Name: Quantifizierung der Mikroglia Morphologie von Mikrofotos von Immunohistochemistry vorbereitet Gewebe mit ImageJ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Mikroglia-Morphologie aus immunhistochemisch präpariertem Hirngewebe mit ImageJ quantifizieren. Diese Methode nutzt Skelettierung und Fraktalanalyse für hochdurchsatzfähige Untersuchungen neuroinflammatorischer Prozesse.

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Diese Studie erhielten finanzielle Unterstützung von NINR (F32NR013611). Wir möchten weiter bestätigen und danken den Entwicklern von AnalyzeSkeleton(2D/3D) und FracLac (Arganda Carreras Et Al. und Karperien Et Al., beziehungsweise) ohne den hier beschriebene Analyse nicht möglich wäre.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mikroglia-Zellen sind abgestimmt auf die Physiologie und Pathologie innerhalb ihrer mikrodomänen und ein breites Spektrum von Morphologien2 im subtilen7,14 und grober Verletzung8anzeigen. Die Verwendung von ImageJ Protokollen macht Mikroglia Morphologie Quantifizierung als Plattform für alle Laboratorien zugänglich und Plugins sind ein Open-Source-Bildbearbeitungsprogramm. Während die beschriebene Protokoll auf Bildverarbeitung und-Analyse mit dieser Software gerichtet ist, beginnt die Konsistenz der Datensammlung, Validität und Reliabilität mit ausgezeichneten IHC und Mikroskopie. Dieses Protokoll wird verwendet, um binäre, Skelett und Gliederung Darstellungen der gesamten Mikrofotos und Einzelzellen zu verbessern, aber kann nicht an die Stelle der Armen IHC beflecken und Mikroskopie, die Ergebnisse in geringem Kontrast, unscharf oder verzerrt Bilder. Als eine weitere Überlegung muss darauf geachtet werden, nicht auf das Hirngewebe während der Lagerung vor dem Schneiden, glätten, das Mikroglia Morphologie unwiderruflich verändert. Zu guter Letzt muss innerhalb jedes Experiment Mikroglia abgebildet werden mit der gleichen Skala sowie die gleichen Mikroskop. Instrumentierung, Ziele und Software variieren unter Mikroskopen die führen zu unterschiedlicher Größe Mikrofotos trotz ähnlicher Zielsetzung und ändern Sie die Details sowie die Anzahl der Zellen in jedem Frame. Bildaufnahme mit einem 40 X Objektiv auf eine Leica SPII ergibt beispielsweise zweimal die Anzahl der Zellen und weniger Details als Erwerb mit einem Zeiss-880. Dies ist besonders wichtig für die Zelle Verzweigung Daten aus den gesamten Rahmen, anstatt eine einzelne Zelle, da dies ein Problem der Daten Probenahme wird.
In der Regel vorausgeht Skelett Analyse, die die gesamte Mikrophotographie nutzt die einzelne Zelle Fraktal-Analyse aus zwei Gründen. Bestimmende Zelle Verzweigung aller Zellen in einem Mikrophotographie ist schnell im Vergleich zu der einzelnen Zelle Fraktalanalyse und als ein Screening-Instrument angesehen werden, kann wenn Zeit ein Faktor ist. Darüber hinaus werden die binären Bildern abgeleitet während Skelett Analyse für Fraktalanalyse verwendet. Sobald ein Image erstellt, gibt es eine Reihe von kritischen Schritte, die Einfluss Skelett Analyseergebnisse und Benutzer-Einfluss vorstellen kann. Die Protokoll-Schritte, die meisten variabel zwischen Benutzern sind Schritt 4.2 (zunehmende Helligkeit) und 4,5 (Bestimmung des Schwellenwerts). Soweit möglich, wird eine optimale Anzahl Erhöhung der Helligkeit (Max oder min Schieberegler zwischen 0-255) bestimmt und für alle Bilder und Anwender konstant gehalten. Wo Bild Variabilität groß ist, können die Benutzer stattdessen eine Helligkeit, die zwischen den Bildern variieren. Alternativ, wenn Bilder hell sind und Kontrast hoch ist, dann Helligkeit erhöhen kann weggelassen werden und Schwellwerte kann mithilfe eines Filters Spezialität Schwelle standardisiert werden (zB., Huang) anstatt die variablere Standard. Sobald optimiert, sollte die Parameter eingehalten werden um zusätzliche Benutzer-Einfluss zu minimieren.
Ein Beispiel für Benutzer Variabilität ist in Abbildung 5dargestellt. Datenwerte wurden in User 1 versus User 2 erhöht und daher würde die Variabilität erhöht werden, wenn Benutzer 1 und Benutzer 2 zur Datenerhebung beigetragen. Ein Beispiel für die Unterschiede in der Benutzer 1 und Benutzer 2 binäre und skelettierten Bilder sind deutlich durch farbige Kreise (Abbildung 5). In diesem Fall waren beide Benutzer kurz ausgebildeten Studenten mit begrenzten Expertise in der Mikroglia. Regelmäßige Kontrolle und Betreuung durch einen Experten zusammen mit erhöhten Protokoll Training2 Mikroglia können Inter Benutzer Variabilität reduzieren. Obwohl hier nicht bewertet, ist Fraktalanalyse weniger anfällig für Inter Benutzer Variabilität da binäre Zellen einzeln und manuell von einem Mikrophotographie, anstatt allein auf Schnittstellenüberwachung Mikroglia Formen bestimmen isoliert sind. Alle Methoden besitzen jedoch eine gewisse Variabilität zwischen den Nutzern. Daher ein einzelner Benutzer (im Idealfall ausgebildet durch einiges an Fachwissen in Mikroglia-Zellen) sollte die Datensammlung für eine gesamte Dataset abgeschlossen.
