Name: Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung mediastinaler Lymphknoten bei Mäusen nach Injektion immunstimulierender Nanomaterialien. Diese Methode ermöglicht die Analyse der Aktivierung lymphoider dendritischer Zellen für immunologische Forschung.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch kreative Materialien-Discovery-Programm durch die National Research Foundation von Korea (NRF) finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT und Zukunft planen (NRF-2017M3D1A1039421) und Marine Biotechnologie-Programm finanziert die Ministerium der Ozeane und Fischerei, Republik Korea und einen Zuschuss (20150220).

Alle experimentelle Verfahren einschließlich tierischen Handling, Opfer und Orgel Isolierung wurden unter strikter Einhaltung der Regeln des internationalen Animal Care und Use Committee auf Shanghai Public Health Klinikum und Asan Medical Center durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde genehmigt durch die zuständigen Gremien auf die Ethik von Tierversuchen Shanghai Public Health Klinikum (Maus-Protokoll-Nummer: SYXK-2010-0098) und Asan Medical Center (2016-02-168).
1. Vorbereitung des Materials
Hinweis: Ein Nano-adjuvante, INP, bestehend aus einem selbst-zusammengebauten Lipid-DNA-Träger, nämlich U4T und CpG-Motiv mit Oligonukleotid, eCpG, wurde in der aktuellen Studie eingesetzt, um die entsprechende Injektion Route für Immuntherapie und Impfung bei Mäusen2 testen . Wichtig ist, andere mögliche therapeutische Moleküle wie Antigene, Antikörper und adjuvante Agenten für INP ersetzt werden können und getestet, mit der gleichen Methode beschrieben.
<ol><li>INP Formulierung2,4,7<ol>
<li>Tempern U4T (160 µM, Träger) mit eCpG (80 µM, mit einer TLR9-Agonist-Sequenz) im Beisein von 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und MgCl2 (2 mM). Das Standardvolumen für Glühen ist zwischen 50 und 110 µL in einem PCR-Röhrchen. Erhitzen Sie die Mischung auf 95 ° C für 10 min und dann kühlen Sie langsam ab (1 ° C/16 min.) bis 25 ° C mit einem Thermocycler. Das Glühen Protokoll erfordert ca. 2 h. Achtung: Die U4T-haltige Flüssigkeit ist sehr schaumig und muss sorgfältig behandelt werden.</li>
		<li>50 µL-Aliquots der INP-Vorbereitung zu machen; Verwenden Sie 50 µL des Materials für jede Injektion. Hinweis: Im Falle von 100 µL pro Injektion, wiederholen Sie Schritt 1.1 mit richtigen Berechnung der Zutaten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. allgemeine Tier Verfahren
Hinweis: Alternative Methoden für den Umgang mit der Mäusen können je nach Labor Anforderungen und zugelassene tierische Protokolle8verwendet werden. Der Typ von Mäusen verwendet ist 6 Wochen alten C57BL/6 und weiblichen Mäusen.
<ol><li>Liste der Materialien<ol>
<li>Bereiten Sie flüssige Narkosemittel (Isofluran), Narkose Maschine, Kohlendioxid (CO2) Inhalation Kammer, steriler Gaze, Zange, Maus Restrainer, Handschuhe, gebogenen Pinzette, sezierenden Schere 1-Zoll, 2 Zoll sezierenden Schere, Alkohol für Sterilisation und Insulin Spritzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inhalat Anästhesie Hinweis: Anästhesie ist obligatorisch für intranasale, subkutane, Straßenräuber und intravenöse Injektionen von Mäusen9. Eine Induktion-Kammer mit einem Vaporizer-Maschine und Sauerstoff-Tank angeschlossen ist für dieses Verfahren verwendet.<ol>
<li>Legen Sie das Tier in der Induktion Kammer und achten Sie darauf, den Deckel wieder fest verschließen.</li>
		<li>Fließen den Sauerstoff bei 1 L/min und die Vaporizer festlegen auf ein Niveau der Induktion von 4 % Isofluran.</li>
		<li>Variieren Sie die Belichtungszeit von Tieren in der Kammer je nach Tier Gewicht; jedoch mehr als 10 s von Exposition und alle 5 min. Überwachung ist notwendig für Anästhesie10. Hinweis: Kein Pedal Reflex zeigt erfolgreiche Narkose.</li>
		<li>Schalten Sie den Isofluran-Induktor und fließen Sie 1 L/min Sauerstoff zur Vermeidung der Exposition von Personal zu Isofluran Gas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opfer<ol>
<li>Bereiten Sie eine Kammer für CO2 Inhalation Opfer entsprechend der NIH "Richtlinien für die Sterbehilfe von Nagetiere verwenden Kohlendioxid"11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Testantwort Knebel zu bestätigen, dass das Tier vollständig geopfert wird.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass die Maus richtig geopfert wird, Kneifen die Fußspitze und keine Knebel Antwort bestätigen. Wenn es eine Antwort, wiederholen Sie Schritt 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desinfektion<ol>
<li>Desinfizieren Sie alle Flächen, die für Injektionen oder Dissektionen mit Alkohol Spray und steriler Gaze verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Orgel-Lagerung<ol>
<li>Verwenden Sie Pinzetten, um alle Fett und Blut rund um die geernteten Organe zu entfernen. Speichern Sie diese geernteten Gewebe individuell in einer Petrischale gefüllt mit 3 mL PBS. Der Container und Medien können je nach Bedarf weitere Vorgehensweise abweichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injektion Routen
