Quantifizierung der Mikroglia Morphologie von Mikrofotos von Immunohistochemistry vorbereitet Gewebe mit ImageJ

Das übergeordnete Ziel dieser Skelett- und Fraktalanalysemethoden ist es, die Morphologie von Mikroglia aus IHC-präpariertem Gewebe zu messen, wobei quantitative Methoden verwendet werden, die sowohl von Natur aus Hochdurchsatz als auch empfindlich sind, um kleine Unterschiede in den Zellformen zu erkennen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neuroentzündung zu beantworten, indem sie die Nuancen der Form und Funktion von Mikroglia während Gesundheit und Krankheit definiert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Morphologie der Mikroglia anhand kontinuierlicher und nicht kategorialer Variablen quantifiziert.

Die hier beschriebenen Verfahren erfordern keine proprietäre Software und können für das Screening von Gehirnregionen oder eine Zell-für-Zell-Analyse verwendet werden. Das Verfahren wird von Kimberly Young, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, dass das AnalayzeSkeleton-Plugin auf ImageJ oder Fiji heruntergeladen wurde.

Öffnen Sie dann einen 30-Mikron-Z-Stack, auf dem das immungefärbte Iba1-Gehirn zu sehen ist. Wenn Sie eine Fluoreszenz-Mikroaufnahme verwenden, stellen Sie sicher, dass das Bild 8-Bit ist, und konvertieren Sie es in Graustufen, um alle positiven Färbungen bestmöglich zu visualisieren. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Bild, Nachschlagetabellen, Grautöne.

Wenn Sie ein DAB-Hellfeldfoto verwenden, verwenden Sie zuerst das FFT-Bandpassfilter-Plugin mit den Standardeinstellungen. Klicken Sie auf "Verarbeiten", "FFT", "Bandpassfilter" und dann auf "In Graustufen konvertieren". Wenn das Bild zu dunkel ist, um den Prozess der Mikroglia zu visualisieren, verwenden Sie die Symbolleiste und klicken Sie auf Bild, Anpassen, Helligkeit/Kontrast.

Passen Sie die minimalen oder maximalen Schieberegler nach Bedarf an, bis zu den Rändern des Histogramms, aber nicht weiter. Die Anpassung der Helligkeit führt zu der größten Variabilität bei der Datenanalyse und ist daher der kritischste Schritt. Führen Sie als Nächstes einen Filter "Unscharf maskieren" aus, um den Kontrast weiter zu erhöhen, indem Sie auf "Prozess", "Filter", "Unscharf maskieren" klicken.

Führen Sie einen Schritt zum Entfernen von Flecken aus, um das von der Unschärfemaske erzeugte Salz- und Pfefferrauschen zu entfernen. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Prozess, Rauschen, Flecken entfernen. Konvertieren Sie das Bild in eine Binärdatei, indem Sie Bild, Anpassen, Schwellenwert auswählen.

Wenden Sie dann die Funktion "Flecken entfernen" auf das Binärbild an, um das verbleibende Einzelpixelrauschen zu entfernen. Wenden Sie dann die Funktion Schließen an, indem Sie auf Verarbeiten, Binär, Schließen klicken, um dunkle Pixel zu verbinden, die maximal zwei Pixel voneinander entfernt sind. Entfernen Sie als Nächstes Ausreißer, indem Sie auf Prozess, Rauschen, Ausreißer entfernen klicken.

Nachdem Sie das Bild als separate Datei für die zukünftige Verwendung gespeichert haben, skelettieren Sie das Bild mithilfe der Symbolleiste, indem Sie auf Verarbeiten, Binär, Skelettieren klicken. Wählen Sie das skelettierte Bild aus, und führen Sie das AnalyzeSkeleton-Plug-In aus, indem Sie auf Plugins, Skeleton, Analyze Skeleton klicken und das Informationsfeld für den Zweig aktivieren. Kopieren Sie die Daten aus den Ergebnissen und Verzweigungsinformationen, und fügen Sie die Daten in eine Excel-Tabelle ein.

Kürzen Sie die Daten in Excel, um Skelettfragmente zu entfernen, die aus der IHC und der Bildaufnahme resultieren. Bestimmen Sie, welche Länge der Fragmente aus dem Datensatz abgeschnitten werden soll, indem Sie das skelettierte Bild in ImageJ öffnen und das Linienwerkzeug auswählen. Messen Sie mehrere Fragmente, notieren Sie sich die durchschnittliche Länge, und entscheiden Sie sich für einen Grenzwert, der im gesamten Datensatz konsistent sein sollte.

