Name: Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Lernen Sie die lentivirale Injektion in den perivitellinen Raum zur effizienten Erzeugung transgener Mäuse. Diese Methode ermöglicht schnelles in vivo Screening von Transgen-Effekten mit über 70% Erfolgsrate bei Neugeborenen.

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Wir danken Magali Dumont und Rolando Meloni für kritische Lektüre des Manuskripts und iVector und Phenoparc ICM Kerne für technische Unterstützung bei Lentivirale Vektor Produktion und Tier bzw. Gehäuse. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Institut Hospitalo Universitaire de Neurowissenschaften Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.r. erhielt die Mittel für die Association de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) und eine gemeinsame JDRF / INSERM gewähren.

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<li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+mice+carrying+human+cytokine+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li>
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<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse%2C+rat%2C+rabbit%2C+and+pig+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li>
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<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
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<li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).</li>
<li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741(2010).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
<li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD%2Fscid+background%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li>
<li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li>
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<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+generation+of+high-titer%2C+pantropic+retroviral+vectors%3A+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li>
<li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li>
<li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li>
<li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413(2010).</li>
<li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV%29+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+%28i-PITT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274(2015).</li>
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<li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li>
<li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li>
<li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.

Die Perivitelline Injektion von Lentivirale Vektoren in befruchteten Eizellen, die hier beschriebenen führte zu die Herstellung von transgenen Embryonen, die mehr als 70 % der transgenen Embryonen bezogen auf die Gesamtzahl der gesammelten Embryonen ergab. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Berichten und beispielhaft für die Besonderheit des Verfahrens2,7,10,11,<sup class...

