Name: Selbststehende elektrochemischen Aufbau Anode atmender Bakterien vor Ort zu bereichern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Erfahren Sie eine stromlose elektrochemische Methode zur Anreicherung von Mikroorganismen mit extrazellulärem Elektronentransport vor Ort. Diese Technik ermöglicht die Isolierung schwer kultivierbarer Bakterien aus extremen Umgebungen über Monate.

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Wir würden gerne Roger Raiche und David McCrory für uns Zugang zu den Zedern und Beratung über Standorte für langfristige Inkubation anerkennen. Wir danken auch die Zedern-Feld-Mannschaft in der Saison 2013 / 2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam und Matthew Schechter. Zusätzlicher Dank Shino Suzuki und Gijs Kuenen für aufschlussreiche Forschung und Kultivierung Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe für junge Wissenschaftler A und B von der Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant 17 H 04969 und 26810085, bzw. die Nummer und die Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (17gm6010002h0002) finanziert. US-Finanzierung zur Verfügung gestellt von uns Office of Global Marine Research (N62909-17-1-2038) und dem Center für dunkle Energie Biosphäre Untersuchungen (C-DEBI) (OCE0939564) und der NASA Astrobiology Institute - Life Underground (NAI-LU) (NNA13AA92A). Teil dieser Arbeit wurde als Teil einer Japan-Gesellschaft für die Förderung der Wissenschaften durchgeführt: kurzfristige Postdoc-Stipendium für Annette Rowe (PE15019) an der Universität Tokio im Labor von Kazuhito Hashimoto.

1. Bau eines zwei-Elektroden-Systems zur Umwelt Inkubation
<ol><li>
Vorbereitung des Materials Anode und Behandlung von Carbon fühlte Elektrode (Abbildung 2).
	<ol>
<li>Schneiden Sie die Kohle gleich Dimensionen je nach gewünschten Biomasse Bereicherung empfunden. Einweichen Sie jede Elektrode in 90 % Ethanol für 30 min, dann spülen Sie mindestens 8 Mal mit entionisiertem Wasser, nach jedem Spülgang für 1 min beschallen.</li>
		<li>Waschen Sie die Elektroden zweimal in 1 M HCl, rühren für mindestens 12 h für jede Wäsche.</li>
		<li>Trocknen Sie die Elektroden in einem Ofen Warm (37 ° C) für 6 – 12 h oder bis frei von Flüssigkeit.</li>
		<li>Titan-Draht mit Graphit-Epoxid pro des Herstellers Protokoll auf einem Teller Polytetrafluorethylen (Antihaft-Beschichtung) zuordnen Sie Elektroden. Hinweis: Wir verwendet einen Titan-Draht durch seine hohe Toleranz gegenüber aeroben Korrosion.</li>
		<li>Backen Sie die Elektrode bei 120 ° C für 6 h.</li>
		<li>Testen Sie den Widerstand zwischen Titan-Draht und Kohlenstoff mit einem Ohmmeter fühlte und bestätigen, dass der Widerstand zwischen dem Draht und Filz Elektroden ist weniger als 5 Ohm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Matritzenschnitt von Platin auf den Kohlenstoff fühlte Elektrode für die Vorbereitung der das Kathodenmaterial
	<ol>
<li>Tauchen Sie Filz Kohleelektroden in Schritt 1.1, in 2 M KOH für ein Minimum von 12 h in einem Glasbehälter vorbereitet.</li>
		<li>Zum elektrochemischen reinigen, legen Sie die Elektrode als Elektrode (WE) arbeitet in einem drei-Elektroden-Reaktor, der auch eine Referenz (RE) und Gegenelektrode (CE) beherbergt. Verbinden wir, RE und CE potentiostaten mit Krokodilklemmen. Bestätigen Sie alle Verbindungen mit einem Ohmmeter. Hinweis: Wir haben eine Ag/AgCl (KCl gesättigt) Elektrode und einer Platin Draht als RE und CE, beziehungsweise.</li>
