Name: Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Differenzierung von hPSCs zu PDX1+ Bauchspeicheldrüsen-Vorläuferzellen mittels Monolayer-Kultur. Diese Methode ermöglicht homogene Zellpopulationen für Stammzellforschung.

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Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt durch die Finanzierung der Japan Society für die Förderung von Science (JSPS) durch Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 und 18 K 08510) t.t. und Beihilfe für JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant-Nummer 17J07622), a.k., und die Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) durch seine Forschung gewähren "Core Center für iPS Zellforschung, Research Center-Netzwerk für die Realisierung der regenerativen Medizin" K.O. Die Autoren danken Dr. Peter Karagiannis für das Manuskript zu lesen.

Experimente mit hPSCs wurden von der Ethikkommission der Abteilung für Medizin und Graduate School of Medicine, Universität Kyoto genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien
Hinweis: Bereiten Sie alle Medien und Reagenzien für die Zellkultur in einer sterilen Umgebung. Wärmen Sie base Nährmedien auf Raumtemperatur (RT) vor dem Gebrauch. Medium für Differenzierung innerhalb 6 h bei RT. Details der Reagenzien verwendet wird finden Sie in Tabelle der Materialien.
<ol><li>
Differenzierung (Abbildung 1A)
	<ol>
<li>Stufe 1A Medium: Transfer RPMI 1640 Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie die serumfreien Ergänzung, Activin A, CHIR99021 und Y-27632 zu einer Konzentration von 100 ng/mL, 1 X, 3 μM und 10 μM bzw..</li>
		<li>Stufe 1 b Medium: Transfer RPMI 1640 Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Die serumfreien ergänzen, Activin A und CHIR99021 zu einer Konzentration von 100 ng/mL, 1 X, ≤1 μM bzw. hinzufügen. Hinweis: Die Konzentration der CHIR99021 sollte niedriger sein als im Stadium 1A Medium und Zusatz ist nicht notwendig, aber es erhöht die Anzahl von Zellen.</li>
		<li>Stufe 2 Medium: Transfer verbessert MEM (iMEM) Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie die serumfreien Ergänzung und Keratinozyten Wachstumsfaktor (KGF) zu einer Konzentration von 0,5 x und 50 ng/mL, beziehungsweise.</li>
		<li>Stufe 3 Medium: iMEM Übertragungsmedium in ein Rohr mit einer Pipette. Hinzufügen die serumfreien Beilage, KGF, Birne, 3-Keto-N-Aminoethyl-N'- Aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine (CYC) und 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic Säure (TTNPB) mit Pipette, Konzentrationen von 0,5 X, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM und 10 nM, beziehungsweise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Durchflusszytometrie (FCM)
	<ol>
<li>1 x Permeabilisierung/Waschpuffer: Transfer Wasser in ein Gefäß mit einer Pipette. Eine Konzentration von 1 X Permeabilisierung/Waschpuffer durch eine Pipette hinzufügen.</li>
		<li>FCM blockiert Lösung: Transfer 1 x Permeabilisierung/Waschpuffer in ein Rohr mit einer Pipette. Esel Serum mit einer Pipette zu einer Konzentration von 2 % (Vol/Vol) hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining
	<ol>
<li>Blockieren Lösung: Transfer Dulbecco Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie Esel Serum und Triton X Pipette zu einer Konzentration von 5 % (Vol/Vol) und 0,4 % (Vol/Vol), beziehungsweise.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) hPSC Differenzierung zum hinteren Foregut Zellen/Bauchspeicheldrüsen Stammväter (PDX1+ Zellen)
Hinweis: Durchführen Sie alle Verfahren mit sterile Techniken. hPSCs werden bei 6-Well-Platten beschichtet durch eine synthetische Oberflächenmaterial für hPSCs mit hPSC Wartung Medium entsprechend des Herstellers Anweisungen17,26beibehalten. Wenn Zellen erreichen 50-80 % Konfluenz (Stufe 0) verwenden sie zur Differenzierung.
<ol><li>
Bereiten Sie Basalmembran Matrix-beschichteten Platten.
	<ol>
<li>Transfer 6 mL RPMI 1640 (4 °C) in einem Rohr auf 4 °C auf Eis gekühlt. Fügen Sie 2 mg der Basalmembran Matrix (4 °C) mit gekühlten 1 mL-Pipettenspitzen und mischen Sie gut durch sanfte Pipettieren um 0,33 mg/mL Basalmembran Matrix zu machen.</li>
		<li>2 mL der verdünnten Basalmembran Matrix Transfer in jede Vertiefung des 6-Well Zellplatten Kultur mit einer Pipette. Legen Sie die Platten bei 37 °C für 60-90 min. im Inkubator. Danach halten Sie die Platten bei RT bis zur Verwendung (innerhalb von 3 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Samen Sie der hPSCs und initiieren Sie Differenzierung zum endgültigen Entoderm (Stadium 1A) zu.
	<ol>