Die Pionierarbeit von Gordon Et Al. 1980 zeigte, dass die Plasmid DNA-Injektion in die männliche Vorkerne von befruchteten Eizellen nach der Implantation bei pseudopregnant Mäusen die Erzeugung transgener Tiere hervorbringen kann, die integriert die Plasmid DNA-1. Die Demonstration, dass transgene Säugetiere generiert werden können hatte einen enormen Einfluss auf global Life-Sciences, öffnet den Weg zu neuen Feldern der Forschung sowohl für Grundlagenwissenschaften und Translationale Biomedizin. In den vergangenen vier Jahrzehnten ist DNA Mikroinjektion Routinepraxis geworden. Obwohl eine enorme Anzahl von transgenen Mäuse hergestellt wurden, die standard-Methode ist nicht voll einsatzfähig für alle Maus-Stämmen und erfordert zeitaufwendig Rückkreuzungen2,3. Seine Anwendung auf andere Arten bleibt herausfordernd4 und der Gesamtertrag der Transgen-Integration beschränkt sich auf wenige Prozentsatz der geborenen Tiere5. Darüber hinaus stellt die Wirksamkeit der Transgen-Integration den limitierenden Faktor, der die Armen Gesamtausbeute von man DNA-Injektion erklärt. In dieser Hinsicht integrative virale Vektoren sind die effizientesten Tools zum Fracht und transgene zu integrieren und so könnten neue Mittel, um deutlich erhöhen Integration Ausbeute, die einzige Einschränkung ist, dass die Transgen-Größe, die6 10 kb nicht überschreiten darf .
Mit dem Briefumschlag-Protein von vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) Pseudo-typisierte Lentivirale Vektoren sind pantropic und hoch integrative gen-Transfer-Tools und können verwendet werden, um die befruchteten Eizellen7transduzieren. Die Zona Pellucida rund um die Eizellen ist eine natürliche Virus Barrier und damit Transduktion mit Lentivirale Vektoren können übergeben werden muss. Transgene Tiere wurden durch 3D-Steuerung befruchtete Eizellen nach dem Mikro-Bohren oder Entfernen der Zona Pellucida8,9generiert. Injektion unter die Zona Pellucida in den Perivitelline Raum scheint jedoch die einfachste Methode, um die befruchteten Eier wie anfangs beschrieben von Lois und Kollegen7transduzieren.
Die Perivitelline Injektion von Lentivirale Vektoren kann hohe Erträge bei der Herstellung transgener Tiere, die mehr als 70 % der geborenen Tiere sind. Dieser Ertrag ist mehr als 10-fach höher als die beste Ausbeute, die mit standard Vorkerne DNA Injektion7,10,11erreicht werden kann. In diesem Zusammenhang wird eine Einzelsitzung der Injektionen mindestens 50 transgenen Gründer (F0) generieren. Die große Zahl der Gründer ist daher kompatibel mit Phänotypisierung des Effekts Transgens direkt auf F0 Mäuse ohne die Notwendigkeit zu erzeugen transgene Mauslinien durchgeführt. Dieser Vorteil ermöglicht schnelle Screening des Effekts Transgens und ist speziell auf in Vivo -Gewinn und Verlust der Funktionsstudien innerhalb von Wochen durchführen. Darüber hinaus können regulatorische DNA-Elemente auch rasch untersucht werden, um Karte Enhancer und DNA-Motive, die durch Transkription Faktoren11,12gebunden. Transgene Integration mit man Injektionen in der Regel als mehrere Kopien in einen einzigartigen Ort. Mit Lentivirale Vektoren kommt Integration in mehrere Loci als eine einzelne Kopie pro Locus10,13. Daher ist die Vielzahl der integrierten Loci am ehesten, die sehr hohe Expression Penetranz beobachtet in transgenen Gründer, wodurch das neue generierte Modell robuster zugeordnet.
Wichtig ist, wenn man Injektion von DNA, ist Visualisierung der Vorkerne während des Verfahrens zwingend notwendig. Diese technische Einschränkung verhindert die Verwendung von befruchteten Eizellen, die aus einer Vielzahl von Maus-Stämmen. Daher die Produktion eines transgenen Modells in einem bestimmten Stamm für die Vorkerne sind unsichtbar die Produktion von Tieren in einem freizügigen Stamm erfordert, gefolgt von mindestens 10 aufeinander folgenden Rückkreuzungen das Transgen in der gewünschten Maus übertragen Zuchtlinie Mit der Lentivirale Vektor-Injektionen Perivitelline Raum ist immer sichtbar und die Injektion erfordert keine hochspezifische Fähigkeiten. Als Beispiel wurden NOD/SCID transgenen Mäusen, die nicht geeignet für die Vorkerne Injektion sind mit dem viralen Vektoren Injektionen14gewonnen.
Hier ist ein umfassendes Protokoll präsentiert, um einfache Herstellung von transgenen Mäusen mit Lentivirale Vektor-Injektionen in den Perivitelline Raum des Embryos Bühne einer Zelle zu ermöglichen. Transgene Ausdruck gesteuert entweder mit allgegenwärtigen oder Zelle spezifische Promotoren wird ausführlich beschrieben.
PTrip ΔU3 Lentivirale Rückgrat wurde in dieser Studie15verwendet. Dieser Vektor kann für die Herstellung von Replikation defekt Lentivirale Vektoren in denen U3-Sequenz teilweise gelöscht wurde zum Entfernen U3 promotoraktivität und generieren eine Self inactivating Vektor (SIN)16. Lentivirale Vektor Bestände wurden durch Transiente Transfektion von Zellen der HEK-293T mit dem p8.91 Kapselung Plasmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G, Codierung die vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) Glykoprotein-G17und pTRIP ΔU3 produziert. rekombinanten Vektor. Die produktionsfeinplanung Verfahren wird als ergänzende Methoden bereitgestellt.
Produktion von hohen Titer Lentivirale Vektor Aktien erfolgt unter Biosafety Level II Bedingungen (BSL-2). Dies gilt auch für die meisten transgene außer Onkogene, die in BSL-3 hergestellt werden. Daher ist die Produktion in BSL-2 Bedingungen in den meisten Fällen ausreichend. Darüber hinaus werden der Einsatz und die Produktion in der Regel für die meisten nationalen Regulierungsbehörden Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen (GVO) getrennt. Begrenzte Mengen an Replikation inkompetent SIN Lentivirale Vektoren (unter 2 µg Protein p24 Kapsid) können unter BSL-1 Bedingungen wie die französischen GVO-Agentur in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Europäischen Union beschrieben verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>Dutsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 Wells Nunc Schale</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>IVF-Schale</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Enzym 30mg</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>getesteter Mausembryo Insulin</td></tr><tr><td>serynge</td><td>VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Schere</td><td>Moria</td><td>MC26</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator-Schlauchbaugruppen für kalibrierte Mikrokapillarpipetten</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Kapillaren aus Borosilikatglas</td><td>Harvard-Gerät</td><td>GC 100-10</td><td></td></tr><tr><td>Horizontaler Mikropipettenabzieher</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>Hoffman-Modulationskontrastbeleuchtung ist erforderlich</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram air</td><td></td></tr><tr><td>Steuerer der Haltepipette</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Mausembryo getestet</td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>Kann zur Injektion von DNA oder viralen Vektoren verwendet werden</td></tr><tr><td>Dumont # 5 Pinzette</td><td>Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>vannas Mikroschere</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Centravet</td><td></td><td>ISO005</td><td>ISO-VET 100% 250ml</td></tr><tr><td>OCRYGEL-Centravet</td><td></td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>Povidon-Iodure-Centravet</td><td></td><td>VET001</td><td>Vetedin 120ml</td></tr><tr><td>Buprenorphin-Centravet</td><td></td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Trizma-Hydrochlorid</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>Pulver</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>oneTaq-Kit</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streifen mit 8 PCR-Röhrchen</td><td>4titude</td><td>4ti-0781</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Veriti</td></tr><tr><td>Genomic DNA Mini-Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Mastermix</td><td>Roche</td><td>4887352001</td><td>SYBR Grün&nbsp;</td></tr><tr><td>Multiwell-Platte 384</td><td>Roche</td><td>5217555001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR-Gerät 384 Wells</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