<ol><li>Mithilfe der sechs Injektionsmethoden Injektion-abhängige Immunreaktionen untersuchen: oral, intranasale, subkutane, Straßenräuber, intraperitoneal, und intravenöse8,12,13.</li>
</ol>4. Isolierung von Lymphknoten und Milz
Hinweis: Verwenden Sie jung und gesund schlanke Mäuse (6 Wochen alt) für diese Verfahren, da die Fette, die in der Regel rund um die Lymphknoten bei älteren Mäusen aufbauen sind schwer zu entfernen und Visualisierung des Organs verhindern kann.
<ol><li>Pre-Ernte Schritte Hinweis: Dieser Abschnitt beschreibt die nach der Injektion Ernte der iLN, Milz und mLN von Mäusen für die Analyse der Immunstimulation. Beziehen sich auf Schritte 2,3 bis 2,5 für Opfer, gag Reaktion und Desinfektionsverfahren.<ol>
<li>Heften Sie die Glieder der Maus auf die chirurgische Dämmplatte und Sterilisieren der ventralen Seite der Maus mit 70 % Ethanol.</li>
		<li>Wählen Sie einen Standort 2 cm über den Genitalbereich und Gebrauch süchtig Zange, ziehen Sie die Abdeckung der Außenhaut wie ein Zelt. Machen Sie einen ca. 1 cm Schnitt an dieser Stelle und schieben Sie die Schere (2 Zoll) unter der Haut, Dissektion Kürzungen weiter.</li>
		<li>Für das Integument senkrecht durchschneiden Sie die Außenhaut mit beiden Armen die Schere (2 Zoll). Setzen Sie die inneren Organe mit Bauchfell überzogen.</li>
		<li>Heften Sie die äußere Schicht der Haut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolierung von den inguinalen Lymphknoten (iLN)
	<ol>
<li>Suchen Sie die iLN auf der linken Seite des Beines nach der Konjunktion des Blutgefäßes hinunter das linke Bein, das als einen geneigten Buchstaben "Y" angezeigt wird. Hinweis: Wählen Sie für subkutan injizierten Mäusen eine iLN auf der gleichen Seite des Standortes Injektion.</li>
		<li>Entdecken Sie die Schicht mit zwei Pinzetten zu zerreißen die überdachte Lipidschicht und ernten die blasse gelbe iLN (Bohnen-Form, 2 mm). Für eine nachträgliche Bearbeitung und Lagerung des Gewebes siehe Punkt 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolation der Milz 14<ol>
<li>Machen Sie ein Zelt in der Mitte des Peritoneums mittels süchtig Zange in der Hand und verwenden kleine dünne Schere (1 Zoll) in der anderen Hand das Peritoneum zu schneiden.</li>
		<li>Verwendung süchtig Zange in der linken Hand zu greifen den Darm und drehen Sie sie um, um die rote Bohne-wie Milz (Länge ca. 14 mm) an der linken oberen Seite des Bauches Maus angeschlossen zu finden.</li>
		<li>Ziehen Sie die Milz mit einem anderen Satz von Zangen in der rechten Hand vorsichtig während andere Organe mit der gebogenen Pinzette abnehmen. Folgen Sie den Schritten 2.6, die Milz zu speichern. Hinweis: Vorsicht ist beim Ernten der Milz, da es eine leicht beschädigte weiches Organ ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Isolierung der mediastinalen Lymphknoten (Mio.) Hinweis: Ist die mLN befindet sich ca. 1 cm unterhalb der Rippen und wird durch andere Organe wie Herz und Lunge. Wegen seiner Lage und der geringen Größe ist es wichtig, sorgfältig die Umgebung mit Zange und Schere (1 Zoll) aussetzen.<ol>
<li>Schneiden Sie die Membran und von den Rippen lösen. Halten Sie den Körper der Rippen mit der Pinzette und schneiden Sie die linken und rechten Seite der Rippen mit einer Schere (1 Zoll). Heften Sie die cutoff Rippen über die Maus Schulter auf der rechten Seite, das Herz und die Lunge verfügbar zu machen. Hinweis: Achten Sie darauf nicht schneiden Sie die Blutgefäße rund um das Herz und die Lunge, wie austretendes Blut es sehr schwierig macht, die winzige durchscheinende mLN zu finden. Wenn Blutgefäße geschnitten sind, absorbieren Sie sanft das Blut in der Gegend mit Gaze.</li>
		<li>Mit gebogenen Pinzette in der rechten Hand, Herz und Lunge sanft nach rechts drehen Sie bis das Rückgrat zu sehen ist. Verwenden Sie ein paar regelmäßige Zange in der linken Hand um iLN mit gebogenen Pinzette in der rechten Hand gerne bei dieser Ernte zu entfernen.</li>
		<li>Schnappen Sie sich die Lunge und flip sie bis das Rückgrat häufig ausgesetzt ist. MLN (eine transluzente bohnenförmige Struktur von etwa 2 mm Größe) befindet sich zwischen der Lunge und der Wirbelsäule.</li>
		<li>Nutzen Sie die Haken Zange, die Gegend um die mLN verfügbar zu machen und die anderen Zange um das Gewebe zu extrahieren. Hinweis: Die mLN ist umgeben von zahlreichen anderen Geweben die sorgfältig mit der Pinzette vor der Ernte entfernt werden müssen.</li>
		<li>Siehe Schritt 2.7 für Anweisungen für die Lagerung von den geernteten mLN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vorbereitung der Proben für die Durchflusszytometrie
Hinweis: Um die Aktivierung des DCs in der geernteten iLN, Milz und mLN assay, sind einzellige Suspensionen dieser Gewebe mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern als DC-spezifische Marker, co-stimulatory Moleküle und großen Histocompatibility komplexe gebeizt Moleküle und durch Durchflusszytometrie analysiert.
