Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Pflanzen-Mikroben-Interaktion zu beantworten. Sie können zum Beispiel wichtige Gene aus Bakterienstämmen identifizieren, die während der Interaktion der Bakterien mit der Pflanze aus der Endosphäre oder Rhizosphäre isoliert wurden. Es ist eine vielseitige Methode, die auch für Studien an anderen Bakterien mit Pflanzen verwendet werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass in relativ kurzer Zeit eine große Anzahl von Bakteriengenen identifiziert werden kann, die bei Pflanzen-Mikroben-Interaktionen wichtig sind. Um diesen Vorgang zu starten, spülen Sie die Kartoffeloberfläche mit sterilem Wasser ab. Baden Sie die Kartoffel fünf Minuten lang in 70 % Ethanol und anschließend weitere fünf Minuten in 3 % Natriumhypochlorit.

Spülen Sie es anschließend erneut mit sterilem Wasser aus, um verbleibende Natriumhypochlorit zu entfernen. Bereiten Sie als Nächstes die Materialien vor, die für das Keimen und den Anbau von Kartoffelknollen benötigt werden. Sterilisieren Sie die Plastiktöpfe, Transplantationskörbe, Vermiculit und Wasser, indem Sie sie 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius autoklavieren.

Legen Sie anschließend die oberflächensterilisierte Kartoffel in den Transplantationskorb und legen Sie sie in einen autoklavierten Topf mit nassem Vermiculit. Verwenden Sie eine große Glasfaserbox, um den Topf abzudecken, um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden. Bewahren Sie den Topf drei Wochen lang in einer Klimakammer bei 24 Grad Celsius auf und stellen Sie ihn auf Zyklen von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit.

Um die Ausscheidungen der Kartoffelwurzel aufzufangen, wird der Korb mit der ganzen Kartoffel in ein sterilisiertes Becherglas gegeben, das mit 150 Millilitern autoklaviertem deionisiertem Wasser gefüllt ist, wobei die Kartoffelknollen knapp über der Wasseroberfläche platziert werden und die Wurzeln in das Wasser getaucht werden. Bewahren Sie den Sämling in der Klimakammer auf und verwenden Sie die gleichen Einstellungen wie zuvor. Ab dem zweiten Tag das Wasser mit den Exsudaten auffangen und das Becherglas wieder mit sterilem, entionisiertem Wasser füllen.

Lagern Sie dann jede Probe separat bei vier Grad Celsius. Für jede Probe werden 100 Mikroliter auf eine Luria-Bertani-Agarplatte verteilt, um sie auf mikrobielle Kontaminationen zu überprüfen. Entsorgen Sie die kontaminierten Proben.

Kombinieren Sie die gesammelten Proben eines Sämlings. Anschließend werden die kombinierten Wurzelexsudate in 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Frieren Sie die Röhrchen mit den Wurzelexsudat bei minus 80 Grad Celsius ein.

Konzentrieren Sie sie, indem Sie sie bei minus 40 Grad Celsius auf ein Endvolumen von 150 Millilitern gefriertrocknen. Um die Bakterien zu züchten, streift man einen B.mycoides-Stamm aus einem minus 80 Grad Celsius heißen Glycerinstamm auf eine LB-Agarplatte und inkubiert die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius. Beimpfen Sie dann das flüssige LB-Medium mit einer einzigen Kolonie von der Platte und züchten Sie die Kultur in einem Schüttelbrutkasten bei 200 U/min über Nacht bei 30 Grad Celsius.

Zur Behandlung und Probenahme der Bakterien wird eine über Nacht mit 90 Millilitern vorgewärmtem LB-Medium in einem 300-Milliliter-Kolben auf die anfängliche OD600 von null Komma fünf verdünnt. Geben Sie anschließend 10 Milliliter Wurzelexsudat in die Kultur und verwenden Sie eine 10 Milliliter sterile, deionisierte Wasseraufbereitung als Kontrolle. Dann inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius.