lentivirale vermittelte produktion von transgenen mäusen: eine einfache und hocheffiziente methode für die direkte untersuchung der gründer

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Seit fast 40 Jahren stellt man DNA-Injektion der standard Methode zur Erzeugung transgener Mäuse mit zufälligen Integration der Transgene. Solch ein Routineverfahren ist weit verbreitet in der ganzen Welt genutzt und seine wichtigste Einschränkung befindet sich in der schlechten Wirksamkeit von Transgen-Integration, was zu einer geringen Ausbeute von Gründer Tiere. Nur wenige Prozent der Tiere geboren nach der Implantation der befruchteten Eizellen injiziert haben das Transgen integriert. Im Gegensatz dazu Lentivirale Vektoren sind leistungsfähige Werkzeuge für integrative Gentransfer und deren Einsatz zur befruchtete Eizellen transduzieren ermöglicht hocheffiziente Produktion des Gründers transgener Mäuse mit einem Durchschnittsertrag über 70 %. Darüber hinaus jede Maus Belastung kann verwendet werden, um Transgene Tiere zu erzeugen und die Penetranz des Transgens Ausdruck ist extrem hoch, über 80 % mit Lentivirale vermittelten Transgenese im Vergleich zu DNA-Mikroinjektion. Die Größe des DNA-Fragments, die Ladung durch den Lentivirale Vektor sein können beschränkt sich auf 10 kb und die große Einschränkung dieser Methode darstellt. Mit einer einfachen und leicht durchzuführen Injektion unter die Zona Pellucida der befruchteten Eizellen, sind mehr als 50 Gründer Tiere in einer einzigen Sitzung der Mikroinjektion herstellbar. Diese Methode eignet sich sehr direkt in Gründer Tiere, schnellen Gewinn und Verlust von Funktionsstudien oder Bildschirm genomische DNA-Regionen für ihre Fähigkeit zur Kontrolle und Regulierung Gen Ausdruck in Vivodurchführen.

Transgene Tiere wurden mit dem hier vorgestellten Protokoll generiert. Vertreter führt beide allgegenwärtig und Zelle Art spezifische Transgene Ausdruck dargestellt.
Konstitutive Expression von transgenen
Allgegenwärtige Promotoren sind Grundlagenforschung Werkzeuge transgene in eine nachhaltige und effiziente Weise zum Ausdruck zu bringen. Diese Promo...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Förderung der Transgen-Integration und Herstellung von Gründer Transgene Mäuse mit hoher Wirksamkeit durch eine einfache Injektion eines Lentivirale Vektors in den Perivitelline Raum einer befruchteten Eizelle.

