Untersuchung von Teliospore Keimen mit Microrespiration Analyse und Mikrodissektion

Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Verfahren ist es, Stadien der Sporenkeimung zu identifizieren, damit die Gentranskriptspiegel beurteilt werden können. Die Analyse dieser Veränderungen wird weitere Erkenntnisse über ein kritisches Stadium der Krankheitsausbreitung liefern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu Übergängen während der Teliosporenkeimung zu beantworten, die mit Veränderungen der Gentranskriptspiegel verbunden sind und somit Verschiebungen in der Genexpressionskontrolle widerspiegeln.

Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie Übergänge in der Atmung identifiziert, die nicht den sichtbaren morphologischen Schaltern entsprechen, und die physikalische Isolierung der Teliosporen in bestimmten Stadien der Keimung ermöglicht. Diese Technik hat Auswirkungen auf die Kontrolle der Ausbreitung von Krankheitserregern, da sie es uns ermöglicht, Schlüsselübergänge in der Sporenkeimung zu identifizieren, die, wenn sie verändert werden, die Ausbreitung der Krankheit blockieren könnten. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Maiskolbeninfektion, der Teliosporenernte sowie dem Teliosporen-Lebensfähigkeits- und Keimtest, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um die Keimung zu induzieren, wiegen Sie zunächst für jedes Atmungsexperiment die gleiche Menge Teliosporen. Geben Sie die Teliosporen in einer Biosicherheitswerkbank in eine autoklavierte Atemkammer. Füllen Sie die Kammer mit Kartoffeldextrosebrühe, ergänzt mit Streptomycinsulfat und Kanamycinsulfat.

Pipettieren Sie auf und ab, um eine Teliosporensuspension zu erzeugen. Setzen Sie den Kammerdeckel in die Kammer ein, um einen luftdichten Verschluss zu erzielen. Um die OCR-Messung zu erhalten, stellen Sie die Kammer zunächst in das Kammergestell in einem Wasserbad.

Platzieren Sie dann die Sauerstoffsonde in der Öffnung der Kammer. Überwachen Sie die Datenpunkte, die in Echtzeit im Sensor-Trace-Rate-Programm angezeigt werden. Lassen Sie die Sonde etwa drei Minuten lang stabilisieren, nachdem sie in die Kammer eingesetzt wurde.

Klicken Sie auf Messen, um den Sauerstoffgehalt sechs Stunden lang kontinuierlich zu messen, wobei die Messungen in Intervallen von zwei Sekunden aufgezeichnet werden. Stoppen Sie die Messung und wiederholen Sie diese Schritte für jede zu analysierende Probe, bevor Sie die Daten nach Microsoft Excel exportieren und die Datenanalyse durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie etwa 10 Milligramm Umatus-Teliosporen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Suspendieren Sie die Teliosporen in 500 Mikrolitern PDB, ergänzt mit Streptomycinsulfat. Vorsichtig pipettieren, um zu mischen, bis keine Klumpen von Teliosporen mehr im Medium vorhanden sind. Die Teliosporensuspension wird in einen autoklavierierten 250-Milliliter-Erlin-Meyer-Kolben überführt, der PDB enthält und mit Streptomycinsulfat ergänzt wird.

Inkubieren Sie den Kolben über Nacht bei 28 Grad Celsius und schütteln Sie ihn bei 90 U/min. Bereiten Sie eine Petrischale vor, indem Sie vier bis fünf Fünf-Mikroliter-Tropfen destilliertes Wasser über die Oberseite der Petrischale pipettieren. Pipettieren Sie dann drei Zwei-Mikroliter-Tröpfchen RNA-Stabilisierungslösung auf die Petrischale, um sie für die Probenentnahme zu verwenden.

Pipettieren Sie auch 30 Fünf-Mikroliter-Tröpfchen keimender Teliosporen auf die Petrischale. Geben Sie 15 Milliliter Mineralöl in die Petrischale. Stellen Sie sicher, dass alle Tröpfchen mit Öl bedeckt sind, bevor Sie fortfahren.

Bereiten Sie als Nächstes eine Mikrokapillare mit einem Zwischendurchmesser von 15 Mikrometern, einem Flansch von einem Millimeter, einer Länge von 55 Millilitern und einem Spitzenwinkel von 20 Grad vor. Legen Sie es in den Mikrokapillarhalter und tauchen Sie es in das Mineralöl, wo das Mineralöl durch Kapillarwirkung in die Mikrokapillare eindringen kann. Lassen Sie den Druck in der Mikrokapillare ab, bevor Sie ihn zum Wassertropfen bringen.