		<li>Haltung der Elektrode bei 1,0 V Vs. AG/AgCl für 600 s im Elektrolyt-Lösung mit 2 M KOH (mit einer ausreichenden Menge die ganze Elektrode untertauchen). Nehmen Sie die Elektrode aus dem elektrochemischen Reaktor (die aus Glas besteht). Spülen Sie die Elektrode in entionisiertem Wasser mindestens 8 Mal für 1 min nach jeder Spülung beschallen. Trocknen Sie Elektroden bei 100 ° C für mindestens 12 Stunden.</li>
		<li>Um die Beschichtung Lösung vorzubereiten, fügen Sie 100 g Zitronensäure, 5 g Natriumsulfat und 2 g Dihydrogen Hexachloroplatinate (IV) Hexahydrat 1 L 2 M Schwefelsäure hinzu.</li>
		<li>Wiegen gereinigt und getrocknet Elektroden wie in Schritten 1.2.1–1.2.2 vorbereitet und dann decken die Elektrode in einer Beschichtung-Lösung, wie in Schritt 1.2.3 vorbereitet. Beschallen Sie die Elektrode in der Beschichtung Lösung dreimal für 30 s.</li>
		<li>Galvanisieren der Elektroden durch nutzmöglichkeiten potenzielle Elektrode auf -0,2 V vs. Ag/AgCl für 460 s in plating-Lösung. Elektroden zweimal in entionisiertem Wasser spülen und die Platin Abfälle entsorgen.</li>
		<li>Spülen Sie Elektroden in entionisiertem Wasser mindestens 3 Mal beschallen für 20 s nach jedem spülen. Spülen Sie ohne Beschallung mindestens drei weitere Male.</li>
		<li>Trockene Elektroden bei 100 ° C für mindestens 12 Std. wiegen Elektrode, die galvanische Platin auf Filz kohlenstoffelektrode zu quantifizieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Konstruktion und den Einbau von zwei-Elektroden-System
<ol><li>
Untersuchung des Installationsortes für jede Elektrode in der natürlichen Umwelt.
	<ol>
<li>Bestimmen Sie Sauerstoff-Konzentration mit einer Sonde für gelösten Sauerstoff (DO).</li>
		<li>Überprüfen Sie das Tiefenprofil des DO am Standort. Hinweis: Die gewünschten Umgebungsbedingungen für die Anode sind konsequente Flüssigkeitszufuhr und Sauerstoffmangel. Falls gewünscht, entfernen Sie den Einfluss der sauerstoffhaltige Photosynthese durch Abschirmung der Anode aus Licht. Die idealen Bedingungen für die Platzierung von Kathode konsequent hydratisiert und in der Nähe von Oberflächengewässer oxischen sein. Bei Bedarf legen Sie schwimmt um Oberflächenkontakt in der Kathode zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bau von Typ 2-Elektrode Inkubation Brennstoffzellensystem
	<ol>
<li>Schließen Sie den isolierten Draht der gewünschten Länge und einen Vorsprung von Titan-Draht von den Elektroden (eine Anode und eine Platin plattiert Kathode) durch Verdrehen der beiden Linien. Die Verbindungen mit wasserfesten Wachs abdecken und weitere schützen mit marine Grade Schrumpfschläuche.</li>
		<li>Verbinden Sie zwei Drähte mit einer Kathode und Anode durch einen Widerstand von bekannten Widerstand. Hinweis: Für biologische Systeme führen geringere Widerstände (10 bis 1.000 Ω) in konsequenter biologischer Aktivität. Falls gewünscht, wird ein hohen Widerstand Widerstand zu verhindern, dass biologischen Aktivität als Negativkontrolle. Um eine Korrosion der Verbindungen zwischen Widerstand und führt zu verhindern, werden wir sie mit Schrumpfschläuche geschützt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Messung für Spannung und Temperatur Protokollierung im Laufe der Zeit.