Sortieren Sie die Excel-Tabelle benutzerdefiniert, indem Sie auf Sortieren und Filter, Benutzerdefinierte Sortierung klicken. Sortieren Sie nach Endpunktvoxeln vom größten zum kleinsten und in einer neuen Ebene nach Mx-Zweig PT vom größten zum kleinsten. Entfernen Sie jede Zeile, die zwei Endpunkte mit einer maximalen Verzweigungslänge von weniger als dem Grenzwert enthält.

Summieren Sie die Daten in der Spalte Endpunkte, um die Gesamtzahl der Endpunkte zu berechnen, die aus dem Bild erfasst wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Zweiginformationsdaten nach dem Sortieren nach Zweiglänge. Nachdem alle Daten getrimmt und summiert wurden, dividieren Sie die Daten aus jedem Bild durch die Anzahl der Mikroglia-Somas im entsprechenden Bild.

Geben Sie den endgültigen Endpunkt sowie die Zellen- und Astlänge pro Zelle in die Statistiksoftware ein. Stellen Sie sicher, dass das FracLac-Plugin heruntergeladen wurde. Verwenden Sie dann das Rechteck-Werkzeug, um den ROI zu zeichnen.

Stellen Sie sicher, dass das Feld groß genug ist, um die gesamte Zelle zu erfassen, und dass es im gesamten Dataset konsistent bleiben kann. Wählen Sie im Fenster ROI-Manager die Option Aktualisieren aus, um den ROI auf eine zufällig ausgewählte Zelle in der Mikroaufnahme zu beschränken. Öffnen Sie das Binärbild, das die ausgewählte Zelle enthält.

Doppelklicken Sie auf das Pinselwerkzeug, stellen Sie die Farbe auf Schwarz ein und passen Sie die Pinselbreite nach Bedarf an. Verwenden Sie das passende Mikrofoto als Referenz, und verwenden Sie den Pinsel, um benachbarte Zellfortsätze zu entfernen, fragmentierte Prozesse zu verbinden und die gewünschte Zelle zu isolieren. Nachdem die Binärzelle isoliert wurde, speichern Sie die Binärdatei.

Konvertieren Sie die binäre Zelle mithilfe der Symbolleiste über Prozess, Binär, Gliederung in eine Gliederung. Öffnen Sie in der Symbolleiste FracLac über die Symbolleiste, indem Sie auf Plugins, Fraktalanalyse, FracLac klicken und BC für die Boxzählung auswählen. Legen Sie in Grid Design die Anzahl G auf vier fest.

Aktivieren Sie unter Grafikoptionen das Kontrollkästchen Metriken, um die konvexe Hülle und den Begrenzungskreis der Zelle zu analysieren. Wenn Sie fertig sind, wählen Sie OK und dann die Schaltfläche Scannen, um einen Box-Counting-Scan für das ausgewählte Bild auszuführen. Kopieren Sie im Fenster "Rumpf- und Kreisergebnisse" alle gewünschten Datenergebnisse.

Führen Sie dann den gleichen Vorgang im Fenster "Zusammenfassung der Box-Anzahl" aus. Übertragen Sie die kopierten Daten in eine Excel-Datei oder eine Statistiksoftware. Diese Grafik zeigt zusammenfassende Daten der Mikroglia-Endpunkte pro Zelle und der prozessierten Länge pro Zelle in unverletztem und verletztem kortikalem Gewebe.

Dies ist das Ergebnis der Analyse mit dem angewendeten Protokoll. In beiden Fällen wurde eine statistische Analyse mit dem Students T Test durchgeführt und drei Bilder analysiert. Bei der Anwendung des Protokolls ist auf die Variabilität zwischen den Nutzern zu achten.

Solche Unterschiede werden hier zusammengefasst, wo derselbe Datensatz von zwei unabhängigen Benutzern analysiert wurde, die ein identisches Protokoll anwenden. Obwohl die Trends überall ähnlich sind, wirkt sich die Variabilität zwischen den Nutzern auf die Signifikanz der Daten aus. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Ziel darin besteht, ein Skelett- oder Umrissmodell zu erhalten, das repräsentativ für die ursprüngliche Mikrofotografie ist.

Das bedeutet, dass die Schritte an die spezifischen Bedürfnisse des Prüfers angepasst werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Morphologie der Mikroglia aus Mikroaufnahmen von immunhistochemischem Gewebe mit leicht verfügbarer Computersoftware schnell quantifizieren können.