<ol><li>
Vorbereitung von einzelligen Suspensionen: Milz
	<ol>
<li>Fügen Sie 5 mL frisches Kulturmedium (CM hinzu) in 6 mm Kulturschale und die Proben auf Eis.</li>
		<li>Entfernen Sie umgebenden Blut und Fett Gewebe zu und das Gewebe in den Deckel der Kulturschale.</li>
		<li>Schneiden Sie das Gewebe in kleine Fragmente (< 1 mm) mit einer gebogenen Schere. Hängen Sie die Fragmente in PBS gefolgt von Spinnen das Gewebe mit Hilfe einer Zentrifuge bei 646 × g für 5 min und das Entfernen des Überstands nach unten.</li>
		<li>Die Proben wieder in 3 mL CM und verdauen Sie die Fragmente mit 200 µL Lösung 2 % fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt mit Kollagenase IV für 20 min.</li>
		<li>Schütteln und die Probe bei 37 ° C inkubieren Sie für 1 h filtern die verdaute Gewebe durch Nylon-Netzgewebe (100 nm) und drehen Sie sie nach unten. Die Einzelzellen in 5 mL PBS waschen und Entfernen des Überstands durch Zentrifugation.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie, die Zellen in 5 mL Zelle Lösung zu isolieren. Neu laden Sie eine weitere Schicht von 5 mL Lösung klar Zelle Isolierung um eine wässrige Schicht für Schicht-Stapel zu bilden.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zelle Vorbereitung 2012 × g für 10 min. erhalten der Überstand, die die leichter Dichte Bruchteil (< 1,077 g/cm3), für spätere Flow Cytometry-Analyse.</li>
		<li>Die Anzahl der Zellen mit einem Hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung von einzelligen Suspensionen: Lymphknoten
	<ol>
<li>Folgen Sie Schritt 5.1.1-5.1.2.</li>
		<li>Zugeben Sie 5 mL CM mit einer 10 mL pipettieren aussetzen der Zellen durch pipettieren 3-4 mal. Nach gründlich Aussetzung der Zellen, die Zellen für die Sammlung in einem 15 mL konische Röhrchen Filtern verwenden Sie sterile Nylon-Netzgewebe.</li>
		<li>Drehen Sie die Zellen nach unten bei 646 ×g für 7 min bei 4 ° C und entfernen Sie den überstand zu.</li>
		<li>Fügen Sie eine zusätzliche 5 mL CM in 10 mL pipettieren, besser die Zellen durch pipettieren auszusetzen.</li>
		<li>Mit PBS waschen und die Anzahl der Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Flow-zytometrie-Analyse
	<ol>
<li>Aliquoten 0,5-1 × 106 Zellen in jedem Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Rohr.</li>
		<li>Bei 646 × g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren und den überstand abgesaugt.</li>
		<li>Fügen Sie 5 µL der einzelnen verdünnt Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern Vorbereitung auf die Zellen, die Zelle Pellet und Wirbel wieder auszusetzen. Hinweis: Es ist wichtig, die Zelle Pellet aus Licht Exposition so weit wie möglich zu schützen, weil eindringmittel beschriftete Antikörper lichtempfindlich sind. Einen Antikörper-master-Mix zu generieren und immer Fc-Block hinzufügen.</li>
		<li>Bereiten Sie FACS-Puffer mit 100 µL PBS, 1 % der Hitze-inaktivierten regelmäßige FBS und 0,1 % Natriumazid vor.</li>
		<li>Legen Sie die Probe in der Röhre bei 4 ° C für 30 min. Spülen die Zellen mit 2-4 mL FACS Puffern und Zentrifugieren der Probe bei 1700 u/min für 7 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Wieder aussetzen Sie, die Zellen in 500 µL FACS-Puffer in der Dunkelheit. Analysieren Sie die Zellen, indem Sie Durchflusszytometrie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Preparation+of+dodecynyl+modified+DNA+nanoparticles+with+unmethylated+CpG+adjuvant+and+ovalbumin+for+immunostimulation%22">Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation</a>. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).</li>
<li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li>
<li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li>
<li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.7b00440">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li>
<li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li>
<li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li>
<li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://staff.unimelb.edu.au/__data/assets/pdf_file/0009/1974339/STANDARD-Anaesthesia-for-mice-and-rats-FINAL.pdf">General anesthesia of mice and rats</a>. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22">Guidelines for the Euthanasia of Animals</a>. , Veterinary Record. (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10215/compound-administration-iii">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nri1669">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Viele Fortschritte in der Nanotechnologie und Immunologie wurden durch therapeutische Forschung Drug-Delivery und Immunstimulierung erzielt. Sorgfältige Auswahl der Injektion Methode ist bekanntermaßen wichtig für Immunstimulierung, die lag der Schwerpunkt der vorliegenden Studie.
Verschiedenen Injektion Routen wurden ausgewertet, für ein natürlich ungiftig und biologisch abbaubar DNA-basierte Material, INP (immunstimulierenden Nanopartikel), um festzustellen, welchen Weg das beste Ergebnis er...