<li>Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL 0,5 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (RT) pro Bohrloch mit Pipette, die hPSCs in der 6-Well-Platten kultiviert zu waschen.</li>
		<li>Aspirieren Sie 0,5 mM EDTA und 2 mL 0,5 mM EDTA pro Bohrloch mit Pipette. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 5 min.</li>
		<li>Aspirieren 0,5 mM EDTA und 1 mL hPSC Wartung Medium bei RT ergänzt mit 10 μM pro von Pipette gut Y-27632. Pipette vorsichtig, aber schnell zum Abblasen der angeschlossenen Zellen auf den Tellern und aufgehäuften Zellen in einzelne Zellen zu trennen. Die Zellsuspension nicht beim Pipettieren Blase.</li>
		<li>Übertragen die Zellsuspension in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 4 mL hPSC Wartung Medium bei RT mit 10 μM ergänzt Y-27632. Pipette vorsichtig die Zellsuspension.</li>
		<li>Zählen Sie die Anzahl von Zellen in der Zellsuspension mit dem Trypan blau Fleck-Ausschluss-Verfahren.<ol>
<li>Mix 15 μl Zellsuspension und 15 μl Trypan blau in einem Rohr.</li>
			<li>10 μL der Zellsuspension verdünnt mit Trypan blau auf Zelle zählen Folien in zweifacher Ausfertigung mit einer 10 μl Pipette zu übertragen.</li>
			<li>Zählen Sie die Zelle Nummer mit einem automatischen Zelle Zähler zu und rechnen Sie die Zelldichte in der Zellsuspension. Rentabilität ist in der Regel > 98 %.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquoten die Zellsuspension in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen bei 1-1,5 x 106 Zellen pro Bohrloch des 6-Well-Platten (1-1,5 x 105 Zellen/cm2).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die 50 mL-Tube mit 200 X g bei RT 5 min.</li>
		<li>Den Überstand mit einer Pipette abzusaugen und die Zellen mit 1 mL der Stufe 1A Medium (RT) pro Bohrloch Aufschwemmen. Sanft die Zellsuspension pipette und ein weiteres 1 mL Stufe 1A Medium (insgesamt, 2 mL pro Well).</li>
		<li>Aspirieren Sie die verdünnte Basalmembran Matrix in den Vertiefungen der die Zellplatten Kultur von einer 1.000 μl Pipette im Schritt 2.1.2 vorbereitet. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.</li>
		<li>Sanft pipette die Zellsuspension in Schritt 2.2.8 wieder. Sofort nach dem Mischen übertragen Sie die Zellsuspension (2 mL) in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Abdeckplatte mit einer Alu-Folie auf die Platte vor Licht zu schützen. Legen Sie die Platte in den sauberen Werkbank bei RT für 10-15 min. Hinweis: Bewegen Sie die Platte nicht nach der Aussaat.</li>
		<li>Legen Sie die Platte vorsichtig in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator (feuchte Atmosphäre) und Kultur für 24 h. Hinweis: Schütteln Sie die Platte nicht nach der Aussaat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzieren Sie die Differenzierung in endgültige Entoderm (Stufe 1 b).
	<ol>
<li>Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS in die Vertiefungen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal. Hinweis: Um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage entfernen, schütteln Sie vorsichtig die Platte vor jedem Anspruch.</li>
		<li>Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit einer Pipette und 4 mL Stufe 1 b Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte vorsichtig in 37 °C Inkubator (feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 48 h.</li>
		<li>Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal. Hinweis: Entfernen Sie die abgestorbenen Zellen aus der Monolage durch sanftes Schütteln vor jedem Anspruch.</li>
		<li>Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 1 b Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte vorsichtig in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzieren Sie die Differenzierung in den primitiven Darm Rohr (Stufe 2).
	<ol>
<li>Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Hinweis: Entfernen Sie die abgestorbenen Zellen der Monolage durch sanftes Schütteln vor jedem Anspruch.</li>
		<li>Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 2 Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 4 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzieren die Differenzierung in PDX1+ Zellen (Stufe 3).
	<ol>
<li>Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.</li>
		<li>Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 3 Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 3 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Die Differenzierung in endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse zu induzieren.
	<ol>
