf die damit verbundenen pflanzliche, dass Signale nicht vollständig verstanden sind. Beurteilung der transkriptomischen auf der Bakterien Wurzelausscheidungen ist ein leistungsfähiger Ansatz um die bakterielle Genexpression und Verordnung unter rhizospheric Bedingungen zu bestimmen. Solches Wissen ist notwendig, die zugrunde liegenden Mechanismen Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu verstehen. Dieses Whitepaper beschreibt ein detailliertes Protokoll um die transkriptomischen Antwort von B. Mycoides EC18, ein Stamm von der Kartoffel Endosphere, Kartoffel Wurzelausscheidungen isoliert zu studieren. Mit Hilfe der jüngsten Hochdurchsatz-Sequenzierung-Technologie kann dieses Protokoll in mehreren Wochen und produzieren massive Datasets durchgeführt werden. Zunächst sammeln wir die Wurzelausscheidungen unter sterilen Bedingungen, nach denen sie B. Mycoides Kulturen hinzugefügt werden. Die RNA aus diesen Kulturen ist isoliert mit einem Phenol/Chloroform-Methode kombiniert mit einem kommerziellen Kit und durch automatisierte Elektrophorese Instrument einer Qualitätskontrolle unterzogen. Nach der Sequenzierung, Datenanalyse erfolgt mit der Web-basierten T-REx-Pipeline und eine Gruppe von differentiell exprimierten Genen identifiziert. Diese Methode ist ein nützliches Werkzeug, um neue Entdeckungen auf die bakterielle Gene in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu ermöglichen.

Pflanze-assoziierten Mikroorganismen können Wachstum und die Gesundheit positiv beeinflussen. Allerdings sind die Mechanismen die komplexen Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und ihre mikrobiellen Symbionten nicht vollständig geklärt. Wurzelausscheidungen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Wurzelbakterien Aktivität und Verhalten, und es wird in der Regel postuliert, dass die mikrobielle Besiedlung der Wurzeln mit dem Reiz der Mikroben zu Wurzelausscheidungen initiiert. Da...

Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls soll die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Diese Methode erleichtert die Identifizierung von wichtigen bakteriellen Gene Pflanze-Mikroben-Interaktionen beteiligt und gilt grundsätzlich für andere Endophyten und Pflanzen, mit geringfügigen Anpassungen.

Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Pflanzen-Mikroben-Interaktion zu beantworten. Sie können zum Beispiel wichtige Gene aus Bakterienstämmen identifizieren, die während der Interaktion der Bakterien mit der Pflanze aus der Endosphäre oder Rhizosphäre isoliert wurden. Es ist eine vielseitige Methode, die auch für Studien an anderen Bakterien mit Pflanzen verwendet werden kann.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass in relativ kurzer Zeit eine große Anzahl von Bakteriengenen identifiziert werden kann, die bei Pflanzen-Mikroben-Interaktionen wichtig sind. Um diesen Vorgang zu starten, spülen Sie die Kartoffeloberfläche mit sterilem Wasser ab. Baden Sie die Kartoffel fünf Minuten lang in 70 % Ethanol und anschließend weitere fünf Minuten in 3 % Natriumhypochlorit.Spülen Sie es anschließend erneut mit sterilem Wasser aus, um verbleibende Natriumhypochlorit zu entfernen. Bereiten Sie als Nächstes die Materialien vor, die für das Keimen und den Anbau von Kartoffelknollen benötigt werden. Sterilisieren Sie die Plastiktöpfe, Transplantationskörbe, Vermiculit und Wasser, indem Sie sie 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius autoklavieren.Legen Sie anschließend die oberflächensterilisierte Kartoffel in den Transplantationskorb und legen Sie sie in einen autoklavierten Topf mit nassem Vermiculit. Verwenden Sie eine große Glasfaserbox, um den Topf abzudecken, um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden. Bewahren Sie den Topf drei Wochen lang in einer Klimakammer bei 24 Grad Celsius auf und stellen Sie ihn auf Zyklen von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit.Um die Ausscheidungen der Kartoffelwurzel aufzufangen, wird der Korb mit der ganzen Kartoffel in ein sterilisiertes Becherglas gegeben, das mit 150 Millilitern autoklaviertem deionisiertem Wasser gefüllt ist, wobei die Kartoffelknollen knapp über der Wasseroberfläche platziert werden und die Wurzeln in das Wasser getaucht werden. Bewahren Sie den Sämling in der Klimakammer auf und verwenden Sie die gleichen Einstellungen wie zuvor. Ab dem zweiten Tag das Wasser mit den Exsudaten auffangen und das Becherglas wieder mit sterilem, entionisiertem Wasser füllen.Lagern Sie dann jede Probe separat bei vier Grad Celsius. Für jede Probe werden 100 Mikroliter auf eine Luria-Bertani-Agarplatte verteilt, um sie auf mikrobielle Kontaminationen zu überprüfen. Entsorgen Sie die kontaminierten Proben.Kombinieren Sie die gesammelten Proben eines Sämlings. Anschließend werden die kombinierten Wurzelexsudate in 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Frieren Sie die Röhrchen mit den Wurzelexsudat bei minus 80 Grad Celsius ein.Konzentrieren Sie sie, indem Sie sie bei minus 40 Grad Celsius auf ein Endvolumen von 150 Millilitern gefriertrocknen. Um die Bakterien zu züchten, streift man einen B.mycoides-Stamm aus einem minus 80 Grad Celsius heißen Glycerinstamm auf eine LB-Agarplatte und inkubiert die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius. Beimpfen Sie dann das flüssige LB-Medium mit einer einzigen Kolonie von der Platte und züchten Sie die Kultur in einem Schüttelbrutkasten bei 200 U/min über Nacht bei 30 Grad Celsius.Zur Behandlung und Probenahme der Bakterien wird eine über Nacht mit 90 Millilitern vorgewärmtem LB-Medium in einem 300-Milliliter-Kolben auf die anfängliche OD600 von null Komma fünf verdünnt. Geben Sie anschließend 10 Milliliter Wurzelexsudat in die Kultur und verwenden Sie eine 10 Milliliter sterile, deionisierte Wasseraufbereitung als Kontrolle. Dann inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius.Nach einer Stunde die Kultur in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Sammeln Sie die Zellen aus der Kultur, indem Sie zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 9.000 Mal G zentrifugieren. Entsorgen Sie anschließend den Überstand und frieren Sie das Pellet sofort in flüssigem Stickstoff ein.Anschließend bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um RNA zu isolieren, tauen Sie die Zellpellets auf Eis auf und suspendieren Sie jedes von ihnen in 400 Mikrolitern TE-Puffer. Übertragen Sie dann die Suspensionen in die zwei Milliliter Schraubverschlussröhrchen.Geben Sie null Komma fünf Gramm Glasperlen in die Tube. Verschließen Sie dann die Verschlüsse fest und legen Sie die Röhrchen in einen Kugelmühlen-Homogenisator. Führen Sie dreimal eine 45-sekündige Pulshomogenisierung durch, mit einem einminütigen Intervall auf Eis.Zentrifugieren Sie anschließend die Proben 10 Minuten lang bei 11.000 Mal G und übertragen Sie die obere Phase jeder Probe in ein neues Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter Chloroform:Isoamylalkohol in die obere Phase und zentrifugieren Sie das Gemisch fünf Minuten lang bei 11.000 mal G. Dann geben Sie 500 Mikroliter der oberen Phase in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie einen Milliliter des Lysebindungspuffers hinzu und mischen Sie ihn, indem Sie ihn auf und ab pipettieren.Bereiten Sie als Nächstes Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern DNase-Puffer, 10 Mikrolitern DNase I und fünf Mikrolitern eines RNase-Inhibitors vor. Geben Sie die vorbereitete Lösungsmischung auf den Filter der Filterrohre und inkubieren Sie sie 20 bis 30 Minuten lang bei 15 bis 25 Grad Celsius. Führen Sie anschließend die Waschschritte gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und geben Sie 50 Mikroliter eines Elusionspuffers in das Rohr.Nach der Zentrifugation eluieren Sie die RNA. Übertragen Sie einige Mikroliter der Probe in ein Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um eine Qualitätsprüfung durchzuführen. Zum Schluss bedecken Sie die entgangene RNA mit einer Paraffinfolie aus Kunststoff und halten sie bei minus 80 Grad Celsius.Nach der Entnahme wurden die Wurzelexsudate in einem Verhältnis von 10 % in die B.mycoides-Kultur gegeben, und die bakterielle Gesamt-RNA wurde isoliert. Anschließend wurde die RNA einer Qualitätskontrolle durch ein automatisiertes Elektrophorese-Instrument unterzogen. Diese Diagramme stellen die RNA dar, die aus B.mycoides isoliert wurde, die mit den Wurzelexsudaten behandelt wurden, und diese Diagramme stellen die RNA dar, die aus der Kontrollgruppe isoliert wurde.Alle Proben erreichten einen RIN-Wert von über neun, mit zwei klaren Banden, die den 16S- und 23S-RNA-Untereinheiten entsprachen, was zeigt, dass mit diesem Protokoll qualitativ hochwertige RNA erhalten wurde. Nach der Vorbereitung der Bibliothek wurden Pair-End-Reads mit einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform erhalten. Die rohen RNA-seq-Reads wurden aus den Adaptersequenzen getrimmt und mit der Referenzgenomsequenz abgeglichen.Die Transkript-Home-Analyse wurde mit der T-REx-Pipeline durchgeführt, und das Intensitätsdiagramm aller differentiell exprimierten Gene ist hier dargestellt. Nachdem das potenziell wichtige Gen identifiziert wurde, können weitere in vivo Methoden wie Promotor-GFP-Fusion, Cue-Pews-Air und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Zeit in der reservierten Expression bestimmter Gene während der Interaktion mit der Wirtspflanze zu beantworten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Yi, Y., et al. Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transkriptionelle Reaktion von Bacillus mycoides auf Kartoffelwurzelexsudate. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Vorbereitung und Behandlung von Bacillus mycoides-Kulturen zur Untersuchung von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen. Er beschreibt die Schritte vom Streifen einer Stammkultur und deren Inkubation in flüssigem Medium bis hin zur Exposition der Bakterien gegenüber Pflanzenwurzelausscheidungen unter Rühren. Der Prozess gipfelt in...

