Intestinale Stammzellen isoliert und Kultur in einem porcinen Modell der segmentalen kleinen intestinalen Ischämie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen der intestinalen Ischämie auf intestinale epitheliale Stammzellen zu bewerten. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Stammzellbiologie zu beantworten, z. B. wie Stammzellen Verletzungen widerstehen und zur Reparatur nach ischämischen Verletzungen beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein Großtiermodell handelt, das für die Untersuchung klinischer Darmerkrankungen und -reparaturen verwendet werden kann.

Das Verfahren wird von Amy Stieler Stewart, einer Doktorandin, und John Freund, einem Forschungsspezialisten aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie damit, mit einer Skalpellklinge einen acht bis 10 Zentimeter großen Schnitt in der ventralen Mittellinie am Bauch zu machen, der am Nabel eines acht bis 10 Wochen alten Yorkshire-Mischlingsschweins zentriert ist. Lokalisieren Sie das Jejunum, etwa 40 Zentimeter oral vom Ileozökalübergang.

Ligatieren Sie den Darm zweimal, um 10 Zentimeter lange Jejunumschleifen mit einem Zentimeter Abstand zwischen jeder Ligatur zu markieren. Erstellen Sie zwei Schleifen pro Zeitpunkt der Ischämie nebeneinander, eine für die Ischämie und eine für die Ischämie mit einer zusätzlichen Stunde Reperfusion. Um eine reversible vollständige Ischämie zu induzieren, verwenden Sie Bulldog-Gefäßklemmen oder Hämostaten, um etwa drei mesenteriale Gefäße pro Klemme für den entsprechenden experimentellen Zeitraum zu obstopfen.

Halten Sie den Bauch während der ischämischen Periode bedeckt. Am Ende des Experiments entnehmen Sie mit einer Metzenbaum-Schere zunächst ein Kontrollstück aus normalem Jejunum mindestens fünf bis 10 Zentimeter proximal der letzten ischämischen Schleife, gefolgt von der Sammlung der restlichen Schleifen. Bewahren Sie die Schleifen von jedem Verletzungszeitpunkt in kleinen Behältern mit eiskaltem PBS auf, bis sie in die Krypta

Um die kryptischen Stammzellen zu isolieren, verwenden Sie einen 20-Gauge-Draht und eine Gewebezange, um jede Schlinge des Dünndarms so umzukehren, dass die Schleimhautoberfläche freiliegt. Nähen Sie die Ober- und Unterseite jeder Schlaufe sicher mit dem Draht und spülen Sie jede umgekehrte Schlaufe mit eiskaltem PBS aus. Wenn alle luminalen Rückstände entfernt wurden, legen Sie die Proben sofort in einzelne konische 50-Milliliter-Röhrchen mit 30 Millilitern Dissoziationsreagenz Nummer eins für 30 Minuten auf Eis, wobei alle fünf Minuten geschüttelt und invertiert wird.

Am Ende der Inkubationszeit werden die Proben in entsprechende 50-Milliliter-Röhrchen mit 30 Millilitern Dissoziationsreagenz Nummer zwei überführt und die zwei- bis vierstündigen ischämischen Schleifenproben durch Zentrifugation pelletiert. Resuspendieren Sie die Pellets in fünf Millilitern PBS und verwenden Sie ein 50-Mikroliter-Aliquot von jeder Probe, um den Grad der Kryptenassoziation und die Menge der Trümmer lichtmikroskopisch zu überprüfen. Legen Sie die Proben anschließend 10 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, wobei alle fünf Minuten geschüttelt oder invertiert wird.

Übertragen Sie dann die Proben direkt in 25 Milliliter eiskaltes PBS auf Eis in einen auf 60 U/min eingestellten Orbitalschüttler für zwei bis fünf Minuten Schütteln mit zusätzlichem manuellem Schütteln oder Inversion alle 30 Sekunden. Am Ende der Schüttelinkubation überprüfen Sie den Grad der Kryptenassoziation und die Menge der Trümmer und überführen Sie die Proben in neue konische 50-Milliliter-Röhrchen mit 25 Millilitern kaltem PBS zum Schütteln, bis intakte Krypten mit minimalen Trümmern und Zotten isoliert sind. Wenn die Schleifen vollständig dissoziiert sind, entfernen Sie das restliche Gewebe, pelletieren Sie die Proben durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die restlichen Kryptenpellets in fünf Millilitern frischem PBS.