<li>Führen Sie NKX6.1+ Zelle Induktion (Stufe 4, für 8 Tage) gefolgt von endokrinen Zellen Induktion (Stufe 5, 12 Tage) mit den zuvor beschriebenen Protokolle3,16,26. Charakterisieren und die endokrine Zelldifferenzierung Immunostaining und quantitative Real-Time reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) Analyse zu überprüfen. Hinweis: Beziehen sich auf Toyoda Et Al.16 und Kimura Et Al.26 für detaillierte experimentelle Verfahren. Primer-Sequenzen für die qRT-PCR-Analyse finden Sie unter Tabelle 1 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Durchflusszytometrie (FCM)
<ol><li>Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL 0,5 mM EDTA zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Aspiration und Zugabe von 0,5 mM EDTA ein Mal. Hinweis: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage Zellen vor jedem Anspruch zu entfernen.</li>
	<li>Trennen der Zellen (ca. 3-6 × 106 pro Bohrloch), fügen Sie 2 mL von 0,25 % Trypsin mit 0,5 mM EDTA pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für ca. 5-10 min.</li>
	<li>Pipette vorsichtig, aber schnell zu distanzieren aufgehäuften Zellen in einzelne Zellen. Die Zellsuspension nicht beim Pipettieren Blase.</li>
	<li>Fügen Sie ca. 8-10 mL Basis Medium (RPMI 1640 oder iMEM, RT) mit 0,5 x serumfreien Ergänzung und 10 μM Y-27632 pro gut und mischen die Zellsuspension. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g bei RT 5 min.</li>
	<li>Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen mit 2 mL 0,5 mM EDTA (RT). Pipette vorsichtig die Zellsuspension.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g bei RT 5 min.</li>
	<li>Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der Fixierung und Permeabilisierung Puffer pro 106 Zellen unter einer Haube. Pipette vorsichtig die Zellsuspension unter einer Haube. Halten Sie das Rohr bei RT für 30 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT 5 min.</li>
	<li>Aspirieren des Überstands unter eine Haube und Aufschwemmen der Zellen mit 500 μL FCM blockiert Lösung pro 106 Zellen. Pipette vorsichtig die Zellsuspension. Halten Sie das Rohr bei RT für 30 min.</li>
	<li>50 μL der Zellsuspension auf ein Rohr (ca. 1 x 105 Zellen) übertragen. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der verdünnten Primärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) in FCM blockiert Lösung und inkubieren Sie bei 4 °C für > 16 h.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT für 5 min. Überstand zu entfernen und die Zellen mit 180 μL von 1 x Perm/Waschpuffer aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der verdünnten Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) in FCM Lösung blockiert. Inkubation der Zellen bei RT 60 min oder bei 4 °C für > 16 h mit Lichtschutz.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT für 5 min. Überstand zu entfernen und die Zellen mit 180 μL von 1 x Perm/Waschpuffer aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen mit 180 μL von 2 % Esel Serum in DPBS.</li>
	<li>Filtern Sie die Zellsuspension durch Übertragung auf eine 5 mL Runde Polystyrol Unterrohr mit einer Zelle Sieb (35 µm-Nylon-Mesh) und halten Sie bei 4 °C mit Schutz vor Licht bis die Analyse.</li>
	<li>Einen Teil der positiv gefärbten Zellen durch einen Flow Cytometer27zu analysieren.</li>
</ol>4. Immunostaining
<ol><li>Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal. Hinweis: Schütteln Sie die Platte, um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage Zellen vor jedem Anspruch zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) (4 °C) pro Bohrloch mit Pipette unter einer Haube. Halten Sie die Platte bei 4 °C für 20 Minuten.</li>
	<li>Der PFA mit Pipette unter eine Haube zu entfernen. Geben Sie 2 mL des DPBS bei RT in der Pipette unter einer Haube. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.</li>
	<li>Fügen Sie 2 mL der blockierenden Lösung pro Bohrloch und lassen für 30 min bei RT.</li>
	<li>Aspirieren Sie die gebrauchte Lösung und 1 mL Primärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) Lösung pro Bohrloch zu blockieren. Inkubation bei RT 60 min oder bei 4 °C für > 16 h.</li>
	<li>Aspirieren der verwendete Lösung, fügen Sie 2 mL des DPBS mit 0,4 % Triton x-100 und 10 min. wiederholen das Streben, Zugabe von Lösung und Inkubation einmal bei RT inkubieren.</li>
	<li>Aspirieren Sie die gebrauchte Lösung und 1 mL Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) Lösung pro Bohrloch zu blockieren. 60 min mit Lichtschutz bei RT inkubieren.</li>
	<li>Aspirieren der verwendete Lösung, fügen Sie 2 mL des DPBS mit 0,4 % Triton x-100 (RT) und 5 min mit Lichtschutz bei RT inkubieren. Wiederholen Sie das Streben, Zugabe von Lösung und Inkubation zwei Mal.</li>
	<li>Nehmen Sie Mikrographen, die Differenzierung Effizienz unter einem Fluoreszenz-Mikroskop-28zu untersuchen.</li>
</ol>