	<ol>
<li>Überprüfen Sie die Spannung zwischen den Enden des Widerstands für die Schätzung der aktuellen Produktion aus der Brennstoffzelle Reaktion.</li>
		<li>Messen Sie die Spannungsdifferenz im Laufe der Zeit mit einem Daten-Logging-Voltmeter mit den entsprechenden Verbindungen zu der Anode und Kathode (siehe Protokoll des Herstellers). Hinweis: Gleichzeitige Temperatur Datenaufzeichnung ist optional, aber diese Informationen können helfen, Veränderungen zu abiotischen im Gegensatz zu biologischen Stromschwankungen zu beziehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Schutz der Datenlogger und elektrische Anschlüsse
	<ol>
<li>Verwenden Sie eine stationäre und/oder Kunststoff-Tasche, um die Protokollierung und die elektrischen Anschlüsse vor Regen zu schützen.</li>
		<li>Befestigen Sie die Plastiktüte und Kabel fest zum Schutz vor starkem Wind. Ein Beispiel ist in Abbildung 1dargestellt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Erhebung der Elektrode Probe aus der natürlichen Umgebung
<ol><li>Um die Qualität der Anode Probe verhindern Beschädigung durch Sauerstoff Verschmutzung, sammeln Sie die Elektrode unter anaeroben Bedingungen.</li>
	<li>Mindestens 30 min vor der Entnahme der Elektrode Probe setzen ein Reagenzglas in einer anaeroben Lage. Beispielsweise setzen Sie die Reagenzglas und Deckel separat am Ende des Teiches, die Flasche in anaeroben machen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Titan-Führung von der Elektrode mit einem Drahtschneider, sanft sammeln Sie die Elektrode Probe in das Reagenzglas und versiegeln Sie es in der anaeroben Wasser-Zone. Um die Probe frisch, speichern Sie das Sample bei 4 ° C unmittelbar nach der Probenentnahme. Hinweis: Alternativ können Elektroden direkt auf anoxischen (N2 bereinigt) Medium übertragen werden. Wir verwendeten ein Cedars Medium (beschrieben von Suzuki Et al. ( 11), wurde von der wässrigen Geochemie gemessen am Standort und geändert entwickelt, um ausreichend Nährstoffe für das mikrobielle Wachstum zu bieten. Dieses Medium wurde für verschiedene Laborversuche geändert.</li>
</ol>4. Laborbestätigung für die aktuelle Produktion und DNA-Analyse
<ol><li>
Elektrochemische Bestätigung für aktuelle Produktionskapazität der mikrobielle Konsortien, die Befestigung an der Elektrode.
	<ol>
<li>Konstruieren Sie eine elektrochemische Reaktor14,15 mit der gesampelten Elektrode, ein Platindraht und eine Ag/AgCl (KCl gesättigt) Elektrode als wir, CE, und RE, bzw. in einer anaeroben Kammer. Cedars Medium mit löslichen Kohlenhydrate Elektron Spender füllen Sie den elektrochemischen Reaktor ein.</li>
		<li>Haltung die Elektrode Potenzial bei + 0,2 V vs. Ag/AgCl und Maßnahme der laufenden Produktion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA-Extraktion aus der Elektrode-Probe mit einer mikrobiellen DNA kit (siehe Tabelle der Materialien).
	<ol>
<li>Reinigen Sie das Innere des anaeroben Glove-Box mit 70 % Ethanol und legte eine sterilisierte Gericht auf Aluminiumfolie. Hinweis: Anaerobe Kammer hält Sauerstoff-Konzentration von weniger als 1 ppm durch die Aufrechterhaltung einer Wasserstoffatmosphäre um ~ 2 – 3 % Sie Sauerstoff in Anwesenheit eines Palladium-Katalysators aufräumen.</li>
		<li>Den elektrochemischen Reaktor im Handschuhfach öffnen, legen Sie die Probe-Elektrode auf dem Teller und schneiden auf eine Größe passt das Rohr in die DNA-Kit verwendet. Fahren Sie mit der Hersteller-Protokoll.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nealson, K. H., Saffarini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+manganese+in+anaerobic+respiration%3A+environmental+significance%2C+physiology%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation.</a> Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).</li>
<li>Lovley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bug+juice%3A+harvesting+electricity+with+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bug juice: harvesting electricity with microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 4 (7), 497-508 (2006).</li>
<li>Rabaey, K., Rozendal, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+electrosynthesis+-+revisiting+the+electrical+route+for+microbial+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (10), 706-716 (2010).</li>
<li>Lovley, D. R., Coates, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioremediation+of+metal+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioremediation of metal contamination.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (3), 285-289 (1997).</li>
<li>Dinh, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+corrosion+by+novel+anaerobic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms.</a> Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).</li>
<li>Myers, C. R., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+manganese+reduction+and+growth+with+manganese+oxide+as+the+sole+electron+acceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor.</a> Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).</li>
<li>Lovley, D. R., Phillips, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mode+of+microbial+energy+metabolism%3A+organic+carbon+oxidation+coupled+to+dissimilatory+reduction+of+iron+or+manganese%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese.</a> Applied and Environmental Microbiology. 54 (6), 1472-1480 (1988).</li>