Zusätzliche Änderungen dieses Protokolls leicht erfolgen können und hängt die Bildqualität und die Bemühungen zur Reduzierung von Lärm und Prozess-Konnektivität zu gewährleisten. Zum Beispiel, wenn Kontrast ausreicht, dann Unscharf maskieren ist nicht notwendig und kann weggelassen werden. Es ist ratsam, zu optimieren und das Protokoll für eine bestimmte Gruppe von Bildern, experimentelle Fälle und Kontrollen, vor dem Sammeln von Daten aus einem ganzen Satz abzuschließen. Zu guter Letzt zusätzliche Plugins verwendet werden, anstelle von anderen zu formulieren oder zu schärfen Bilder, die in diesem Protokoll nicht beschrieben wurden wie zu dehnen oder zu schärfen.
Vorteile dieses Protokolls sind seine universelle Verfügbarkeit und Anpassungsfähigkeit. Darüber hinaus ist die Beurteilung Zelle Verzweigung mit AnalyzeSkeleton schnell und auf eine gesamte Mikrophotographie anwendbar. Ein Vorteil der multizelle Analyseansatz ist der Fokus auf einer ganzen Region anstatt einzelner Zellen. Daher ist es möglich, die durchschnittliche Auswirkung (in Bezug auf die Endpunkte und Prozess-Länge) alle Mikroglia im Bild schnell zu beurteilen. Skelett-Analyse liefert eine Analyse mehrerer Zellen: eine Auswahl der Daten in Bezug auf die Anzahl der Zellen, die nicht von Fraktalanalyse aufgrund der erforderlichen Zeit Investitionen, einzelne Zellen von Mikrofotos isolieren abgestimmt werden. Eine Instanz, wo dies am besten geeignet sein könnte, wäre in screening-Mikroglia Morphologien in Nähe einer fokalen Verletzung. Eine Einschränkung ist, dass das ganze Feld Bildrendering Skelettmodelle IHC Mikrofotos erstellen unvollkommen im Vergleich zu der zeitaufwändiger Einzelzelle Ansatz ist. Darüber hinaus sind eine regionsanalyse nicht Umständen angemessen Mikroglia Morphologien drastisch unterschiedlich im gleichen Bereich. Zu guter Letzt ist diese Analysemethode abhängig von Zellzahl, ein Parameter, der zwischen experimentellen Bedingungen abweichen.
Fraktalanalyse erfolgt auf eine einzelne Zelle und ergänzt somit die durchschnittliche Zelle Verzweigung Datenausgabe aus dem Skelett Analyse. Obwohl viel mehr zeitaufwendig, verschiedenste morphometrische Daten diese Investition bringt. Z. B. Zelle Dichte, Span-Verhältnis und Zirkularität Daten beschreiben die Größe, die Dehnung und die Form der Zelle Gliederung, beziehungsweise. Fraktale Dimension und Lacunarity fassen die Zelle Komplexität und Heterogenität der Form, beziehungsweise. Eine ausführlichere Zusammenfassung der wie jeder Parameter berechnet wird und wie Daten interpretiert werden können finden Sie in der interaktiven manuelle16 und so detailliert betrachtet werden, in Bezug auf die spezifische Fragestellung. Das beschriebene Protokoll führt zu empfindlichen Werkzeuge, kleine Änderungen in 2D Mikroglia Morphologien zu quantifizieren, die unter physiologischen und pathologischen Bedingungen auftreten können. Zusätzliche morphometrische Analyse wie Solidität, Konvexität und Form Faktor16,20 wenn 3D-Formen erzeugen möglicherweise.
Protokollentwicklung und Anpassung ist kontinuierlich und nutzerorientierten. Es wurde von Fluoreszenz8 DAB/Hellfeld Bilder7 aber noch nicht zu paraffin eingebettete Gewebe ausgedehnt. Es außerdem für zusätzliche Analysen in Verbindung mit proprietärer Software wie Imaris einsetzbar. Dieses Protokoll kann auch auf eine Vielzahl von Physiologie und beschränkt sich nicht auf Mikroglia aber angewandt werden, um jede Zelle oder eines Gewebes mit bestimmten Mustern oder Formen, die mit IHC Methoden identifiziert werden können. Mit ausreichender Stichprobengröße kann schließlich eine Multivariate oder Cluster-Analyse angewendet werden, um Schichten Mikroglia nach Morphologie12,21; Dies ist sinnvolle Informationen wie Mikroglia Morphologie ein wichtiger Indikator der Mikroglia Funktionen und Reaktionen auf ihre Umgebung ist. Die Wertschätzung für die Mikroglia morphologische Vielfalt ist expandierenden und zum Verständnis wichtig Neuron-Glia-Kreislauf Interaktionen in Gesundheit und Krankheit. Wachstum in diesem Bereich wird ergänzt durch gut ausgebaute, einfach zu bedienen und reproduzierbare Protokolle zu quantifizieren und Mikroglia Morphologie mit mehreren kontinuierlichen Variablen zusammenfassen.