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<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Generation der PDX1+ Zellen besteht aus mehreren Schritten; Daher ist es wichtig, Zellen zu gegebener Zeit zu behandeln. Unter den Schritten der Induktion Effizienz der endgültigen Entoderm wirkt sich weitgehend auf die endgültige Induktion Effizienz, möglicherweise durch Interferenzen von anderen kontaminierenden Abstammung-Zellen (d. h. Mesoderm und Ektoderm), die vermehren sich und/oder absondern können Faktoren, die die spezifische Differenzierung zu stören. Wenn der Anteil der SOX17+ Zellen...

Die Bauchspeicheldrüse besteht hauptsächlich aus exokrinen und endokrinen Zellen, und seine Dysfunktion oder Überlastung verursacht mehrere Krankheiten wie Pankreatitis, Diabetes und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Um die Pathogeny des Pancreatopathy zu erhellen, ist es notwendig, den Entwicklungsprozess und die Funktion von Zellen der Bauchspeicheldrüse zu analysieren. Darüber hinaus ist eine stabile Zelle Versorgung mit robuste Qualität herstellen Zellgewebe/Supplementierung Therapie erforderlich. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für diese Zwecke, und die Differenzierung Protokoll gegen Zellen der Bauchspeicheldrüse wurde intensiv studierte1,2,3, 4. Die jüngsten Fortschritte bei der in-vitro-Erzeugung von pankreatischer β-Zellen imitieren die Generation der β-Zellen bei erwachsenen Menschen, und diese Zellen zeigen therapeutische Wirksamkeit bei der Implantation in diabetischen Modell Mäuse2,3. Darüber hinaus ergab die Analyse der β-Zellen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von gesunden und Typ 1 Diabetes Patienten Spender generiert keine funktionalen Unterschiede, auch wenn Sie unter Stress5. Darüber hinaus wurden Krankheit Phänotypen in induzierte Pankreaszellen mit Patienten abgeleitet iPSCs oder hPSCs beherbergen genetische Mutationen am gleichen Standort wie die Patienten6,7teilweise reproduziert.
Um Zellen der Bauchspeicheldrüse aus hPSCs erstellen, wird schrittweise gezielte Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert verwendet. Die Bauchspeicheldrüse leitet sich aus dem Entoderm Layer des frühen Embryos, die Geschlecht-Bestimmung von Region Y-Box 17 (SOX17) zum Ausdruck bringt und Forkhead Box A2 (FOXA2)8. Basierend auf den Studien an Mäusen, bildet die endodermische Schicht der primitiven Darm-Schlauch, der durch den Ausdruck der Hepatozyten nuklearer Faktor 1-Beta (Hnf1β) und Hepatozyten nuklearer Faktor 4-Alpha (Hnf4α) gekennzeichnet ist. Das primitive Darm Rohr verlängert und in die Atemwege Gerät, Verdauungstrakt und Organe entwickelt. Nach Dehnung, der hinteren Foregut Bereich wird der mutmaßlichen Pankreas Region, wie durch den Ausdruck der transcriptional Faktor Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1 (PDX1)8,9,10markiert. Die dorsalen und ventralen Teil der PDX1+ Darm Rohr verdicken, Form pankreatischen Knospen, die durch die Co Ausdruck der Bauchspeicheldrüse Transkription Faktor 1 Untereinheit Alpha (PTF1A) und NK6 Homeobox 1 (NKX6.1)8,11gekennzeichnet sind. Dieser Ausdruck beginnt morphologische der pankreatischen Organogenese. Pankreas Entoderm Zellen, die Komponenten der pankreatischen Knospen sind, bilden ein verzweigtes röhrenförmigen Netz von epithelialen Strukturen12 und schließlich in exokrinen und endokrinen Zellen, einschließlich der β-Zellen Insulin-sezernierenden differenzieren und Glukagon-sezernierenden α-Zellen. Ausdruck der PDX1 ist zunächst der mutmaßlichen Pankreas Region erkannt wird dann während der gesamten Bauchspeicheldrüse Entwicklung beobachtet und zeigt Lokalisierung zu β und δ-Zellen9,13,14. Obwohl die Pdx1+ Zelle Bereich, der nicht Ptf1a oder Nkx6.1 zum Ausdruck bringt unterscheidet in den Magen Antrum, Zwölffingerdarm, extrahepatische Gallenwege und einige Darmzellen bei mittleren bis späten Stadium der Entwicklung in Mäusen9PDX1+ Zellen gelten als Vorfahren der Bauchspeicheldrüse in der frühen Entwicklungsphase beim Menschen.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen für die Erzeugung von Pankreas Abstammungen. Die Protokoll Eingeweihten Differenzierung durch impfen dissoziiert Einzelzellen15,16,17. Im Allgemeinen sind undifferenzierte hPSCs als Kolonien oder Zelle Aggregate in der Schwebe oder Adhäsion gepflegt. Infolgedessen initiieren die meisten Protokolle die Differenzierung kurz nach Passagierung Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für räumliche und transkriptionelle Heterogenitäten18,19,20,21,,22, die behindern könnten die erster Differenzierung Schritt zur endgültigen Entoderm gefolgt von ineffizienten Differenzierung nach PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll kann einfache Handhabung zur Verbesserung und Stabilisierung der Differenzierung Effizienz bieten einige hPSC-Linien, die bisher gefunden wurden, ineffizient, endodermische Linien und PDX1 unterscheiden+ Zellen23, 24 , 25.