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Diese Methode ermöglicht ein schnelles In-vivo-Screening bei Mäusen, der Wirkung eines Transgens, und ist speziell für die Durchführung von Funktionsbeobachtungen sowie einer Antwort- und DNA-Motivkartierung geeignet. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Vorhersageverwendung von transgenen Tieren über 70 % der Neugeborenen liegt und auf alle Mausstämme, einschließlich transgener Tiere, angewendet werden kann. Nach der Einschläferne der Mäuse, sammeln Sie die Eileiter.Um die Operation zu beginnen, verwenden Sie eine Schere, um einen großen horizontalen Schnitt in die Bauchhöhle zu machen. Suchen Sie dann das Eileiterzwischenband zwischen der Gebärmutter und dem Eierstock. Als nächstes verwenden Sie gekrümmte Zangen, um das Mesometrium und die Membran mit den prominenten Blutgefäßen zu entfernen.Trennen Sie dann das Eileitervom Eierstock und sezieren Sie das Eileitervom Eierstock. Dann ziehen Sie auf dem Eileiter und schneiden Sie von der Gebärmutter. Übertragen Sie alle gesammelten Eileiter bei Raumtemperatur auf M2-Medium.Achten Sie beim Umgang mit den Eileitern darauf, die geschwollene Ampulla, die mit befruchteten Eiern beladen ist, nicht zu berühren. Als nächstes fügen Sie einen 100-Mikroliter-Tropfen Hyaluronidase-Arbeitslösung zu einer 10-Zentimeter-Schale hinzu. Dann die beiden Eileiter hineinübertragen, um die Cumuluszellen aus den Eiern zu entfernen.Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop ein Paar Insulinspritzen, um das Eileiterzuführen zu sichern, während Sie die Ampulla aufreißen und die befruchteten Eier dispergieren. Verwenden Sie dann eine vorbereitete Glaspipette mit Schläuchen und ein Mundstück, um alle Eier zu aspirieren. Mit diesem Werkzeug, übertragen Sie sie zwischen sechs Tropfen M2 Medium, um die umgebenden Cumuluszellen abzuwaschen.Dann die gewaschenen Eier in einen 10 Millimeter Brunnen geben, in einer vier Brunnenplatte, gefüllt mit vorgeheizt mit M16. Dann übertragen Sie die Schale in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator. In Vorbereitung zentrifugieren Sie die vorbereitete lentivirale Vektorsuspension bei 160 g für zwei Minuten, um die oft in lentiviralen Vorräten vorhandenen Trümmer zu pellet.In einem Sicherheitsschrank der Klasse 2, übertragen Sie die Überräube auf ein neues 0,5 Milliliter Rohr. Als nächstes einen Mikroliter Überstand in eine Injektionspipette laden. Befestigen Sie dann die Injektionspipette an der rechten Seite Mikromanipulator.Und befestigen Sie die Haltepipette am linken Mikromanipulator. Geben Sie nun acht Mikroliter M2-Medium in der Mitte der Depressionsrutsche ab. Und mit leichtem Parafinöl abdecken, um Verdunstung zu vermeiden.Dann legen Sie 20 Eier in die flachen Stellen in den Tropfen, ohne Blasen zu erzeugen. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass die Spitze der Injektionspipette geöffnet ist. Wenn nicht, tippen Sie auf die Injektionspipette mit der Haltepipette, um sie zu öffnen.Stellen Sie dann den Mikroinjektor für 20 Sekunden Injektionen ein. Nun, mit der Haltepipette und manuellen Druck aspirieren sie ein befruchtetes Ei, das zwei Vorkerne und zwei polare Körper enthält. Dann, mit der InjektionPipette injizieren Sie die Perivitelline Raum des Eis.Berühren Sie die Plasmamembran nicht. Stellen Sie den Druck so ein, dass der Perivitelline-Raum mit Lösung gefüllt ist. Der Druck sollte 600 Hekto-Pascal nicht überschreiten.Unmittelbar nach der Injektion der 20 Eier, übertragen Sie die Charge in ein Bad von vorgewärmten M16 Medium. Und brüten Sie sie für mindestens 30 Minuten, bevor Sie sie implantieren. 