Mikroglia haben eine sofortige und vielfältigen morphologischen Antwort auf Veränderungen im Gehirn Physiologie1 entlang eines Kontinuums von Möglichkeiten dieses Bereichs von hyper-Verzweigung und hochkomplexe Morphologien, de-verzweigten und amöboiden Morphologien2 . Mikroglia kann auch polarisiert und stabförmige3geworden. Mikroglia Zelle Verzweigung wird im Allgemeinen als eine komplexe Form mit mehreren Prozessen definiert und wird oft als die Anzahl der Endpunkte pro Zelle und die Länge der Zelle Prozesse berichtet. Da Mikroglia sind abgestimmt auf neuronalen und Gliazellen Funktion durch kontinuierliche Zellezelle Übersprechen und in Vivo Motilität4,5, können als Indikatoren für verschiedene Zellfunktionen und Dysfunktionen Mikroglia Morphologien dienen. im Gehirn. Ein quantitativer Ansatz ist notwendig, um die Vielfalt dieser morphologischen Veränderungen angemessen zu beschreiben und die Unterschiede zwischen den verzweigten Zellen zu unterscheiden, die mit subtilen physiologische Störungen (z. B. Epilepsie5,6 auftreten und Gehirnerschütterung7) zusätzlich zu grobe Verletzungen (z. B. Takt8). Ein vermehrter Einsatz von Morphologie Quantifizierung7,8,9,10,11,12,13,14 zeigen die ganze Vielfalt der Mikroglia Morphologien in Gesundheit und Krankheit. Die vorliegende Studie Details der schrittweise Einsatz von ImageJ Plugins notwendig, Mikroglia Morphologie von Leuchtstofflampen oder nicht-fluoreszierende Vergößerung der Mikroglia zusammenfassen in festen Nagetier Gewebe nach Immunhistochemie (IHC) erworben.
Im Mittelpunkt stehen, die Analyse-Techniken, die hier beschriebenen die ImageJ Plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, entwickelt im Jahr 2010 auf große Mamma Strukturen, zu quantifizieren und FracLac16, entwickelt im Jahr 2014 auf ImageJ und Fraktal-Analyse zu integrieren einzelnen Mikroglia Formen zu quantifizieren. Diese Plugins bieten eine schnelle Analyse der Mikroglia Verzweigung im gesamten Mikrofotos oder mehrere Mikroglia einen definierten ROI innerhalb einer Mikrophotographie. Diese Analyse kann alleine oder in Ergänzung mit Fraktalanalyse verwendet werden. Die einzelligen Fraktalanalyse (FracLac) erfordert eine Investition von Zeit, sondern bietet mehrere Morphologie Ausgaben bezüglich Mikroglia Komplexität, Form und Größe. Die Verwendung beider Tools ist nicht überflüssig, als Zelle Verzweigung ist komplementär zur Zelle Komplexität und die Kombination von mehreren Parametern verwendet werden, zu unterscheiden zwischen verschiedenen Mikroglia Morphologien in Datasets12,17.