<li>Arnold, R. G., DiChristina, T. J., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+dissolution+of+Fe%28III%29+oxides+by+Pseudomonas+sp+200%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Reductive dissolution of Fe(III) oxides by Pseudomonas sp 200.</a> Biotechnology and Bioengineering. 32 (9), 1081-1096 (1988).</li>
<li>Rowe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electrochemical+enrichment+and+isolation+of+a+magnetite-reducing+bacterium+from+a+high+pH+serpentinizing+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Environmentakl+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In situ electrochemical enrichment and isolation of a magnetite-reducing bacterium from a high pH serpentinizing spring.</a> Environmentakl Microbiology. 19 (6), 2272-2285 (2017).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+diversity+in+The+Cedars%2C+an+ultrabasic%2C+ultrareducing%2C+and+low+salinity+serpentinizing+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (38), 15336-15341 (2013).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+genomic+features+of+highly+alkaliphilic+hydrogen-utilizing+Betaproteobacteria+from+a+continental+serpentinizing+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site.</a> Nature Communications. 5, 3900(2014).</li>
<li>McCollom, T. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703716300941">Temperature trends for reaction rates, hydrogen generation, and partitioning of iron during experimental serpentinization of olivine.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 181, 175-200 (2016).</li>
<li>Morrill, P. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703713000768">Geochemistry and geobiology of a present-day serpentinization site in California: The Cedars.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 109, 222-240 (2013).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468611004543">In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes.</a> Electrochimica Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nakamura, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOkamoto%2C+A+%22Spectroelectrochemical+Investigation+on+Biological+Electron+Transfer+Associated+with+Anode+Performance+in+Microbial+Fuel+Cells%22">Spectroelectrochemical Investigation on Biological Electron Transfer Associated with Anode Performance in Microbial Fuel Cells</a>. , InTech. 207-222 (2012).</li>
<li>Deng, X., Nakamura, R., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/electrochemistry/83/7/83_15-E00044/_article">Electron from an Extracellular Electrode by Desulfovibrio ferrophilus Strain IS5 Without Using Hydrogen as an Electron Carrier.</a> Electrochemistry. 83 (7), 529-531 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In der beschriebenen Studie zeigen wir die Anreicherung eines mikrobiellen Konsortiums, verbunden mit in Situ laufende Produktion. Die beobachteten Muster in aktuellen Unterstützung mikrobielle Aktivität in diesem System über kurze und lange Zeit skaliert. Der entscheidende Schritt für den Bau einer funktionalen zwei-Elektroden (Brennstoffzellen-Typ) System ist identifizieren und nutzen eine Lage mit einer stabilen Wasserstand und Sauerstoffkonzentration in der Umwelt. Die Kathode ist Sauerstoff in der Luft-Wass...

Mehrere Mineral-reduzierende Mikroben haben gezeigt, dass Festphasen-Mineralien als terminal Elektronen Akzeptoren nutzen durch extrazelluläre Elektronentransport (EET) Prozesse, die Elektronen an der Außenseite der Zelle über Redox Enzyme1durchführen. EET ist entscheidend, nicht nur für Mikroben-Mineral Prozesse aber auch Angewandte Energie- und Umwelttechnologien, wie mikrobielle Brennstoffzellen2, Elektrode Synthese3und Bioremediation4. Neue EET-fähigen Bakterien sind sehr begehrt und wurden von einem grundlegenden und angewandten Perspektive5ausgiebig untersucht. Allerdings haben wir nur einen Einblick in die ökologischen oder biogeochemische Bedeutung dieser Bakterien beschränkt. Die Mehrheit der EET-fähigen Mikroben wurden isoliert nach Anreicherung von Aqua, Sediment oder anaeroben Fermenter mit solide Elektronen-Akzeptoren wie MnO2, Fe2O3 oder balanciert Elektroden im Labor6, 7 , 8. jedoch diese Methoden produzieren häufig ähnliche Konsortien und empfindlicher Taxa, die Niedrigenergie- oder niedrigen Biomasse-Systeme, Vorspannen der Anpassungsfähigkeit dieser Mikroben an Labor oder in der axenic Kultur Umwelt9 dominieren können potenziell zu verpassen . In der Regel sind für Umgebungen mit niedrigen Biomasse, große Mengen Wasser von einer Website gefiltert, um bakterielle Zellen zu konzentrieren. Allerdings EET-fähigen Bakterien zeigen oft anaeroben Stoffwechsel und daher Sauerstoff-Exposition kann weiter hemmen oder verhindern, dass ihr Anbau. Alternative vor-Ort-Methoden, um Zellen zu konzentrieren, ohne sie zu Sauerstoff könnte die Isolation der EET-fähigen Bakterien erleichtern. Hier berichten wir Einrichtungsdetails für eine vor-Ort-elektrochemische Technik, EET-fähigen Mikrobe über einen langen Zeitraum hinweg ohne die Notwendigkeit für eine externe Stromquelle zu bereichern.