16 Stunden nach der Paarung normaler Weibchen mit Männchen mit Vasektomien, überprüfen Sie auf KopulationSstecker.Verwenden Sie diese Weibchen für die Implantation. Als nächstes machen Implantationspipetten mit einem Innendurchmesser von ca. 150 Mikrometern. Und mit flammenpolierten Spitzen, die etwa vier bis fünf Millimeter lang sind.Laden Sie eine Pipette mit embryogeprüftem, leichtem Parafinöl bis knapp über dem Schulterpunkt. Dann eine kleine Luftblase ansaugen und die Pipette weiter mit M2-Medium beladen. Als nächstes, aspirieren Sie eine zweite Luftblase.Nun, ziehen Sie die Embryonen in die Pipette hintereinander, minimieren Sie das Volumen des Mediums zwischen den Embryonen. Beenden Sie, indem Sie einen sehr kleinen Tropfen Parafinöl nur einen Embryo breit ansatogen. Die Vorbereitung der Reimplantationspipette ist der Schlüssel und erfordert viel Übung.Die Eier in der Pipette müssen praktisch mit keinem Medium dazwischen ausgerichtet werden. Als nächstes, nach der Anästhesisierung der Maus und Bestätigung der Anästhesie mit einer Zehenprise Shave aus zwei, zwei Zentimeter Streifen Haar entlang des Rückenmarks auf der Ebene der letzten Rippe. Legen Sie nun die Maus auf ein Heizkissen auf ein steriles Feld und drapieren Sie sie, so dass ein Fenster der freiliegenden Haut bleibt.Als nächstes, desinitieren Sie die exponierte Haut mit abwechselnden Peelings von Iodoprovidon und 70 Prozent Ethanol. Für die Implantation zuerst einen einen Zentimeter Querschnitt machen und dann die Haut seitlich schieben, bis der orangefarbene Eierstock durch die Körperwand sichtbar ist. Als nächstes einen Fünf-Millimeter-Schnitt mit der feinen Schere machen und das Fettpolster mit einer atraumatischen Bulldoggeklemme aufnehmen.Sobald das Pad gegriffen ist, ziehen Sie den Eierstock, das Eileiter und die Oberseite der Gebärmutter heraus. Als nächstes, suchen Sie die Ampulla und machen eine Halbsektion mit Vannas Schere, auf dem Eileitersegment, das den Eierstock mit der Ampulla verbindet. Dann führen Sie die Transfer-Embryo-Pipette ein und werfen Sie die Eier aus.Anhalten an der ersten Luftblase, nachdem die Eier freigegeben wurden. Lassen Sie die erforderlichen Materialien vorbereiten, um das Verfahren auf dem zweiten Eileiter zu wiederholen. Und sobald fertig, schließen Sie die Haut mit Wundclips.Unmittelbar nach dem Schließen der Haut injizieren Intraperitonealy Schmerzmittel und legen das Tier in die Rückgewinnungskammer mit einem 39 Grad Celsius Heizelement. Überwachen Sie, bis es vollständig wach ist. Transgene Tiere wurden mit der vorgestellten Methode erzeugt.Ein High Titer lentiviralVektorn wurden mit einem 2,3 Kilo Basisenhancer für Neurogenin-3 produziert, um eGFP zu fahren. Oder als Kontrolle, ein Fragment des Chromosoms sechs, um eGFP zu fahren. Die Integration in Embryonen war recht erfolgreich.Von den Embryonen wurde die Bauchspeicheldrüse geschnitten und immungefärbt, um nach einer lokalisierten Expression von eGFP zu suchen. Über 90 Prozent der Vektoren, mit dem Neurogenin-3 Enhancer, ausgedrückt eGFP in Neurog3 exprimierenden Zellen. Keiner der integrierten Kontrollvektoren drückte jedoch eGFP in der Bauchspeicheldrüse aus.Transgene Integrationsstandorte wurden mittels quantitativer PCR unter Verwendung des CDX2-Gens als Kontrolle bewertet. Die durchschnittliche Anzahl der Integrationsstandorte betrug etwa 20, indem das Neurogenin-3-Konstrukt verwendet wurde, oder 10 mit dem Steuerelementkonstrukt. Seltsamerweise war der virale Transduktionstiter, der für das Neurogenin-3-Konstrukt verwendet wurde, etwa das Doppelte des Kontrollvektors.Schlagen einer Beziehung zwischen dem Transduktionstiter und der Anzahl der Integrationen vor. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine große Anzahl von begründerischen transgenen Embryonen mit Perivitelline-Injektion von lentiviralen Vektoren mit hoher Wirksamkeit erzeugen können. Einmal gemeistert, kann diese Technik bis zu 50 Gründertiere innerhalb eines einzigen Tages der Mikroinjektion produzieren, wenn sie richtig durchgeführt wird.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie titer pronukleare DNA-Injektion durchgeführt werden, um transgene Mauslinien zu etablieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lentiviralen Vektoren der Genehmigung Ihres lokalen GVO-Ausschusses unterliegt. Diese Vektoren können extrem gefährlich sein und Vorsichtsmaßnahmen sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

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