<table><tbody><tr><td>Primärer Antikörper gegen IBA1</td><td>Wako&nbsp;</td><td>019-19741</td><td>Kaninchenwirt</td></tr><tr><td>Vectashield Soft Mount</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sekundärantikörper</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>Eselwirt</td></tr><tr><td>4 mL Glasfläschchen</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckglas</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung der mikroglia morphologie von mikrofotos von immunohistochemistry vorbereitet gewebe mit imagej

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Mikroglia sind Gehirn Fresszellen, die im Gehirn Homöostase teilnehmen und kontinuierlich vermessen ihr Umfeld für Funktionsstörungen, Verletzungen und Krankheiten. Als die first Responder Mikroglia haben wichtige Funktionen, Neuronen und Glia Dysfunktion zu mildern, und in diesem Prozess durchlaufen sie eine breite Palette von morphologischen Veränderungen. Mikroglia Morphologien können deskriptiv eingestuft werden oder alternativ als eine kontinuierliche Variable Parameter wie Zelle Verzweigung, Komplexität und Form quantifiziert werden können. Während Methoden zur Quantifizierung der Mikroglia auf einzelne Zellen angewendet werden, gelten einige Techniken für mehrere Mikroglia in eine gesamte Mikrophotographie. Der Zweck dieser Methode ist, mehrere zu quantifizieren und Einzelzellen mit leicht verfügbaren ImageJ-Protokolle. Dieses Protokoll ist eine Zusammenfassung der Schritte und ImageJ Plugins empfohlen, Fluoreszenz und Hellfeld Vergößerung in repräsentativen binäre und skelettierten Bilder umzuwandeln und zu analysieren mit Software-Plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) und FracLac für die Datenerfassung der Morphologie. Die Ausgänge dieser Plugins zusammenfassen Zellmorphologie Prozess Endpunkte, Kreuzungen, und Länge sowie Komplexität, Zelle Form und Größe Deskriptoren. Das Skelett Analyse Protokoll beschriebenen eignet sich gut für eine regionale Analyse von mehreren Mikroglia innerhalb eines gesamten Mikrophotographie oder Region of Interest (ROI), während FracLac eine ergänzende individuelle Zellanalyse bietet. Kombiniert, sieht das Protokoll ein objektives, sensible und umfassende Bewertungswerkzeug, das verwendet werden, um zwischen vielfältigen Mikroglia Morphologien im Gehirn gesund und Verletzten zu Schichten.