Fortschritte in der Immunologie und Nanomaterialien haben zu einer Fülle von potenziellen neuen Therapiestrategien für Anwendungen in der Biomedizin, einschließlich Drug-Delivery und Immunstimulierung geführt. Optimierung der Verwaltung Route ist ein wichtiger Aspekt betrifft die Wirksamkeit von immunstimulierenden Agenten. Ein immunstimulierenden Nanopartikel (INP) bestehend aus DNA ist eine neu entwickelte Nano-immun adjuvante selbst durch Microphase Trennung aufgrund der AMPHIPHILE Struktur der Lipid-DNA1montiert. Daher, Protokolle für INP mit Verwaltung des materiellen1 in Vivo über verschiedene Routen und drei Verfahren für die Ernte geeignete Gewebe wie die inguinalen Lymphknoten (iLN), Mediastinale LN (mLN) und Milz, beschrieben. Schließlich wurden diese Gewebe für die Aktivierung von dendritischen Zellen (DC), der mächtigsten Antigen-präsentierenden Zellen im Immunsystem analysiert. Dieses Protokoll kann auch angewendet werden, für die Bewertung der Antigene, Antikörper oder andere immun Adjuvantien-2.
Wir testeten die INP-Formulierung, weil es ein Mittel ist, das großes Versprechen gezeigt hat. INP ist ein Toll-Like-Rezeptor 9 (TLR9) adjuvante Material, die Nukleinsäuren, für die Beurteilung der Immunstimulierung Wirksamkeit erforderlich enthält ist, um verschiedene Einspritzung Methoden3zu testen. In diesem Zusammenhang ist die Stimulation des DCs einen potenten Endpunkt für in Vivo Evaluation. Nachdem Antigen oder immunstimulierenden Moleküle von DCs im peripheren Gewebe oder Blut phagozytiertes sind, Wandern diese Zellen in lymphatischen Organen wie Milz und LNs4,5. So wurde DC-Aktivierung in der Milz, iLN und mLN der injizierten Tiere analysiert. Richtig ernten dieser Gewebe ist daher auch entscheidend für die Beurteilung der Immunantwort auf eine neuartige adjuvante oder Krankheitserreger5. Solche Gewebe Ernte ist auch wichtig für die Entwicklung einer neuartigen immunologischen Methodik als Krebstherapie. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Effizienz von anderen Drogen, wie z. B. Anti-Human Immunodeficiency Virus Therapeutika6zu überprüfen.