Mit unseren Electrocultivation Experimenten aus einer stark alkalischen Quelle in Nordkalifornien, die Zedern10, beschreiben wir diese vor Ort elektrochemische Technik. Die Geochemie der Federn bei The Cedars werden durch assimiliert im Untergrund belastet. Die Federn sind sehr reduktiv, mit Sauerstoffkonzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze unter der Luft-Wasser-Grenzfläche Hervorhebung das Potenzial für die mikrobielle Energieerzeugung über EET in dieser funktional anoxischen Umwelt11. Allerdings gibt es keine Beweise für EET-fähigen Mikroben aus Zedern (in 16 s rRNA oder Metagenomischen Analyse) zu unterstützen. Obwohl dieser Umgebung ist, als Elektronen-Akzeptor begrenzt charakterisiert worden, das Potenzial für die Verwendung von unlöslicher Minerals als terminal Elektronen-Akzeptoren, einschließlich Mineralien wie Eisen, die Mineralien, die aus assimiliert (d.h., baring Magnetit), wurde nicht ausführlich untersuchten12. Wir, hat daher unsere elektrochemische System bereitgestellt, am Campingplatz Feder, ein hoher pH-Wert Feder an den Zedern, EET-fähigen Mikroben (Abbildung1)13zu bereichern.

<table><tbody><tr><td>Carbon-Filzplatte</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Wird für Anode und Kathode</td></tr><tr><td>verwendet Titandraht</td><td>Die Nilaco Cooporation</td><td>TI-451485</td><td>Wird verwendet, um ein Brennstoffzellensystem</td></tr><tr><td>zu konstruieren Graphit-Epoxid-Elektrolytica</td><td>lnc.</td><td>n/a</td><td>Zum Anschließen der Elektroden und des Ti-Drahtes</td></tr><tr><td>Trockenschrank</td><td>Yamato</td><td>DY300</td><td>Backen Sie die Elektrode auf verfestigen Sie leitfähiges Graphit-Epoxidharz</td></tr><tr><td>Digitales Multimeter</td><td>Fluke</td><td>616-1454</td><td>zur Überprüfung des ohmschen Wertes des Widerstands</td></tr><tr><td>Sonde für gelösten Sauerstoff</td><td>Sper Science</td><td>#&nbsp; 850045</td><td>zur Überprüfung der Sauerstoff -Konzentration im Umgebungen</td></tr><tr><td>Widerstand</td><td>Sodial</td><td></td><td>Wird für den Bau eines Brennstoffzellen -Systems verwendet</td></tr><tr><td>Leitender Draht</td><td>Pico</td><td>81141s</td><td>Wird für den Bau eines Brennstoffzellen -Systems</td></tr><tr><td>verwendet Voltmeter und Datenlogger</td><td>T& D corporation</td><td>VR-71</td><td>Wird für die Datenaufzeichnung</td></tr><tr><td>verwendet Wasserstoff Hexachlorplatinat (IV) Hexahydrat</td><td>Wako</td><td>18497-13-7</td><td>Wird für die Elektropolation</td></tr><tr><td>verwendet Zitronensäure</td><td>Wako</td><td>038-06925</td><td>Wird für die Elektropolation</td></tr><tr><td>verwendet Schwefelsäure</td><td>Wako</td><td>192-04696</td><td>Wird für die Elektropolation</td></tr><tr><td>verwendet HCl</td><td>Wako</td><td>083-01095</td><td>Wird für die Elektrodenwäsche</td> verwendet</tr><tr><td>Glaszylinder</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung, die als Abdeckung und Basis des elektrochemischen Reaktors verwendet</td></tr><tr><td>wird</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung, die als Abdeckung und Grundlage des elektrochemischen Reaktors verwendet wird</td></tr><tr><td>Hüttylkautschuk</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung, eingefügt zwischen den einzelnen Komponenten des elektrochemischen Reaktors</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>Wird als Injektionsöffnung einer elektrochemischen Reaktorelektrode</td></tr><tr><td>verwendet Indiumzinn-dotiertes Oxid (ITO)</td><td>GEOMATEC</td><td>Nr. 0001</td><td>Wird als Arbeitselektrode verwendet, 5&Omega;/sq</td></tr><tr><td>Ag/AgCl KCl gesättigte Elektrode</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>Wird als Referenzelektrode verwendet, &Phi; 0,30 mm</td></tr><tr><td>Platindraht</td><td>Die Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>Wird als Gegenelektrode</td></tr><tr><td>verwendet NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>Wird für The Cedars Media (CMS)</td></tr> <tr><td>verwendet CaCO3</td><td>Wako</td><td>030-00385</td><td>Verwendet für CMS</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>Verwendet für CMS</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; &stier; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>Verwendet für CMS</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>Verwendet für CMS</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Wako</td><td>194-03355</td><td>Verwendet für CMS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>Verwendet für CMS</td></tr><tr><td>CABS</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC-285279</td><td>Verwendet für CMS</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>Wird für die Vorkultivierung</td></tr><tr><td>von Autoklavenmaschinen</td><td>TOMY SEIKO CO., LTD. verwendet.