<table><tbody><tr><td>3-Keto-N-aminoethyl-N&prime;-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamin</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>K171000</td><td>CYC</td></tr><tr><td>4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoe</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-203303</td><td>TTNPB</td></tr><tr><td>50 mL Konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CDX2 Antikörper [EPR2764Y]</td><td>Abcam</td><td>Ab76541</td><td>Anti-CDX2, &mal 1/1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung (50 &mal;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>Serumfreies Nahrungsergänzungsmittel</td></tr><tr><td>BD FACSAria II Zellsortierer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Biomedizinischer Gefrierschrank</td><td>SANYO</td><td>MDF-U538</td><td>Für -30 &deg; C Lagerung</td></tr><tr><td>Objektträger für die Zellzählung für TC10/TC20 Zellzähler, Zweikammer</td><td>BIO-RAD</td><td>1450011</td><td>Zählobjektträger</td></tr><tr><td>Glas ZELLKULTUR MULTIWELL-PLATTE, 6 WELL, PS, KLAR</td><td>Greiner bio-one</td><td>657165</td><td>Für Differenzierungskulturen/6-Well-Platte</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>TOMY</td><td>AX-310</td><td>Für die Zellkultivierung</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>TOMY</td><td>MX-305</td><td>Für RT-qPCR</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>CLEAN BENCH</td><td>SHOWA KAGAKU&nbsp;</td><td>S-1601PRV</td><td>Clean</td></tr><tr><td>bench Corning CellBIND 6-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Für die feederfreie Kultur von hPSCs/6-Well-Platte</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basalmembran-Matrix-Wachstumsfaktor reduziert</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Basalmembran-Matrix</td></tr><tr><td>Corning Synthemax II-SC Substrat</td><td>Corning</td><td>3535</td><td>Für die feederfreie Kultur von hPSCs/synthetischem Oberflächenmaterial für hPSCs</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>Leica CM1510 S</td><td>Zur Immunfärbung von Aggregaten.</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td>Perm/Wash Puffer ist&nbsp; Permeabilisierung/Waschpuffer. Cytofix/Cytoperm-Puffer ist ein Fixierungs- und Permeabilisierungspuffer.</td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Für die Immunfärbung von Aggregaten</td></tr><tr><td>dNTP-Mix (10 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427-088</td><td>Für RT-qPCR</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Sekundärantikörper, &times 1/500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td>Sekundärantikörper, &times 1/500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Sekundärantikörper, &times 1/500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Esel Serum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td>Esel Serum</td></tr><tr><td>D-PBS(-) ohne Ca oder Mg</td><td>Nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Für die Feeder-freie Kultivierung von hPSCs/hPSC-Erhaltungsmedium</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Zellsieb Schnappkappe</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>5 mL Polystyrolröhrchen mit rundem Boden und Zellsieb</td></tr><tr><td>Filterspitze, 1.000 & micro; L</td><td>Watoson</td><td>124-1000S</td><td>Verwendung zusammen mit Pipetten</td></tr><tr><td>Filterspitze, 20 & Mikro; L</td><td>Watoson</td><td>124-P20S</td><td>Verwendung zusammen mit Pipetten</td></tr><tr><td>Filterspitze, 200 & Mikro; L</td><td>Watoson</td><td>124-P200S</td><td>Verwendung zusammen mit Pipetten</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td>Für die Immunfärbung</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370A</td><td>Inkubator</td></tr><tr><td>HNF-1&beta; Antikörper (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7411</td><td>Anti-HNF1&beta;, &times 1/200 Verdünnung</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha; Antikörper (H-171)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8987</td><td>Anti-HNF4&alpha;, &mal 1/200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Für die Zellkernfärbung, &mal 1/200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Menschliche Bauchspeicheldrüse Gesamt-RNA</td><td></td><td>Ambion AM7954</td><td>Für RT-qPCR</td></tr><tr><td>Humane PDX-1/IPF1 Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>AF2419</td><td>Anti-PDX1, Ziegen-IgG, &times 1/200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Humane SOX17 Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>Anti-SOX17, &times 1/200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Verbessertes MEM Zink Option Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10373-017</td><td>iMEM</td></tr><tr><td>Inkubationskammer</td><td>Cosmo Bio</td><td>10DO</td><td>Für die Immunfärbung von Aggregaten</td></tr><tr><td>Latex Untersuchungshandschuhe</td><td>Adachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS beschichtetes Objektträgerglas</td><td>Matsunami Glas</td><td>83-1881</td><td>Für Immunfärbung von Aggregaten</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96-Well-Reaktionsplatte</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td>Für RT-qPCR-Mikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>CKX41N-31PHP</td><td>Für die Zellkultivierung</td></tr><tr><td></td><td>Microtube Watoson</td><td>131-515CS</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonales Anti-&Alpha;-Fetoprotein</td><td>SIGMA</td><td>A8452</td><td>Anti-AFP, &times 1/200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>für RT-qPCR</td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>FASMAC</td><td>Maßgeschneidertes Oligo</td><td>Für die RT-qPCR ist die Sequenz "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, Pulver</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td>PFA, Fixiermittel, verdünnt in DPBS</td></tr><tr><td>Pharmazeutischer Kühlschrank</td><td>SANYO</td><td>MPR-514</td><td>Für 4 &deg; C Lagerung</td></tr><tr><td>von PIPETMAN P&nbsp;</td><td>GILSON</td><td></td><td>Pipette</td></tr><tr><td>Rekombinante humane KGF/FGF-7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td>KGF</td></tr><tr><td>Rekombinant Mensch Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td>NOGGIN</td></tr><tr><td>Rekombinant Mensch/Maus/Ratte Aktivin A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>ReverTra Ace (100 U/&mu; L)</td><td>TOYOBO</td><td>TRT-101</td><td>Für RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNase-freies DNase-Set (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>Für RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>Für RT-qPCR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 mit L-Gln</td><td>Nacalai tesque</td><td>30264-85</td><td>RPMI 1640</td></tr><tr><td>Versiegelungsfolie für Echtzeit</td><td>Takara</td><td>NJ500</td><td>Für serologische RT-qPCR-Pipetten</td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4488</td><td>Für die Zellkultivierung</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten 25 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4489</td><td>Für die Zellkultivierung</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten 5</td><td>mL Costar/Corning</td><td>4487</td><td>Für die Zellkultivierung</td></tr><tr><td>Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td><td>Zellsignalisierung</td><td>3579S</td><td>Anti-SOX2, &times 1/200 Verdünnung</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Wissenschaftlich</td><td></td><td>für RT-qPCR</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td>Für die Immunfärbung von Aggregaten</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II&nbsp;</td><td>Takara</td><td>RR820B</td><td>für RT-qPCR</td></tr><tr><td>TC20 Automatisierter Zellzähler</td><td>BIO-RAD</td><td>1450101J1</td><td>Automatischer Zellzähler</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Verbindung 4583&nbsp;</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td>Für die Immunfärbung von Aggregaten</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Formen/Adapter</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4566</td><td>Für die Immunfärbung von Aggregaten</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>BIO-RAD</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Ultrakalter Gefrierschrank</td><td>SANYO</td><td>MDF-U33V</td><td>Für -80 &deg; C Lagerung</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td> Mit <td>DPBS verdünnen, um 0,5 mM EDTA</td></tr><tr><td>herzustellen Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>für RT-qPCR</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>251-00514</td><td></td></tr></tbody></table>

