Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der DNA-Reparatur zu beantworten, z. B. wie die Bildung, Lokalisierung und Auflösung von DNA-Reparaturkomplexen reguliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Veränderungen eindeutig erkennen und komplexe Lokalisationen und Kinetiken reparieren kann. Zusätzlich zu diesen Studenten in meinem Labor werden drei Doktoranden die Experimente durchführen.

Das werden Changkun Hu, Dalton Dacus und Stephen Walterhouse sein. Züchten Sie zunächst U2OS/DR-GFP-Zellen auf einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturplatte, bis sie zu 85 bis 90 % konfluent sind. Entfernen Sie dann das Medium, fügen Sie drei Milliliter EDTA hinzu und inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei Raumtemperatur.

Ersetzen Sie das EDTA durch einen Milliliter Trypsin und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann fünf Milliliter DMEM hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Nach dem Zählen der Zellen sechsmal 10 bis zur dritten Zelle pro Vertiefung in 200 Mikroliter Medium in einer 96-Well-Platte mit Glasboden aussäen.

Alternativ säen Sie viermal 10 bis zu den sechs Vertiefungen in acht Milliliter Medium auf 12 Millimeter großen Deckgläsern in eine 10 Zentimeter dicke Platte, dann wachsen die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Um Doppelstrangbrüche oder DSBs zu induzieren, ersetzen Sie das Medium durch Wasserstoffperoxid, das auf eine Konzentration von 25 Mikromolar mit DMEM plus 10 % FBS verdünnt ist, und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS, dann fügen Sie frisches DMEM hinzu.

Um die Zellen nach dem Inkubieren zu fixieren, waschen Sie die Platte mit PBS dreimal. Entfernen Sie dann mit einer Nadel und einer Pinzette vorsichtig einen Deckglas von der 10-Zentimeter-Platte für jeden Zeitpunkt und legen Sie ihn in eine einzelne Vertiefung einer 24-Well-Platte. Fügen Sie 4%PFA hinzu und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang.

Dann verwenden Sie PBS, um die Deckgläser dreimal zu waschen. Um die Zellen zu permeabilisieren, fügen Sie 0,5% nichtionisches Detergens und PBS hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Waschen Sie dann die Zellen erneut dreimal mit PBS. Geben Sie dann 3 % BSA und 0,1 % nichtionisches Reinigungsmittel, verdünnt in PBS, zu den Deckgläsern in einer 24-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann Primärantikörper hinzu, die auf das gewünschte Reparaturprotein abzielen, und inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Nachdem Sie die Zellen dreimal mit PBS gewaschen haben, fügen Sie DAPI hinzu und inkubieren Sie die Platten fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Anschließend werden die Proben mit Sekundärantikörpern inkubiert. Nachdem Sie die Zellen wie zuvor gewaschen haben, verwenden Sie das Eindeckreagenz, um die Abdeckgleiten mit der Zellseite nach unten auf Objektträger zu montieren.

Drücken Sie vorsichtig auf die Deckgläser und saugen Sie mit einem Tuch überschüssiges Eindeckreagenz auf. Versiegeln Sie die Deckgläser mit schnell trocknendem transparentem Nagellack und sorgen Sie für eine vollständige Abdichtung des Deckglases mit dem Objektträger. Nehmen Sie konfokale Mikroskopbilder auf, indem Sie sich auf den DAPI-Kanal fokussieren.

Um die Zellkerne in Immunfluoreszenzbildern zu definieren, öffnen Sie die konfokalen Bilder, indem Sie die Bilddatei in das ImageJ-Fenster ziehen oder indem Sie den Importer für Bioformate aus der Plugin-Symbolleiste in ImageJ auswählen. Wählen Sie dann geteilte Kanäle aus. Wählen Sie unter Farboptionen die Option Farbig aus dem Dropdown-Menü aus.

Wählen Sie OK aus, um die DAPI- und Histon-H2AX-Abbilder als separate Fenster zu öffnen, und wählen Sie das DAPI-Abbild aus. Wählen Sie dann die Bildsymbolleiste in der Option "Schwellenwert anpassen" aus, um die Kerne auszuwählen. Passen Sie als Nächstes den Bildschwellenwert an, indem Sie die untere Leiste des Schwellenwertfensters ganz nach rechts schieben.