</td><td>LSX-500</td><td>Wird zur Sterilisation des elektrochemischen Reaktors und des Mediums verwendet</td></tr><tr><td>Reinbank</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>Wird verwendet, um die Kontamination des elektrochemischen Reaktors und des Mediums mit anderen Mikroben zu verhindern</td></tr><tr><td>Zentrifugenseparator</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>Drehzahl bis zu 6000x; g wird benötigt</td></tr><tr><td>Stickstoffgasgenerator</td><td>Puequ CO. LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>Stickstoffgasflasche kann auch anstelle des Gasgenerators verwendet werden</td></tr><tr><td>UV-Vis-Spektrometer</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>Wird zur Optimierung der Zelldichte verwendet</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>Wird für Biofilmbildung und Experimente mit kinetischen Isotopeneffekten verwendet</td></tr><tr><td>Thermalwasserzirkulator</td><td>AS ONE</td><td>TR-1A</td><td>Wird zur Aufrechterhaltung der Temperatur des elektrochemischen Reaktors verwendet</td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>Wird für elektrochemische Experimente verwendet</td></tr><tr><td>Anaerobe Kammer</td><td>COY</td><td>TypB (Vinyl)</td><td>ZUR Durchführung von Experimenten unter anaeroben Bedingungen</td></tr><tr><td>Ultraclean DNA Extraktionskit</td><td>MoBio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selbststehende elektrochemischen aufbau anode atmender bakterien vor ort zu bereichern

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Anaerobe Atmung gepaart mit Elektronentransport zu unlöslichen Mineralien (extrazelluläre Elektronentransport [EET] genannt) wird angenommen, dass kritische für mikrobielle Energieerzeugung und Persistenz in vielen unterirdischen Umgebungen, insbesondere fehlt es an löslichen terminal Elektronen-Akzeptoren. Während EET-fähigen Mikroben aus verschiedenen Umgebungen erfolgreich isoliert wurden, die Vielfalt der Bakterien in der Lage, EET ist immer noch schlecht verstanden, vor allem in schwierigen Probe, niedrige Energie oder extreme Umgebungen, wie viele Untergrund Ökosysteme. Hier beschreiben wir eine vor-Ort-elektrochemischen System EET-fähigen Bakterien mit eine Anode als eine respiratorische terminal Elektron Akzeptor zu bereichern. Diese Anode ist mit einer Kathode in der Lage katalysieren abiotischen sauerstoffreduktion verbunden. Vergleicht man diesen Ansatz mit Electrocultivation Methoden, mit denen ein potentiostaten für nutzmöglichkeiten potenzielle Elektrode, ist das zwei-Elektroden-System nicht erforderlich, eine externe Stromquelle. Wir präsentieren Ihnen ein Beispiel für unsere vor-Ort-Anreicherung in einem alkalischen Teich an der Zedern, eine terrestrische assimiliert Website in Nordkalifornien genutzt. Vorherige Versuche, mineralischen reduzierende Bakterien kultivieren scheiterten, dürfte aufgrund der niedrigen Biomasse Natur dieser Website und/oder niedrige relative Häufigkeit des Metalls, die Verringerung der Mikroben. Vor der Implementierung unserer zwei-Elektroden-Anreicherung, haben wir das Höhenprofil des gelösten Sauerstoff-Konzentration gemessen. Dies erlaubt uns, legen Sie die Kohle fühlte fühlte Anode und Platin galvanisch gebundenen Kohlenstoff Kathode in tiefen, die anaeroben und aeroben unterstützen würde bzw. verarbeitet. Nach vor-Ort-Inkubation weiter bereichert die anodische Elektrode im Labor und bestätigt eine ausgeprägte mikrobiellen Gemeinschaft im Vergleich zu der Oberfläche befestigt oder Biofilm-Gemeinschaften, die normalerweise bei der Zedern beobachtet. Diese Bereicherung führte später zur Isolierung von der ersten elektrogenes Mikrobe von Zedern. Diese Methode der vor-Ort-mikrobielle Bereicherung hat das Potenzial, die Isolation der EET-fähigen Bakterien aus niedrigen Biomasse oder schwer zu Probe Lebensräume erheblich verbessern.