<table><tbody><tr><td><stark>Material</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td>Waschorgane</td></tr> <tr><td>(PBS, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isofluranlösung&nbsp;</td><td>Aesica Queenborough limited</td><td>26675-46-7</td><td>Anästhesieprozess</td></tr><tr><td>Tuberkulin 1 ml Spritze -</td><td>Junglim</td><td>N/A</td><td>Injektion</td></tr><tr><td>50 mL konischer Schlauch &nbsp;</td><td>S.P.L</td><td>50050</td><td>Anästhesieprozess</td></tr><tr><td>1 ml Insulinspritze&nbsp;</td><td>(BD Ultra-FineTM&shy;II)_short Nadel</td><td>324826</td><td>Intramuskuläre Injektion</td></tr><tr><td>DMEM Hyklon mit hohem Glukosegehalt</td><td></td><td>SH30081.01</td><td>Lagerung von Organen</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>FACS-Analyse</td></tr><tr><td>Ethylalkohol wasserfrei 99,5 %&nbsp;</td><td>Daejung</td><td>4022-4110</td><td>Desinfektionsmittel</td></tr><tr><td>Ausrüstungen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FineCycler C100 (Thermocycler)</td><td>Ssufin-Anealing</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td>Zentrifuge</td></tr><tr><td>FACS Röhrchen&nbsp;</td><td>FALCON</td><td>2052</td><td>FACS-Analyse</td></tr><tr><td>Automatisiertes Hochleistungs-Durchflusszytometer</td><td>BD (USA), FACSVerse-FACS-Analyse</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