effiziente generation der bauchspeicheldrüse/zwölffingerdarm homeobox protein 1+ posterior foregut/bauchspeicheldrüsen-vorfahren aus hpscs in haftung kulturen

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für regenerative Medizin und als Plattform für menschliche Entwicklungsprozesse zu studieren. Stufenweise gerichtet, Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert ist einer der wichtigsten Wege, einschließlich Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Zellen der Bauchspeicheldrüse zu generieren (PDX1+) Pankreas Vorläuferzellen. Konventionelle Protokolle initiieren die Differenzierung mit kleinen Kolonien kurz nach dem Durchgang. Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für Heterogenitäten, die die Differenzierung zu PDX1 behindern könnte+ Zellen. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen. Das Protokoll besteht aus vier Schritten und initiiert die Differenzierung nach Aussaat dissoziierten Einzelzellen. Die Induktion von SOX17+ endgültige Entoderm Zellen folgte der Ausdruck der beiden primitiven Darm Rohr Marker, HNF1β und HNF4α und eventuelle Differenzierung in PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll bietet einfache Handhabung zu verbessern und stabilisieren die Differenzierung Effizienz einiger hPSC Zeilen, die bisher gefunden wurden, um ineffizient in endodermische Linien oder PDX1 zu unterscheiden+ Zellen.

Verbreitende HiPSCs (585A129,30) verdichten sich und bilden eine homogene Monolayer (Abbildung 1 b), die zur Differenzierung geeignet ist. Undifferenzierte HiPSCs (Stufe 0) sind getrennt und neu ausgesät als Einzelzellen bei niedrigen Zelldichten (1-1,5 x 105 Zellen/cm2). Innerhalb von 1 h die Zellen sind an der Platte befestigt und zu Vorsprung zu zeigen beginnen. Am 1. Tag werden die Zellen stark vermehrt und ...