Aktueller Produktion gemessen wurde erfolgreich für ca. 3 Monate mit einer Spannung Datenlogger wie in Abbildung 3dargestellt. Diesmal wurde gewählt, da es die längste stabile Inkubationszeit für das Frühjahr, aufgrund der starken Rückgang Regenfälle beeinträchtigen die Feder war. Eine kürzere Frist könnte ausreichen, wenn eine längere stärkere Anreicherung von Biomasse liefern könnten. Wir bestätigt die Verbindung von zwei-Elektroden-System nach der elektroc...

Vor-Ort-mikrobielle Bereicherung oder in Situ Anbautechniken können die Isolierung der mikrobiellen Taxa schwierig zu Kultur, vor allem von Low-Biomasse oder geochemisch extreme Umgebungen erleichtern. Hier beschreiben wir eine elektrochemische Einrichtung ohne eine externe Stromquelle, um mikrobielle Belastungen zu bereichern, die extrazelluläre Elektronentransport (EET) geeignet sind.

Selbststehende elektrochemischen Aufbau Anode atmender Bakterien vor Ort zu bereichern

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Umweltmikrobiologie über die Allgegenwart von Mikroben zu beantworten, die in der Lage sind, EET zu erzeugen, insbesondere bei geringer Biomasse oder geochemisch extremen Bedingungen. Der Hauptvorteil unserer mikrobiologischen Anreicherung vor Ort besteht darin, dass keine Stromquelle benötigt wird, was die monatelange Isolationszeit für den Fang schwer zu kultivierender Taxa erleichtert. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Herstellung elektrochemischer Systeme mehrere Schritte umfasst, die eine präzise Implementierung erfordern.Um das Elektroden-Inkubationssystem der Brennstoffzelle Typ II zu konstruieren, verdrillt man einen isolierten Draht der entsprechenden Versuchslänge mit einer Leitung aus Titandraht von den Elektroden und bedeckt die Anschlüsse mit wasserfestem Wachs. Schützen Sie dann die Kabel weiter mit Schrumpfschläuchen in Marinequalität und verbinden Sie die beiden Drähte mit einer Kathode und einer Anode durch einen Widerstand mit bekanntem Widerstand. Um die Spannungstemperaturaufzeichnung über die Zeit zu messen, überprüfen Sie die Spannung zwischen den Enden des Widerstands, um eine Abschätzung der Stromerzeugung aus der Brennstoffzellenreaktion zu ermöglichen.Und verwenden Sie ein Datenerfassungsvoltmeter mit dem entsprechenden Anschluss, der zu Anode und Kathode führt, um die Spannungsdifferenz über die Zeit gemäß den Herstellerangaben zu messen. Um den Datenlogger und die elektrischen Anschlüsse zu schützen, legen Sie eine Plastiktüte um den Logger und alle elektrischen Anschlüsse und befestigen Sie die Tasche und die Kabel fest, um das Material vor starkem Wind zu schützen. Um eine Elektrodenprobe aus der natürlichen Umgebung zu entnehmen, platzieren Sie mindestens 30 Minuten vor der Entnahme ein Reagenzglas ohne Deckel und den Deckel des Reagenzglases an einem anaeroben Ort.Nachdem Sie die Flasche an den Sammelort gestellt haben, stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen aus dem Inneren der Flasche entfernt wurden. Am Ende der Kultivierungszeit schneiden Sie mit einem Drahtschneider das Titanblei von der Elektrode ab. Und sammeln Sie die Elektrodenprobe vorsichtig im Reagenzglas.Verschließen Sie das Reagenzglas in der anaeroben Wasserzone und lagern Sie die Probe sofort bei vier Grad Celsius. Um die aktuelle Produktion zu bestätigen, verwenden Sie die beprobte Elektrode, den Platindraht und die Silber/Silberchlorid-Elektrode, um einen elektrochemischen Reaktor in einer anaeroben Kammer zu konstruieren. Füllen Sie die elektrochemische Zelle mit Zedernmedium, das mit löslichen Kohlenhydrat-Elektronendonatoren ergänzt ist.Stellen Sie das Elektrodenpotential auf positive 0,2 Volt im Vergleich zu Silber/Silberchlorid und