immunstimulierenden agent bewertung: lymphatischen gewebe extraktion und injektion route-dependent dendritische zelle aktivierung

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Für die Bewertung der neuen Therapeutikum für Immuntherapie oder Impfung ist Analyse der immun-Zell-Aktivierung in lymphatischen Geweben unerlässlich. Hier untersuchten wir immunologische Effekte von einem neuartigen Lipid-DNA immunstimulierende Nanoparticle Form aus verschiedenen Verwaltung Routen in der Maus: oral, intranasale, subkutane, Straßenräuber, intraperitoneale und intravenöse. Diese Injektionen direkt beeinflussen, die Immunantwort und Ernte lymphatische Geweben und Analyse von dendritischen Zellen (DC) Aktivierung in den Geweben sind wichtige Teile dieser Bewertungen. Die Gewinnung von mediastinalen Lymphknoten (mLNs) ist wichtig aber recht komplex aufgrund der Größe und Lage dieses Organs. Eine schrittweise Vorgehensweise für die Ernte der inguinalen Lymphknoten (iLN), mLN und Milz und Analyse von DC-Aktivierung durch Durchflusszytometrie wird beschrieben.

Um entsprechende Injektion Routen von INP für die Aktivierung des lymphatischen Gewebes DC zu bewerten, die DC-Bevölkerung als Linie wurde definiert als –CD11c+ Zellen in der Milz, iLN und mLN und analysiert den Ausdruck Niveaus von co-stimulatory Molekülen. Behandlung von INP durch subkutane (s.c.) und intravenös (i.v.) Injektion gefördert erhebliche Erhöhungen der CD40, CD80 und CD86 Ausdruck in der Milz und iLN DCs (Abb. 2 b<...

Experimentelle Verfahren für die spätere Gewinnung von lymphatischen Gewebe, lymphatischen Dendritische Zelle Aktivierung testen werden nach der Behandlung eine immunstimulierende Nanomaterials beschrieben.