Nach einer Stunde die Kultur in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Sammeln Sie die Zellen aus der Kultur, indem Sie zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 9.000 Mal G zentrifugieren. Entsorgen Sie anschließend den Überstand und frieren Sie das Pellet sofort in flüssigem Stickstoff ein.

Anschließend bis zur Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um RNA zu isolieren, tauen Sie die Zellpellets auf Eis auf und suspendieren Sie jedes von ihnen in 400 Mikrolitern TE-Puffer. Übertragen Sie dann die Suspensionen in die zwei Milliliter Schraubverschlussröhrchen.

Geben Sie null Komma fünf Gramm Glasperlen in die Tube. Verschließen Sie dann die Verschlüsse fest und legen Sie die Röhrchen in einen Kugelmühlen-Homogenisator. Führen Sie dreimal eine 45-sekündige Pulshomogenisierung durch, mit einem einminütigen Intervall auf Eis.

Zentrifugieren Sie anschließend die Proben 10 Minuten lang bei 11.000 Mal G und übertragen Sie die obere Phase jeder Probe in ein neues Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter Chloroform:Isoamylalkohol in die obere Phase und zentrifugieren Sie das Gemisch fünf Minuten lang bei 11.000 mal G. Dann geben Sie 500 Mikroliter der oberen Phase in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie einen Milliliter des Lysebindungspuffers hinzu und mischen Sie ihn, indem Sie ihn auf und ab pipettieren.

Bereiten Sie als Nächstes Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern DNase-Puffer, 10 Mikrolitern DNase I und fünf Mikrolitern eines RNase-Inhibitors vor. Geben Sie die vorbereitete Lösungsmischung auf den Filter der Filterrohre und inkubieren Sie sie 20 bis 30 Minuten lang bei 15 bis 25 Grad Celsius. Führen Sie anschließend die Waschschritte gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und geben Sie 50 Mikroliter eines Elusionspuffers in das Rohr

Nach der Zentrifugation eluieren Sie die RNA. Übertragen Sie einige Mikroliter der Probe in ein Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um eine Qualitätsprüfung durchzuführen. Zum Schluss bedecken Sie die entgangene RNA mit einer Paraffinfolie aus Kunststoff und halten sie bei minus 80 Grad Celsius.

Nach der Entnahme wurden die Wurzelexsudate in einem Verhältnis von 10 % in die B.mycoides-Kultur gegeben, und die bakterielle Gesamt-RNA wurde isoliert. Anschließend wurde die RNA einer Qualitätskontrolle durch ein automatisiertes Elektrophorese-Instrument unterzogen. Diese Diagramme stellen die RNA dar, die aus B.mycoides isoliert wurde, die mit den Wurzelexsudaten behandelt wurden, und diese Diagramme stellen die RNA dar, die aus der Kontrollgruppe isoliert wurde.

Alle Proben erreichten einen RIN-Wert von über neun, mit zwei klaren Banden, die den 16S- und 23S-RNA-Untereinheiten entsprachen, was zeigt, dass mit diesem Protokoll qualitativ hochwertige RNA erhalten wurde. Nach der Vorbereitung der Bibliothek wurden Pair-End-Reads mit einer Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattform erhalten. Die rohen RNA-seq-Reads wurden aus den Adaptersequenzen getrimmt und mit der Referenzgenomsequenz abgeglichen.

Die Transkript-Home-Analyse wurde mit der T-REx-Pipeline durchgeführt, und das Intensitätsdiagramm aller differentiell exprimierten Gene ist hier dargestellt. Nachdem das potenziell wichtige Gen identifiziert wurde, können weitere in vivo Methoden wie Promotor-GFP-Fusion, Cue-Pews-Air und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Zeit in der reservierten Expression bestimmter Gene während der Interaktion mit der Wirtspflanze zu beantworten.