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass vor der Stimulation, Zellen gleichmäßig verteilt und dann gleichmäßig in Tandem-Zell-Adhäsion stimuliert werden. Demonstriert wird das Verfahren von Azuma Kimura, einer Doktorandin unseres Labors. Um dieses Verfahren zu beginnen, übertragen Sie sechs Milliliter RPMI 1640 in eine auf vier Grad Celsius gekühlte Röhre auf Eis.Mit gekühlten ein Milliliter Pipettenspitzen, fügen Sie zwei Milligramm Keller Membran Matrix. Mischen Sie gut durch sanfte Pipettierung, um es eine Kellermembran-Matrix mit einer Konzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter zu machen. Als nächstes verwenden Sie eine Pipette, um zwei Milliliter der verdünnten Kellermembranmatrix in jeden Brunnen einer Sechs-Well-Zell-Kulturplatte zu übertragen.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 60 bis 90 Minuten. Danach halten Sie die Platte bis zu drei Stunden bei Raumtemperatur, bis sie einsatzbereit ist. Zuerst aspirieren Sie das verwendete Medium und verwenden Sie eine Pipette, um zwei Milliliter 0,5 Millimolar EDTA zu jedem Brunnen hinzuzufügen, um die in der Sechs-Brunnen-Platte kultivierten hPCSs zu waschen.Dann die EDTA aus den Brunnen aspirieren und zwei Millil

efficient-generation-pancreasduodenum-homeobox-protein-1-posterior

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultur und Manipulation von embryonalen Maus Bauchspeicheldrüse. Dies stellt eine...

Ein System für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultivierung von embryonalen Pankreas

Die in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Kulturverfahren rekapituliert Bauchspeicheldrüse Entwicklung von verteilten embryonalen Maus-Pankreasvorläuferzellen, einschließlich ihrer erheblichen Ausweitung, Differenzierung und Morphogenese in einem verzweigten Organ. Dieses Verfahren ist zugänglich Bildgebung, funktionelle Störungen und Manipulationen der Nische.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

Hier beschreiben wir eine 4-Stufen - Protokoll an humanen embryonalen Stammzellen zu NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern in vitro zu differenzieren. Dieses Protokoll kann auf einer Vielzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien angewendet werden.

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Protokolle HPSC Mutantenlinien mit der iCRISPR Plattform und zu differenzieren hPSCs in Glukose-responsive β-ähnlichen Zellen beschrieben zu erzeugen. Genom Bearbeitungstechnologie mit HPSC gerichtete Differenzierung Die Kombination bietet eine leistungsfähige Plattform für die systematische Analyse der Rolle von Lineage Determinanten in der menschlichen Entwicklung und Progression der Erkrankung.

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Dieses Protokoll stellt einen Vergleich zwischen zwei verschiedenen Induktionsprotokollen zur Differenzierung menschlicher Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) gegenüber Pankreaslinien in vitrodar: dem integrativen Protokoll und dem nicht-integrativen Protokoll. Das integrative Protokoll erzeugt mehr insulinproduzierende Zellen (IPCs).

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Die Differenzierung von Stammzellen in Inselzellen bietet eine alternative Lösung zur herkömmlichen Diabetesbehandlung und Krankheitsmodellierung. Wir beschreiben ein detailliertes Stammzellkulturprotokoll, das ein kommerzielles Differenzierungskit mit einer zuvor validierten Methode kombiniert, um die Herstellung von Insulin sezernierenden, aus Stammzellen gewonnenen Inseln in einer Schale zu unterstützen.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

Aus Stammzellen gewonnene retinale Pigmentepithelzellen (RPE) können für mehrere Anwendungen verwendet werden, einschließlich zellbasierter Therapien für Netzhautdegeneration, Krankheitsmodellierung und Medikamentenstudien. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll zur reproduzierbaren Gewinnung von RPE aus Stammzellen vor.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Erfahren Sie die effiziente Differenzierung von hPSCs zu PDX1+ Bauchspeicheldrüsen-Vorläuferzellen mittels Monolayer-Kultur. Diese Methode ermöglicht homogene Zellpopulationen für Stammzellforschung.

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen (Video) | JoVE Journal

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1⁺ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

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