Die Mikroglia Morphologie Analyseprotokolle beschriebenen zusammenfassen Schritte bei der Bearbeitung von Leuchtstofflampen und DAB Mikrofotos für morphometrische Analyse hilfreich. Diese Schritte werden in Abbildung 2 optisch zusammengefasst und Abbildung 3. Das Ziel dieser Schritte ist ein repräsentatives Bild der binären und skelettierten erstellen, das entsprechend der ursprünglichen Mikrophotographie Modelle, so dass die angesammelten Daten gültig sind. Nach Protokoll Anwendung ergeben das AnalyzeSkeleton-Plugin tagged Skelett Bilder aus denen die Anzahl der Endpunkte und Zweig (dh., Prozess) Lengthcan von daraus resultierenden Ausgabedateien zusammengefasst werden. Endpunkte und Länge Prozessdaten werden dann verwendet, um das Ausmaß der Mikroglia Verzweigung in der Mikrophotographie oder ROI zu schätzen. Abbildung 4 fasst die resultierenden Daten (Endpunkte und Prozess/Länge/Zelle) mit und ohne Protokoll Anwendung. Während ähnliche Tendenzen vorhanden sind, sind die Daten zusammengefasst in Abbildung 4F weniger Variable als in Abbildung 4E. Diese Daten veranschaulichen darüber hinaus erhöhten Empfindlichkeit zur Erkennung Unterschiede zwischen den Gruppen, wenn das Protokoll angewendet wird. Zu guter Letzt muss darauf geachtet werden, über Inter Benutzer Variabilität in der Anwendung des Protokolls. Solche Unterschiede sind in Abbildung 5 zusammengefasst wo demselben Datensatz durch zwei unabhängige Benutzer, die Anwendung eines identischen Protokolls wie oben zusammengefasst analysiert wurde.
Zusätzliche Morphologie Daten werden aus einzelnen Zellen isoliert von den binären Bildern während der Protokoll-Anwendung erstellt. Die Protokoll-Schritte zu analysieren, Mikroglia Morphologie vor und mit das FracLac-Plugin sind in Abbildung 6zusammengefasst. Wir illustrieren diese Analyse in beide unverletzt (Abb. 6A) und (Abb. 6 b) Gewebe verletzt. Repräsentative Bilder von binären, skizzierte, konvexen Rumpf/Verkapselung Kreis und Feld zählen Beispiele für jede Zelle analysiert mit und ohne das Protokoll Anwendung sind in Abbildung 6–F. Diese Bilder helfen, die Ursprünge der Unterschiede in der Morphologie Daten veranschaulichen, die in Abbildung 6zusammengefasst sind.
<img alt="Neuronales Tracing-Diagramm; kreisförmiges vs. sortenreines Soma; fluoreszierende Überlagerung; Kartierung neuronaler Netzwerke." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Abbildungen der skelettierten Mikroglia mit einer kreisförmigen Soma (suboptimale) im Vergleich zu einem einzigen Ursprung Soma (optimal) und die entsprechende Überlagerung zwischen der skelettierten Zelle und die ursprüngliche Mikrophotographie. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Bildverarbeitungsschritte: Mikroskopie des Originals bis zum getaggten Skelett, einschließlich Graustufen, Fleckenentfernung, Binärdatei." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Protokoll Anwendung auf fluoreszierende oberflächenmustern. Abbildungen des Protokolls Skelett Analyse auf eine fluoreszierende Mikrophotographie mit einer einzelnen Zelle angewendet abgeschnitten, um Details anzuzeigen. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Bildverarbeitungssequenz für die Analyse neuronaler Strukturen; FFT-Filter; Graustufen; Skelett-Diagramm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3. Protokolls Anwendung Hellfeld DAB oberflächenmustern. Abbildungen des Protokolls Skelett Analyse angewendet, ein Hellfeld DAB Mikrophotographie mit einer einzelnen Zelle beschnitten, um Details anzuzeigen. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Neuronale Prozessanalyse; Mikroskopiebilder, Protokollvergleich, Grafik mit Endpunkten/Zelle." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Abbildung 4. Datenanalyse mit und ohne Protokoll Anwendung. (A) ein Beispiel Mikrophotographie fluoreszierende IHC und beschnittenen Zelle, die den gelben Kasten unter (B). Binäre und skelettierten Beispielbilder mit (C) und ohne (D) das Protokoll angewendet wie beschrieben. Zusammenfassung der Daten der Mikroglia Endpunkte und Prozess/Länge/Zelle in unverletzt (weiß) und verletzte (grau) kortikalen Gewebe mit (E) und ohne (F) das Protokoll angewendet. Statistische Analyse mit Hilfe des Student t-Test und n = 3, ** p &lt; 0,01 bezeichnet. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Analyse der Neuronenmorphologie; Bildverarbeitung und Datendiagramme; Binär, Skelettdiagramme, statistische Ergebnisse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Abbildung 5. Benutzer-Unterschiede mit Protokoll Anwendung. Ein Beispiel für ein original Bild und Protokoll Umstellung auf binäre und Skelett Bilder von Benutzer 1 und Benutzer 2. Unterschiede zwischen den beiden Bildern sind mit passenden farbigen Kreise hervorgehoben. Zusammenfassende Graphiken von Mikroglia Endpunkte/Zelle und Prozessdaten Länge/Zelle in unverletzt und Geschädigten Hirnregionen von Benutzer 1 und Benutzer 2. Statistische Auswertung ANOVA mit Probe beträgt n = 3; p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01 ***p &lt; 0,001. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Neuronale Verletzungsanalyse mit morphologischem Vergleich; Wirkung der Protokollanwendung auf Mikroglia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Abbildung 6. Fraktalanalyse mit und ohne Protokoll Anwendung. Beispiel für verkürzte Vergößerung der Mikroglia im unverletzten (A) und verletzte (B) Kortex mit entsprechenden binären (C) und Gliederung (D) Bilder, die mit und ohne das Protokoll angewendet ergeben. Die damit verbundenen konvexe Hülle (blau) und umschließenden Kreis (rosa) für die entsprechende Kontur Formen (E) werden verwendet, um Form Dichte berechnen, erstrecken sich über Verhältnis und Zirkularität (G). Feld Zählmethode ist illustriert (F) und für die Fraktale Dimension (D-B) und Lacunarity (λ) Berechnungen (G) verwendet. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Mikroglia sind immun Gehirnzellen, die Umfrage und reagieren auf veränderte Gehirnphysiologie durch morphologische Veränderungen, die quantitativ ausgewertet werden kann. Dieses Protokoll beschreibt eine ImageJ basierte Analyse Protokoll, Mikroglia Morphologie als kontinuierliche Daten nach Metriken wie Zelle Verzweigung, Komplexität und Form darzustellen.