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die einzigartige Technik vertraut zu machen, die bei der Isolierung des mediastinalen Lymphknotens von Mäusen erforderlich ist. Die Operation wurde nach der Injektion von Immunstimulanzienmaterial auf sechs verschiedenen Routen bei Mäusen durchgeführt. In dieser Studie haben wir eine neue Klasse von Materialien verwendet, die nanogroße Strukturen bilden.Tenside bestehen aus hydrophiler Kopfgruppe und hydrophobem Schwanz. Diese bilden sphärische Micelle oder andere sekundäre Struktur aufgrund der Mikrophagentrennung. Wir nutzten diese Eigenschaft zu einem Bio-Makromolekül, das DNA ist.DNA-Amphiphile, hier gezeigt, als regelmäßige Nukleotide wie A, C, G, T, hat hydrophile Blöcke, während lipidmodifizierte Neurozellnukleobasen als hydrophobe Einheiten fungieren. Das modifizierte Oligo wurde durch DNA-Synthesizer in großen Octogrammen synthetisiert. In Äquimedien bilden die amphiphilen Lipid-DNAs spontan nanogroße sphärische Mizellen.Bei der Bildung von Micelle bleibt die DNA als leerer Träger mit einem Durchmesser von etwa 10 Nanometern einsam. Um den Träger mit Immunstimulanzien auszustatten, ist es einfach, die DNA-Sequenz mit einem toll-ähnlichen Rezeptor neun adjuvanten, nämlich eCpG, zu erweitern. Lipid-DNA und eCpG-Basis wird hier daher die äußere Oberfläche von Micelle mit CpG-Sequenz abgebaut.Wir nennen dieses immunstimulierende Nanoteilchen dann DAS INP. Um den richtigen Weg von INPs für die Immunantwort zu bestimmen, injizierten wir INPs an Mäuse in 64 Injektionsrouten und folglich wurde ein richtiges Lymphknotengewebe analysiert. Für eine ausführlichere Injektionsanleitung finden Sie einen JOB-Artikel, der 2012 von Charles River veröffentlicht wurde.Der Hauptvorteil dieses Videos ist, visuell zu zeigen, wie man mediastinalen Lymphknoten erhält. Das Video zeigt explizit die Lage des mediastinalen Lymphknotens, die viele Menschen bei der Isolierung der Organe nur schwer isolieren können. Alle Experimente wurden nach den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee am Shanghai Public Health Clinical Center oder der University of Ulsan College of Medicine durchgeführt.Dieser Teil zeigt die spezifische Lage von Organen oder Geweben, die für die immunologische Analyse von entscheidender Bedeutung sind. Milz und zwei Lymphknoten werden isoliert. Zunächst wurden Mäuse durch die Euthanasie in Kohlendioxid-Inhalation geopfert, und alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden so gering wie folgt an die Anleitung des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung zu halten.Von nun an wollen wir die Organe finden und isolieren. Fixieren Sie zunächst die Maus auf dem Operationstisch mit vier Pins auf der Handfläche der Maus. Sterilisieren Sie den Sezierenbereich mit Alkohol.Sezieren Sie die äußere Abdeckung der Unterseite des Mausbauchs mit einer großen Schere. Verwenden Sie Zangen, um die beiden Seiten der Befestigung zu öffnen und mit Stiften auf dem Operationstisch zu fixieren. Die Position des Leistenlymphknotens wird durch die Suche nach der Konjunktion des Gefäßes, das in Richtung des linken Beins geht, exponiert.Die Form des Gefäßes sieht aus wie der gekippte Alphabetbuchstabe Y.Undecken Sie die Schicht mit den Zangen und ziehen Sie sie von der Haut. Schneiden Sie das Peritoneum mit einer kleineren Schere, um innere Organe freizulegen. Bewegen Sie den Darm nach rechts, indem Sie Zangen verwenden und dann in geformte Milz wickeln, die auf der linken oberen Seite des Bauches zeigen.Zusätzliche Aufmerksamkeit ist während des Verfahrens erforderlich, da Milz leicht zu stören ist. Schließlich der Kernpunkt dieses Videos: Ernte mediastinaler Lymphknoten. Es befindet sich unter der oberen Seite der Lunge, die aufgrund ihrer geringen Größe und etwas versteckten Lage schwer zu sehen ist.Bedecken Sie den Bereich vorsichtig mit einer kleinen Schere und Zange. Schneiden Sie beide Seiten der Rippen und der Membran sowie. Clip die abgeschnittenen Rippen über der Brust.Während des Eingriffs vermeiden Sie schädliche Herz- und Blutgefäße, da es die Stelle blenden könnte, den transluzenten mediastinalen Lymphknoten zu finden. Wenn durch Zufall das Blutgefäß platzt, wischen Sie das Blut vorsichtig mit Gaze aus. Schnappen Sie sich die linke Seite der Lunge und drehen Sie sie sanft auf die andere Seite, um unter der Lunge zu sehen.Ziehen Sie den mediastinalen Lymphknoten mit Zangen hoch. Nach der Ernte des mediastinalen Lymphknotens, stellen Sie sicher, dass das gesamte Fett und Blut, das den Lymphknoten umgibt, perfekt entfernt werden, da unerwünschtes Gewebe die Analyse beeinflussen kann. Schließlich alle isolierten Organe auf einer Petrischale mit Medien gefüllt.Insgesamt 0,1 mal 10 bis zu den sechsten Zellen wurden an dieser Durchflusszytometrie analysiert. Basierend auf Kraft getter und Größe getter LeukozytenPopulation wurde abgezäut und dass Zellen durch dunkle Färbung ausgeschlossen wurden. 24 Stunden nach der INP-Injektion durch 64 Injektionswege wurden Milz, Leistenlymphknoten und mediastinaler Lymphknoten geerntet und die DC-Aktivierung durch Durchflusszytometrie analysiert.Basierend auf der Strategie der Durchflusszytometrie wurde die DC-Population als CD11C-positive und Abstammungsnegative Zellen in der lebenden Leukozyten definiert. Insbesondere förderte die intranasale Injektion von INP signifikante Erhöhungen der CD40, 80, 86-Expression im mediastinalen Lymphknoten im Vergleich zu PBS für die Kontrolle. Daher legten diese Daten nahe, dass die intranasale Injektion von INP als schleimhautadjuvant zur Verbesserung der Immunität in der Lunge verwendet werden kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine Methode zur Umwandlung von dendritischen Zellen (DCs) in tolerogene DCs (TolDCs) mit einem immunmodulatorischen pharmakologischen Wirkstoff. Diese Umwandlung wird durch die Bewertung der TolDC-Funktion durch ihre immunsuppressive Wirkung auf CD4+ T-Zellen bestätigt.