Kaliumchlorid-gesättigter Referenzelektrode ein. Messen Sie dann die Stromproduktion und entfernen Sie die Elektrode aus der Elektrodenzelle für die ribosomale 16S-RNA-Analyse. Bei der Analyse der aktuellen Produktion ist es wichtig, eine Kontamination der Probe mit Bakterien aus dem Labor zu vermeiden, insbesondere innerhalb der anaeroben Handschuhkammer.Mit einem demonstrierten Spannungsdatenlogger wurde die Stromerzeugung etwa drei Monate lang erfolgreich gemessen. In diesem Zwei-Elektroden-System ist typischerweise ein hoher Strom zu beobachten. Hier ist der Widerstand von 1.000 Ohm im Vergleich zum negativen Widerstand von 100 Kiloohm zu sehen.In diesem repräsentativen Experiment wurde im ersten Monat an unserem Standort in Cedars ein allmählicher Anstieg der Stromproduktion beobachtet, was auf das Wachstum, die Akkumulation oder die Unterbringung von Mikroben auf der Oberfläche der Elektrode hindeutet, worauf dann eine stabile Stromproduktion für die nächsten zwei Monate folgte. Interessanterweise oszilliert die aktuelle Produktion in der Regel in einem etwa 24-Stunden-Zyklus über den gesamten Zeitraum der elektrochemischen Anreicherung. Innerhalb der beobachteten mikrobiellen Gemeinschaften sind deutliche Unterschiede in der übergreifenden Struktur zwischen Elektroden- und nicht-elektrodenassoziierten Stämmen zu erkennen.Zum Beispiel war in diesem Experiment die elektrodenassoziierte mikrobielle Gemeinschaft stark mit Bakterien aus nicht kultivierbaren Linien sowie Firmicute-Linien von Bazillus angereichert. In dieser Forschung wurde auch eine Verschiebung in der Zusammensetzung der Proteobakterien beobachtet, wobei Beta-Proteobakterien sowohl die Calcit-assoziierten als auch die planktonassoziierten Proben in der Umwelt dominierten und auf der anderen Seite Gamma-Proteobakterien die Elektroden-assoziierten Proben dominierten. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, dass Umweltfaktoren die aktuelle Produktion vor Ort beeinflussen können.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Umweltmikrobiologie, um EET-fähige Bakterien aus verschiedenen Umgebungen zu isolieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Vor-Ort-Anreicherung von EET-fähigen Bakterien durchführen können, ohne dass eine Stromquelle erforderlich ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Beginnen Sie mit einer Anreicherungskultur aus Feuchtgebietsböden, die Bakteriengemeinschaften enthält.Die Kultur zeigt Feammox-Aktivität, Ammoniumoxidation gekoppelt mit Eisenreduktion, was auf die Anreicherung eines Bakteriums hinweist, das zu diesem Stoffwechselprozess fähig ist.Verdünnen Sie die Kultur seriell mit Medien.Die verdünnten Proben werden auf Testagarplatten gestreift, die mit Eisen(III)-Eisen und Ammonium ergänzt sind.Verwenden Sie Kontrollplatten, die entweder Eisen(III)-Eisen...

Isolierung von Ammonium-oxidierenden Eisenreduzierern aus einer aus Feuchtgebieten gewonnenen Anreicherungskultur 

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Quelle: Tokunou, Y. et al., Elektrochemische Detektion des Deuterium-kinetischen Isotopeneffekts auf den extrazellulären Elektronentransport in Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert den Zusammenbau und Betrieb eines elektrochemischen Reaktormodells, das zur Simulation der Biofilmbildung auf Elektrodenoberflächen entwickelt wurde. Kontrollierte elektrochemische Stimulation fördert die mikrobielle Adhäsion, was zur allmählichen Entwicklung eines bakteriellen...

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Eine Technik, um Amerikanische Buche für Widerstand gegen die Buche Schildlaus (Bildschirm<em&gt; Cryptococcus fagisuga</em&gt; Lind.)

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