Quantifizierung der Mikroglia Morphologie von Mikrofotos von Immunohistochemistry vorbereitet Gewebe mit ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

Das übergeordnete Ziel dieser Skelett- und Fraktalanalysemethoden ist es, die Morphologie von Mikroglia aus IHC-präpariertem Gewebe zu messen, wobei quantitative Methoden verwendet werden, die sowohl von Natur aus Hochdurchsatz als auch empfindlich sind, um kleine Unterschiede in den Zellformen zu erkennen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neuroentzündung zu beantworten, indem sie die Nuancen der Form und Funktion von Mikroglia während Gesundheit und Krankheit definiert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Morphologie der Mikroglia anhand kontinuierlicher und nicht kategorialer Variablen quantifiziert.Die hier beschriebenen Verfahren erfordern keine proprietäre Software und können für das Screening von Gehirnregionen oder eine Zell-für-Zell-Analyse verwendet werden. Das Verfahren wird von Kimberly Young, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass das AnalayzeSkeleton-Plugin auf ImageJ oder Fiji heruntergeladen wurde.Öffnen Sie dann einen 30-Mikron-Z-Stack, auf dem das immungefärbte Iba1-Gehirn zu sehen ist. Wenn Sie eine Fluoreszenz-Mikroaufnahme verwenden, stellen Sie sicher, dass das Bild 8-Bit ist, und konvertieren Sie es in Graustufen, um alle positiven Färbungen bestmöglich zu visualisieren. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Bild, Nachschlagetabellen, Grautöne.Wenn Sie ein DAB-Hellfeldfoto verwenden, verwenden Sie zuerst das FFT-Bandpassfilter-Plugin mit den Standardeinstellungen. Klicken Sie auf "Verarbeiten", "FFT", "Bandpassfilter" und dann auf "In Graustufen konvertieren". Wenn das Bild zu dunkel ist, um den Prozess der Mikroglia zu visualisieren, verwenden Sie die Symbolleiste und klicken Sie auf Bild, Anpassen, Helligkeit/Kontrast.Passen Sie die minimalen oder maximalen Schieberegler nach Bedarf an, bis zu den Rändern des Histogramms, aber nicht weiter. Die Anpassung der Helligkeit führt zu der größten Variabilität bei der Datenanalyse und ist daher der kritischste Schritt. Führen Sie als Nächstes einen Filter "Unscharf maskieren" aus, um den Kontrast weiter zu erhöhen, indem Sie auf "Prozess", "Filter", "Unscharf maskieren" klicken.Führen Sie einen Schritt zum Entfernen von Flecken aus, um das von der Unschärfemaske erzeugte Salz- und Pfefferrauschen zu entfernen. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Prozess, Rauschen, Flecken entfernen. Konvertieren Sie das Bild in eine Binärdatei, indem Sie Bild, Anpassen, Schwellenwert auswählen.Wenden Sie dann die Funktion "Flecken entfernen" auf das Binärbild an, um das verbleibende Einzelpixelrauschen zu entfernen. Wenden Sie dann die Funktion Schließen an, indem Sie auf Verarbeiten, Binär, Schließen klicken, um dunkle Pixel zu verbinden, die maximal zwei Pixel voneinander entfernt sind. Entfernen Sie als Nächstes Ausreißer, indem Sie auf Prozess, Rauschen, Ausreißer entfernen klicken.Nachdem Sie das Bild als separate Datei für die zukünftige Verwendung gespeichert haben, skelettieren Sie das Bild mithilfe der Symbolleiste, indem Sie auf Verarbeiten, Binär, Skelettieren klicken. Wählen Sie das skelettierte Bild aus, und führen Sie das AnalyzeSkeleton-Plug-In aus, indem Sie auf Plugins, Skeleton, Analyze Skeleton klicken und das Informationsfeld für den Zweig aktivieren. Kopieren Sie die Daten aus den Ergebnissen und Verzweigungsinformationen, und fügen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle ein.Kürzen Sie die Daten in Excel, um Skelettfragmente zu entfernen, die aus der IHC und der Bildaufnahme resultieren. Bestimmen Sie, welche Länge der Fragmente aus dem Datensatz abgeschnitten werden soll, indem Sie das skelettierte Bild in ImageJ öffnen und das Linienwerkzeug auswählen. Messen Sie mehrere Fragmente, notieren Sie sich die durchschnittliche Länge, und entscheiden Sie sich für einen Grenzwert, der im gesamten Datensatz konsistent sein sollte.Sortieren Sie die Excel-Tabelle benutzerdefiniert, indem Sie auf Sortieren und Filter, Benutzerdefinierte Sortierung klicken. Sortieren Sie nach Endpunktvoxeln vom größten