Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, den Zugang zu embryonalen Hühneraugen in einer In-vitro-Umgebung zu ermöglichen, um eine eingehende Untersuchung komplexer Entwicklungswege im Embryo zu ermöglichen. Beim embryonalen Huhn ist die Untersuchung des Auges aufgrund der Entwicklung der Augenlider, der Bewegung des Embryos und des Wachstums von zusätzlichem embryonalem Gewebe oft schwierig. Verbindungen wie Medikamente und Hemmstoffe können auch tödliche Auswirkungen auf den Embryo haben, was es schwierig macht, diese Verbindungen zur Modulation von Genwegen zu verwenden.

Fortschritte in der In-vitro-Gewebekultivierung haben es Wissenschaftlern ermöglicht, diese Gewebe zu isolieren und viele der oben genannten Barrieren zu beseitigen. Unser Protokoll ist insofern vorteilhaft, als es uns ermöglicht, das Auge als Ganzes zu untersuchen, einschließlich aller Gewebe, die das Potenzial haben, während der Entwicklung zu interagieren, wie z. B. die neuronale Netzhaut und das pigmentierte Epithel der Netzhaut. Beginnen Sie mit dem Autoklavieren der Materialien, um sicherzustellen, dass alle Lösungen und Geräte vor dem Eingriff steril sind.

Autoklavieren Sie dazu zwei Liter destilliertes Wasser und einen Liter Kochsalzlösung zusammen mit einer Schachtel mit Taschentüchern, halbporösem Filterpapier, Drahtgeflecht, Wasserbehältern und Einweg-Glaspipetten. Sterilisieren Sie die Einlegeböden und die Tür des Inkubators gründlich mit 70 % Ethanol, füllen Sie die Behälter mit autoklaviertem, destilliertem Wasser und heizen Sie den Inkubator auf 37 Grad Celsius vor. Erwärmen Sie das Nährmedium zusammen mit einer Tube des Antibiotikums Penicillin Streptomycin im Inkubator.

Legen Sie ein Papiertuch über den Arbeitsbereich und sterilisieren Sie es mit 70%Ethanol. Sterilisieren Sie alle Pinzetten und Scheren. Wenn der Hühnerkopf in autoklavierter Kochsalzlösung gehalten ist, halbieren Sie den Kükenkopf in der Mittellinie und lassen Sie etwas Gewebe um jedes Auge herum in Takt.

Das zusätzliche Gewebe hilft dem Auge, eine gewisse Spannung in der Kultur aufrechtzuerhalten, unterstützt die Nährstoffaufnahme im gesamten Auge und verhindert, dass das Auge vom Filterpapier rutscht. Diese Gewebe dienen auch als Orientierungspunkte für die spätere Analyse des Auges. Lassen Sie das präparierte Gewebe in zimmerwarmer Kochsalzlösung, während Sie die Kultur vorbereiten.

Bereiten Sie die Kulturschale vor. Platzieren Sie zwei 35-Millimeter-Petrischalen in einer 100-Millimeter-Petrischale. Legen Sie einen Drahtgeflechttisch in jede kleine Schale.

Legen Sie den halben Kopf mit der Öse auf ein Blatt Filterpapier und neigen Sie ihn leicht, um sicherzustellen, dass die Öse nicht vom Papier rutscht. Übertragen Sie das Taschentuch und das Filterpapier in die kleine Petrischale auf der Drahtgeflechtbühne. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Hälfte des Kopfes desselben Embryos.

Geben Sie Kulturmedium in jede der beiden kleinen Petrischale. Bringen Sie das Medium auf die Höhe des Seidenpapiers. Tauchen Sie das Gewebe nicht in das Medium.

Geben Sie 50 Mikroliter des Antibiotikums Penicillin-Streptomycin-Stammlösung in das Nährmedium in jeder Schale, um eine bakterielle Infektion zu verhindern. Legen Sie ein gefaltetes Stück dünnes Taschentuch auf den Innenrand der größeren Petrischale und befeuchten Sie es mit destilliertem Wasser. Inkubieren Sie die Kultur im dunklen Inkubator bei 37 Grad Celsius für bis zu vier Tage.

Nach der Kultivierung das Tuch vom Filterpapier entfernen und mit 4%Paraformaldehyd fixieren. Die erste Spalte zeigt ein HH34-Auge, das das embryonale Kükenauge zu Beginn der Kultivierung darstellt. Die zweite Spalte zeigt ein embryonales Kükenauge, das vier Tage lang kultiviert wurde, beginnend bei HH34.

Die dritte Spalte zeigt ein HH38-Auge, was einer viertägigen In-Ovo-Entwicklung über HH34 hinaus entspricht. Die Platten A bis F sind ungefärbt, während die Platten G bis I für das alkalische Phosphatase-Enzym gefärbt sind. Die obere Reihe, Felder A bis C, zeigt, dass sich das Auge im Laufe der Kultur weiterentwickelt, was durch das Aussehen der Federknospen und das Wachstum der Augenlider belegt wird, die durch Pfeile in jedem Feld angezeigt werden.

Die mittlere Reihe, die Felder D bis F, zeigt, dass die Bindehautpapillen in Kultur zu degenerieren beginnen. Die untere Reihe, Tafeln G bis I, zeigt, dass das raumzeitliche Muster der Skleralknöchelcheninduktion in Kultur beibehalten wird, und dient als Beispiel für einen Entwicklungsweg, der mit dieser Methode untersucht werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht es dem Gewebe, wichtige räumliche und zeitliche Aspekte der Entwicklung während der gesamten Kultur beizubehalten.

Dieses Protokoll stellt einen wichtigen Fortschritt in der Kultivierung ganzer Sinnesorgane dar und bietet eine alternative Methodik zur Untersuchung der komplizierten Entwicklungswege, die daran beteiligt sind.