Aliquotieren Sie dann 150 Krypten pro Röhrchen in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die Krypten durch Mikrozentrifugation. Mit einer vorgekühlten Pipette die Pellets vorsichtig mit 50 Mikrolitern Mastermix pro Vertiefung resuspendieren, gefolgt von einem schnellen 15-maligen Pipettieren zum Mischen. Geben Sie als Nächstes ein 50-Mikroliter-Kryptentröpfchen in die Mitte jeder Vertiefung einer vorentwurmten und gegitterten 24-Well-Platte und legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Überlagern Sie nach 30 Minuten jedes Matrix-Patty mit 500 Mikrolitern pro Vertiefung Darmepithel-Stammzellmedium und geben Sie 500 Mikroliter steriles PBS in alle unbenutzten Vertiefungen, um die Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten und die Anzahl der plattierten Tag-Null-Krypten zu zählen. Geben Sie alle 48 Stunden Wachstumsfaktoren in jede Vertiefung und ersetzen Sie den Überstand alle 96 Stunden durch 500 Mikroliter frisches, mit Wachstumsfaktoren ergänztes Medium. Eine vollständige intestinale Ischämie wird in Dünndarmschlingen durch Gefäßverschluss mit Nähten oder Klemmen erzeugt, wie gezeigt.

Bei korrekter Durchführung beginnt die ischämische Verletzung an der Spitze der Darmzotten und wandert mit zunehmender Dauer der Ischämie in die Krypta nach unten. Ein häufiger Fehler bei der Operationstechnik kann auftreten, wenn die Blutgefäße nicht gleichmäßig ligiert oder geklemmt werden, was zu einer hämorrhagischen Ischämie führt, bei der die dünnwandige Vene vor der Arterie kollabiert und zusätzliches Blut in das Gewebe eindringen kann. Nach Entfernung der ischämischen Darmschlingen können die Darmkrypten nach dem Dissoziationsprotokoll, wie gerade gezeigt, erfolgreich isoliert werden.

Krypten von stärker beschädigten Zeitpunkten sind oft gebrochen und enthalten mehr zelluläre Hintergrundtrümmer als solche, die keinen oder nur leichte Schäden erleiden. Wenn normale und leicht geschädigte Darmkrypten in Kultur plattiert werden, bilden sich innerhalb von 24 bis 48 Stunden Enterosphären. Bei schweren ischämischen Schädigungen überleben die Darmkrypten, werden aber beschädigt, was zur Bildung von zunächst viel kleineren Kugeln führt.

Nach 72 bis 120 Stunden werden die Enteroide aus allen Krypten komplexer mit offensichtlichen zentralen Lumen und knospenden Strukturen, und mit einer insgesamt verringerten Effizienz des Kryptenwachstums sowie einer verringerten Größe der Enteroide, die aus dem schwer geschädigten Darmgewebe stammen. Einmal gemeistert, können die Verfahren zur Isolierung von Krypten in etwa zwei bis drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Es ist am besten, dass die für die Beschichtung gesammelten Krypten aus Waschungen und nicht aus Dissoziationsfraktionen stammen, da die Wahrscheinlichkeit einer Kulturkontamination in der Dissoziationsfraktion erhöht ist.

Mit dieser Methode kann auch die Wirksamkeit von Medikamenten zur Behandlung von Epithelverletzungen infolge von Ischämie plus oder minus Reperfusion getestet werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Magen-Darm-Biologie, um den Einfluss von Ischämie auf das Epithel speziell auf Darmstammzellen in einem translationalen, klinisch relevanten Großtiermodell zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Darmischämie mit oder ohne Reperfusion erzeugt und Darmkrypten für die 3D-Kultur nach einer In-vivo-Verletzung isoliert