zum kleinsten und in einer neuen Ebene nach Mx-Zweig PT vom größten zum kleinsten. Entfernen Sie jede Zeile, die zwei Endpunkte mit einer maximalen Verzweigungslänge von weniger als dem Grenzwert enthält.Summieren Sie die Daten in der Spalte Endpunkte, um die Gesamtzahl der Endpunkte zu berechnen, die aus dem Bild erfasst wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Zweiginformationsdaten nach dem Sortieren nach Zweiglänge. Nachdem alle Daten getrimmt und summiert wurden, dividieren Sie die Daten aus jedem Bild durch die Anzahl der Mikroglia-Somas im entsprechenden Bild.Geben Sie den endgültigen Endpunkt sowie die Zellen- und Astlänge pro Zelle in die Statistiksoftware ein. Stellen Sie sicher, dass das FracLac-Plugin heruntergeladen wurde. Verwenden Sie dann das Rechteck-Werkzeug, um den ROI zu zeichnen.Stellen Sie sicher, dass das Feld groß genug ist, um die gesamte Zelle zu erfassen, und dass es im gesamten Dataset konsistent bleiben kann. Wählen Sie im Fenster ROI-Manager die Option Aktualisieren aus, um den ROI auf eine zufällig ausgewählte Zelle in der Mikroaufnahme zu beschränken. Öffnen Sie das Binärbild, das die ausgewählte Zelle enthält.Doppelklicken Sie auf das Pinselwerkzeug, stellen Sie die Farbe auf Schwarz ein und passen Sie die Pinselbreite nach Bedarf an. Verwenden Sie das passende Mikrofoto als Referenz, und verwenden Sie den Pinsel, um benachbarte Zellfortsätze zu entfernen, fragmentierte Prozesse zu verbinden und die gewünschte Zelle zu isolieren. Nachdem die Binärzelle isoliert wurde, speichern Sie die Binärdatei.Konvertieren Sie die binäre Zelle mithilfe der Symbolleiste über Prozess, Binär, Gliederung in eine Gliederung. Öffnen Sie in der Symbolleiste FracLac über die Symbolleiste, indem Sie auf Plugins, Fraktalanalyse, FracLac klicken und BC für die Boxzählung auswählen. Legen Sie in Grid Design die Anzahl G auf vier fest.Aktivieren Sie unter Grafikoptionen das Kontrollkästchen Metriken, um die konvexe Hülle und den Begrenzungskreis der Zelle zu analysieren. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie OK und dann die Schaltfläche Scannen, um einen Box-Counting-Scan für das ausgewählte Bild auszuführen. Kopieren Sie im Fenster "Rumpf- und Kreisergebnisse" alle gewünschten Datenergebnisse.Führen Sie dann den gleichen Vorgang im Fenster "Zusammenfassung der Box-Anzahl" aus. Übertragen Sie die kopierten Daten in eine Excel-Datei oder eine Statistiksoftware. Diese Grafik zeigt zusammenfassende Daten der Mikroglia-Endpunkte pro Zelle und der prozessierten Länge pro Zelle in unverletztem und verletztem kortikalem Gewebe.Dies ist das Ergebnis der Analyse mit dem angewendeten Protokoll. In beiden Fällen wurde eine statistische Analyse mit dem Students T Test durchgeführt und drei Bilder analysiert. Bei der Anwendung des Protokolls ist auf die Variabilität zwischen den Nutzern zu achten.Solche Unterschiede werden hier zusammengefasst, wo derselbe Datensatz von zwei unabhängigen Benutzern analysiert wurde, die ein identisches Protokoll anwenden. Obwohl die Trends überall ähnlich sind, wirkt sich die Variabilität zwischen den Nutzern auf die Signifikanz der Daten aus. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Ziel darin besteht, ein Skelett- oder Umrissmodell zu erhalten, das repräsentativ für die ursprüngliche Mikrofotografie ist.Das bedeutet, dass die Schritte an die spezifischen Bedürfnisse des Prüfers angepasst werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Morphologie der Mikroglia aus Mikroaufnahmen von immunhistochemischem Gewebe mit leicht verfügbarer Computersoftware schnell quantifizieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Etienne, F. et al. Zwei-Photonen-Bildgebung der Anziehungskraft von Mikrogliaprozessen auf ATP oder Serotonin in akuten Hirnschnitten. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt den Einsatz der Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Anziehungskraft von Mikrogliaprozessen auf eine injizierte Verbindung in Hirnschnitten zu untersuchen. Es bietet einen Überblick über die Präparation von Hirnschnitten von Mäusen, die Injektion eines Chemolockstoff-Testmittels und die Bildgebung fluoreszenzmarkierter...

Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Untersuchung der Anziehungskraft des Mikroglia-Prozesses auf eine Verbindung in einem Maushirnschnitt

Ein Weg, um neue Einblicke in die Komplexität des Gehirns Entzündungsreaktion gewinnen wird vorgestellt. Wir beschreiben Immunfluoreszenz-basierte Protokolle gefolgt von dreidimensionalen konfokalen Analyse, um die Muster der Co-Expression von Mikroglia / Makrophagen-Phänotyp-Marker in einem Mausmodell der fokalen Ischämie zu untersuchen.

Dreidimensionale konfokale Analyse der Mikroglia / Makrophagen-Marker der Polarisation in Experimental Brain Injury

Mikrogliazellen sind die residenten Immunzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) mit hoher Kapazität, in ihren extrazellulären Umgebung phagozytieren oder verschlingen Material. Hier ist eine breit anwendbare, zuverlässige und hoch quantitativen Assay für die Visualisierung und Messung Mikroglia-vermittelte Phagozytose von synaptischen Komponenten beschrieben.

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Mikroglia-Aktivierung und Mikrogliose sind zentrale Antworten auf chronische Neurodegeneration. Hier stellen wir Verfahren zur in-vivo-Langzeit-Visualisierung der Netzhaut CX3CR1-GFP + Mikroglia-Zellen durch konfokale Ophthalmoskopie und zum Schwellenwert und morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung von deren Aktivierung. Wir überwachen Mikroglia Veränderungen während der frühen Stadien der altersbedingten Glaukom.

In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Zwei Bildanalysealgorithmen, „Drosophila NMJ Morphometrie“ und „Drosophila NMJ Bouton Morphometrie“ wurden geschaffen, um automatisch neun morphologischen Merkmale der neuromuskulären Synapse Drosophila zu quantifizieren (NMJ).

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskuläre Junction Morphology

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Tumor-Mikroumgebungs-Komponenten in Glioblastom-Patienten-Resektionen mit chromogener Immunhistochemie und ImageJ quantitativ zu identifizieren.

Quantitative Immunhistochemie der zellulären Mikroumgebung bei Patienten-Glioblastom-Resektionen

Dieses Protokoll beschreibt einen schrittweisen Workflow für die immunfluoreszierende Costainierung von IBA1 und TMEM119, zusätzlich zur Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie der peripheren myeloischen Zellinfiltration im Gehirngewebe der Maus.

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

Wir stellen eine Methode vor, die einen generalisierbaren flächenbasierten Bildanalyseansatz verwendet, um Zellzahlen zu identifizieren. Die Analyse verschiedener Zellpopulationen nutzte die signifikanten Zellhöhen- und Strukturunterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines adaptiven Algorithmus.

Area-based Image Analysis Algorithm zur Quantifizierung von Makrophagen-Fibroblasten-Kokulturen

Dieses Protokoll beschreibt den Differenzierungsprozess von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) in Mikroglia-ähnliche Zellen für In-vitro-Experimente. Wir enthalten auch ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung menschlicher Synaptosomen aus iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen, die als Substrat für  In-vitro-Phagozytose-Assays mit Lebendzellbildgebungssystemen verwendet werden können.

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Frühgeburten (Entbindung &lt; 37. Woche) sind ein dringendes globales Gesundheitsproblem mit suboptimalen Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten. Wir stellen ein Mausmodell der aufsteigenden vaginalen bakteriellen Infektion induzierten Frühgeburt vor und skizzieren, wie die daraus resultierende neonatale Morbidität und Mortalität analysiert werden kann.

Modellierung von aufsteigenden vaginalen Infektionen, Frühgeburten und neonataler Morbidität bei Mäusen

Die Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) ist eine benutzerfreundliche Analysepipeline, die keine Programmierkenntnisse erfordert und die Analyse der einzelnen Mikroglialmorphologie aus Immunfluoreszenzbildern halbautomatisiert. Validiert in einem von Nagetieren induzierten Lipopolysaccharid-induzierten Neuroinflammationsmodell, erkennt MMPS reproduzierbar aktivierungsassoziierte morphologische Veränderungen und ermöglicht eine standardisierte, skalierbare mikrogliale Phänotypisierung.

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Ein Open-Source-, benutzerfreundliches Werkzeug zur quantitativen Analyse der Mikrogliamorphologie

Erfahren Sie, wie Sie Mikroglia-Morphologie aus immunhistochemisch präpariertem Hirngewebe mit ImageJ quantifizieren. Diese Methode nutzt Skelettierung und Fraktalanalyse für hochdurchsatzfähige Untersuchungen neuroinflammatorischer Prozesse.

Quantifizierung der Mikroglia Morphologie von Mikrofotos von Immunohistochemistry vorbereitet Gewebe mit ImageJ

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