Passen Sie die obere Leiste an, bis die Kerne vollständig rot mit deutlichen Umrissen erscheinen und der Hintergrund schwarz ist. Wählen Sie dann die Symbolleiste "Analysieren" und die Option "Partikel analysieren" aus. Geben Sie die minimale Größe des Kerns ein.

Wählen Sie im Dropdown-Menü "Anzeigen" die Option "Gliederungen" aus und wählen Sie dann die Option "Zum Manager hinzufügen" aus. Klicken Sie auf OK, um ein ROI-Manager-Fenster zu öffnen. Weisen Sie den Kernen im ROI-Manager-Fenster durch Auswahl Nummern zu.

Um ImageJ zur Quantifizierung von H2AX-Herden und Immunfluoreszenzmikroskopiebildern zu verwenden, wählen Sie das H2AX-Foci-Fenster aus. Wählen Sie dann Prozesssymbolleiste und wählen Sie Maxima suchen, um Brennpunkte in den Kernen zu finden. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Ausgabetyp" die Option "Einzelne Punkte" und wählen Sie die Auswahl des Vorschaupunkts aus, um die Maxima-Brennpunkte zu visualisieren.

Geben Sie dann einen Rauschtoleranzwert ein, der von der Intensität der Fluoreszenz des Bildes abhängt. Wählen Sie im ROI-Manager-Fenster die Kerne aus, für die H2AX-Brennpunkte quantifiziert werden müssen. Wählen Sie Maß, um die Anzahl der Maxima-Brennpunkte innerhalb der ausgewählten Kerne zu messen.

Kopieren Sie die rohen Intensitätswerte und fügen Sie sie zur Datenanalyse in die Software ein. Nach dem Einsetzen von Zellen auf 96-Well-Platten mit Deckgläsern, wie weiter oben in diesem Video gezeigt, induzieren Sie Doppelstrangbrüche, indem Sie ein lipidbasiertes Transfektionsmittel verwenden, um Zellen mit dem I-SceI-Expressionsvektor zu transfizieren. Um nach dem Waschen von vix-permeabilisierten und blockierten Zellen, wie zuvor gezeigt, zu erhalten, fügen Sie Antikörper gegen gamma H2AX hinzu und reparieren Sie das Protein von Interesse.

Mit 1x PBS-Waschgang gleitet die 96-Well-Plattenabdeckung dreimal. Inkubieren Sie dann die 96-Well-Plattendeckgläser mit Sekundärantikörpern. Nachdem Sie schließlich die Zellen identifiziert haben, die einen großen nuklearen Gamma-H2AX-Fokus haben, zählen Sie manuell diejenigen, die auch eine Kolokalisation mit dem interessierenden Reparaturprotein zeigen.

Diese Abbildung zeigt eine Rauschunterscheidung von 90 und markiert die korrekte Anzahl der Brennpunkte. Kerne am Rand und Brennpunkte außerhalb der Kerne werden bei der Quantifizierung nicht gezählt. Das hier gezeigte Panel zeigt eine geringe Geräuschtoleranz von 50.

Zahlreiche Maxima sind außerhalb des Zellkerns und innerhalb des Zellkerns identifiziert. In dieser Zelle findet sich eine hohe Geräuschtoleranz von 220. Es wurden nur ein einziger Herde nachgewiesen.

Die Kolokalisation eines gamma-H2AX-Fokus und eines interessierenden Reparaturproteins ist in dieser Abbildung dargestellt. Hier ist eine nicht transfizierte Zelle zu sehen, und oben rechts ist eine Zelle mit nicht-nukleärem gamma-H2AX-Fokus zu sehen. Bei höherer Vergrößerung kann ein klareres Bild eines echten Innenfokus und eines nicht-nuklearen oder externen Fokus unterschieden werden.

Schließlich wird hier ein Beispiel für einen nuklearen gamma-H2AX-Fokus ohne Kolokalisation eines Reparaturproteins gezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Co-Mutor-Fällung durchgeführt werden, um Wechselwirkungen zwischen Reparaturproteinen von Interesse zu identifizieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Bildung und Auflösung von DNA-Reparaturkomplexen beobachten können, indem Sie vorübergehende Doppelstrangbrüche in der DNA induzieren. Sie lernen auch, wie Sie eine Fehllokalisation von Reparaturfaktoren eindeutig von einer verzögerten Rekrutierung unterscheiden können, indem Sie lang anhaltende Läsionen induzieren.