Wirkung eines immunmodulatorischen pharmakologischen Wirkstoffs auf die Interaktion zwischen dendritischen Zellen und CD4+ T-Zellen

Das am häufigsten verwendete Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von autologen dendritischen Zellen (DCs) zur Verwendung bei Tumor-Immuntherapie beschrieben. Das Verfahren nutzt IL-4 und GM-CSF zu DCs aus Monozyten differenzieren. Die unreifen DCs sind, um zu reifen und dann mit Antigenen beladen stimuliert, bevor sie zurück in den Patienten injiziert werden.

Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

Prophylaktischen und therapeutischen Impfung oft nicht starke Immunantworten aufgrund Woche Entwässerung des Impfstoffs zu stimulieren, um Knoten und folglich schlechte Beteiligung von Immunzellen Lymphe. Durch direkte Injektion des Impfstoffes in Lymphknoten, sogenannte intralymphatischer Injektion, die Wirksamkeit des Impfstoffes kann stark verbessert werden, und Impfstoffdosen verringert werden.

Intralymphatische Immuntherapie und Impfungen bei Mäusen

Unreife dendritische Zellen können selektiv in tolerogene oder reife dendritische Zellen differenziert werden, um das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz zu regulieren. Diese Arbeit stellt eine Möglichkeit vor, aus unreifen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) in vitro tolerogene und reife moDCs zu generieren, die sich in metabolischen Phänotypen unterscheiden.

Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur in Vivo Bestimmung der naiven CD4-T Zellaktivierung (T Cell), Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch GM-CSF Knochenmark (BM)-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus beschreibt dieses Protokolls BM und T-Zellen isoliert, DC-Generation und DC und T-Zell-Adoptiv-Transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Die Tranmmunisierung (TI) Gerät oder Platte und verwandte Protokolle wurden entwickelt, um die wichtigsten Merkmale der extrakorporalen Photochemotherapie (ECP) zu replizieren, in einem experimentellen Umfeld, die die Produktion von physiologisch aktivierten, tausenfähigen dendritischen Zellen (DCs) für die Krebs-Immuntherapie.

Neuartiges Protokoll zur Generierung physiologischer immunogener Dendritischer Zellen

Die Methodik beschreibt die Generierung von bovinen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDCs) und deren Anwendung für die In-vitro-Evaluierung von Antigenkandidaten während der Entwicklung potenzieller veterinärmedizinischer Impfstoffe bei Rindern.

Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit pharmakologischer Wirkstoffe, tolerogene dendritische Zellen aus naiven Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro zu generieren und ihre Wirksamkeit durch autologe regulatorische T-Zell-Generierung zu validieren.

Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14+ -Monozyten

Erfahren Sie die Isolierung mediastinaler Lymphknoten bei Mäusen nach Injektion immunstimulierender Nanomaterialien. Diese Methode ermöglicht die Analyse der Aktivierung lymphoider dendritischer Zellen für immunologische Forschung.

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung (Video) | JoVE Journal

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

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