Aspirieren, um die Mikrokapillare mit Wasser vorzubereiten. Bewegen Sie die vorbereitete Mikrokapillare mit den Steuerelementen des Mikromanipulators zu einem der Keimtröpfchen und dringen Sie in das Tröpfchen ein. Senken Sie die Mikrokapillare ab und bringen Sie die Mündung der Mikrokapillare im Stadium der interessierenden Keimung auf eine keimende Teliospore.

Langsam aspirieren, um die keimende Teliospore einzufangen. Hören Sie auf zu aspirieren, sobald die Teliospore in die Mikrokapillare eingedrungen ist. Wiederholen Sie den Vorgang, bis sich etwa fünf Teliosporen in der Mikrokapillare befinden.

Heben Sie die Mikrokapillare mit dem Mikromanipulator an und bringen Sie sie zum Sammeltröpfchen der RNA-Stabilisierungslösung. Dringen Sie in das Tröpfchen ein und injizieren Sie die Teliosporen in das Tröpfchen. Wiederholen Sie diese Schritte, bis etwa 1.000 Teliosporen eingefangen wurden.

Um das Sammeltröpfchen zurückzugewinnen, pipettieren Sie das Sammeltröpfchen nach oben und übertragen Sie es auf den Deckel des freien 2,0-Milliliter-Mikrozentrfugenröhrchens einer RNA-DNA. Das Mineralöl vorsichtig mit der Pipette auffüllen, ohne den Auffangtropfen zu stören. Die Teliosporen können nun für nachgelagerte Anwendungen wie die RNA-Isolierung verwendet werden.

Dieses Diagramm veranschaulicht ein typisches Ergebnis der Bewertung von Änderungen des Sauerstoffgehalts in Suspensionen von Teliosporen, die zur Keimung induziert werden. Relativ zu den nicht induzierten Teliosporen erfolgt die Trennung, die den Beginn der Atmung anzeigt, nach etwa 30 Minuten. Wenn man bedenkt, dass es etwa 15 Minuten dauert, die Probe einzurichten und zur Sauerstoffsonde zu transportieren, beträgt diese Zeit tatsächlich 45 Minuten.

Hier sind die fünf Stadien der Keimung von Teliosporen dargestellt. Im ersten Stadium werden die Teliosporen zum Keimen angeregt, zeigen aber keine morphologischen Anzeichen einer Keimung. Die Teliosporen des zweiten Stadiums zeigen ein geschlüpftes Promyzel mit einer Länge, die kleiner ist als der Durchmesser der Teliospore.

Im dritten Stadium ist die Länge des Promyzels größer als der Durchmesser der Teliospore. Das vierte Stadium ist durch Promyzelien mit angehängten Basidiosporen gekennzeichnet. Und im fünften Stadium gibt es knospende Basidiosporen.

Hier sind die asynchron keimenden Teliosporen dargestellt und die Mikrokapillare in der Nähe einer Teliospore der dritten Stufe positioniert. Die Teliospore des dritten Stadiums wird dann in die Mikrokapillare aspiriert und in einen Tropfen Sammellösung überführt. Einmal gemeistert, kann diese Mikrodissektionstechnik verwendet werden, um 1.000 stadienspezifische Teliosporen in sechs bis sieben Stunden zu isolieren.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, häufige Pausen einzulegen. Nachdem Du Dir dieses Video angesehen hast, solltest Du ein gutes Verständnis dafür haben, wie Du Sporen in morphologisch unterschiedlichen Stadien der Keimung physisch isolieren kannst. Und identifizieren Sie den Zeitpunkt des Beginns der Atmung.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie die Sterilität aufrechterhalten müssen. Und die Notwendigkeit von Geduld und der Isolierung von Zelltypen durch Mikrodissektion. Die Entwicklung dieser Technik ebnet den Weg für Pilzpflanzenpathologen, um die morphologischen und molekularen Aspekte der Keimung bei verheerenden Brand- und Rostpilzen zu erforschen, die die globale Ernährungssicherheit bedrohen.

Obwohl diese Technik auf uns Ligomatisten zutrifft, könnte sie auch bei vielen anderen verheerenden Krankheitserregern in der Landwirtschaft eingesetzt werden, die jährlich zu Verlusten in Milliardenhöhe führen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die RNA-Isolierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. wie ist das Profil und der Zeitpunkt der Veränderung des Transkriptspiegels?