Behandlung von Bakterien mit Ausscheidungen aus Pflanzenwurzeln zur Emulation von In-vitro-Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben

Agroinfiltration und PVX-Agroinfektion sind routinemäßige funktionelle Assays für die transiente ektopische Expression von Genen in Pflanzen. Diese Methoden sind effiziente Assays in Effektoromik-Strategien (schnelle Resistenz und Avirulenz-Gen-Entdeckung) und entscheidend für die moderne Forschung in der molekularen Pflanzenpathologie. Sie erfüllen die Nachfrage nach robuster Hochdurchsatz-Funktionsanalyse in Anlagen.

Agroinfiltration und PVX Agroinfektion in Kartoffel und Nicotiana benthamiana

Das beschriebene hydroponische Kokultivierungssystem unterstützt intakte Pflanzen mit Metallgittersieb und kokultiviert sie mit Bakterien. Pflanzengewebe, Bakterien und sezernierte Moleküle können dann separat für nachgeschaltete Analysen geerntet werden, wobei gleichzeitig die molekularen Reaktionen sowohl der Pflanzenwirte als auch der interagierenden Mikroben oder Mikrobiome untersucht werden können.

Ein Hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse von Pflanzen- / Mikroben-Molecular-Wechselwirkungen und Signalgebung

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle, Kartoffelpflanzen zu verwandeln. Die Agrobacterium Tumefaciens Transformation führt zu einer kompletten transgenen Pflanze Agrobacterium Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln in einem Wildtyp-Shooting produziert, die selbst propagiert werden kann. Wir erkennen dann Promotoraktivität von GUS Färbung in den transformierten Wurzeln.

Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Die vorgestellte Methode schafft natürliches Pflanzenfresser schädigendes Pflanzengewebe durch die Anwendung von Manduca sexta Larven auf abgetrennte Blätter von Kartoffeln. Das Pflanzengewebe wird auf die Expression von sechs Transkriptionsfaktor-Homologen geprüft, die an frühen Reaktionen auf Insektenkraut beteiligt sind.

Freistehende Leaf Assays zur Vereinfachung der Genexpressionsstudien in Kartoffeln während des Befalls durch Kauen Voninsekt Manduca sexta

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für das auf Kartoffelvirus X (PVX) basierende microRNA-Silencing-System (VbMS) zur funktionellen Charakterisierung endogener microRNAs (miRNAs) in Kartoffeln. Target Mimic (TM) Moleküle von miRNA von Interesse werden in den PVX-Vektor integriert und vorübergehend in Kartoffeln exprimiert, um die Ziel-miRNA oder miRNA-Familie zum Schweigen zu bringen.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) in Kartoffeln.

Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Zusammenfassung der Strategien zur Beimpfung von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroben. Am Beispiel der Pilze Verticillium longisporum und Verticillium dahliae werden drei verschiedene Wurzelinfektionssysteme beschrieben. Mögliche Anwendungen und mögliche nachgelagerte Analysen werden aufgezeigt und Vor- oder Nachteile für jedes System diskutiert.

Impfungsstrategien zur Infektion von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen

Aufgrund der Opazität des Bodens können Wechselwirkungen zwischen seinen konstituierenden Mikroben nicht leicht mit zellulärer Auflösung sichtbar gemacht werden. Hier werden zwei mikrofluidische Werkzeuge vorgestellt, die neue Möglichkeiten bieten, pilzlich-mikrobielle Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Geräte sind vielseitig und einfach zu bedienen und ermöglichen eine hohe räumlich-zeitliche Kontrolle und hochauflösende Bildgebung auf zellulärer Ebene.

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Wir stellen ein Protokoll für ein glasbasiertes, semihydroponisches Versuchssystem vor, das das Wachstum einer Vielzahl von phylogenetisch unterschiedlichen Pflanzen mit oder ohne Mikroben unterstützt. Das System ist mit verschiedenen Nährmedien kompatibel und ermöglicht eine zerstörungsfreie Wurzelexsudatprobenahme für die nachgelagerte Analyse.

Ein vielseitiges Glasgefäßsystem für die semihydroponische Profilierung von Wurzelexsudat

Das Protokoll beschreibt die Infektion der Wurzeln von Solanum tuberosum mit pflanzenparasitären Nematoden unter in vivo Gewächshausbedingungen und von in vitro transgenen Wurzeln von Kartoffeln für die histochemische Analyse der Wurzelstruktur durch optische Mikroskopie.

In vivo und in vitro Infektion von Kartoffelwurzeln mit pflanzenparasitären Nematoden zur Beurteilung induzierter Strukturveränderungen

Erfahren Sie die transkriptomische Analyse von Bacillus mycoides bei Exposition gegenüber Kartoffelwurzelausscheidungen. Diese Methode identifiziert bakterielle Gene für Pflanze-Mikroben-Interaktionen.

Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen

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