Name: Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Lernen Sie die Immunfluoreszenz-Mikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur in U2OS/DR-GFP-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Reparaturkomplex-Dynamik und Genomstabilität.

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Wir danken Joel Sanneman und Dr. Philine Wangemann der konfokalen Mikroskopie Kern, finanziert von der Kansas State University College of Veterinary Medicine, für ihre Unterstützung der Bemühungen, diese Technik zu entwickeln. pCBASceI war ein Geschenk von Maria Jasin (Addgene Plasmid # 26477) 30. U2OS DR-GFP Zellen waren eine Art Geschenk von Maria Jasin18.

Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll für U2OS Zellen, in denen ein-SceI Anerkennung Seite18geschrieben wird. Die Zellen müssen nicht U2OS sein aber müssen-SceI-Website enthalten. Das Protokoll muss möglicherweise angepasst (z.B.Anzahl der Zellen ausgesät und Inkubationszeiten) werden je nach Art der verwendeten Zellen.
1. definieren die Kinetik der Komplexbildung der DSB-Reparatur
<ol><li>Wachsen Sie U20S-DRGFP Zellen auf einem 10 cm Gewebekultur Teller bis zu 85 – 90 % konfluierende.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und bei Raumtemperatur (RT) in 3 mL EDTA für 2 min inkubieren.</li>
	<li>Mit 1 mL Trypsin EDTA zu ersetzen und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Stellen Sie sicher, dass die Zellen von der Oberfläche der Platte durch Betrachtung unter dem Mikroskop getrennt sind. Neutralisieren Sie Trypsin mit 5 mL der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration der Zellen in dieser Suspension mit einer Hemocytometer und die Trypan blau Ausschluss-Methode.</li>
	<li>Samen 6 x 103 Zellen/Brunnen in 200 µL ein Glasboden 96-Well-Platte. 4 x 106 Samenzellen in 8 mL auf 12 mm Deckgläsern alternativ in einen 10 cm Teller gelegt. Hinweis: Jede gut oder Deckglas stellt einen einzigen Zeitpunkt, einschließlich der Kontrolle.</li>
	<li>Wachsen Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2.</li>
	<li>Induktion DSB
	<ol>
<li>Ersetzen Sie die Medien aus der 96-Well-Platte/10 cm Schale mit H2O2 verdünnt, um eine Konzentration von 25 µM mit DMEM + 10 % FBS und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen, die 3 X mit 1 x PBS und ersetzen mit frischen DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt. Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 0, 1, 4, 8, 24 und 48 h. Stellen Sie sicher, dass frische Verdünnungen von H2O2 für jedes Experiment verwendet werden. Hinweis: Um zu vermeiden, töten Zellen bei der hier verwendeten H2O2 Konzentration, sicherstellen Sie, dass die Dosis der Schaden gering ist, genug, so dass der Großteil der Zellen Apoptose und Seneszenz vermieden wird. Es ist wichtig, den Recovery-Prozess zu beobachten. Dies geschieht am besten durch Messung der Empfindlichkeit zu einer Reihe von Dosen. Führen Sie ein MTT-Assay oder andere Zelle Lebensfähigkeit Assay für die minimale Konzentration von Wasserstoffperoxid zu bestimmen, die verwendet werden können.</li>
	</ol></li>
	<li>Befestigung und permeabilizing Zellen
	<ol>
<li>Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 1 X PBS. Entfernen Sie ein Deckglas aus 10 cm Teller für jeden Zeitpunkt und legen Sie sie in einem einzigen Brunnen von einer 24-Well-Platte zur Befestigung. Verwenden Sie die Nadel und Pinzette zu entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und Zellen von der Oberfläche des Deckglases kratzen zu vermeiden.</li>
		<li>Update der Zellen durch Inkubation für 15 min bei 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei Zeiten nach 1 h H2O2 Exposition und frische DMEM-Ersatz (0, 1, 4, 8, 24 und 48 h) bezeichnet.</li>
		<li>Waschen Sie die festen Deckgläsern 3 Mal mit PBS. Permeabilize Sie die Zellen mit 0,5 % nicht-ionische Reinigungsmittel in 1 X PBS verdünnt. 15 min bei RT, vor dem Waschen mit PBS 3 X inkubieren. Hinweis: Nach Permeabilisierung kann Lagerung von Deckgläsern mit PBS-Puffer bei 4 ° C für mindestens eine Woche.</li>
	</ol></li>
	<li>Reparieren von komplexen Visualisierungen
	<ol>
<li>Blockieren der 96-Well-Platte/Deckgläsern in einer Lösung von 3 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel in 1 X PBS verdünnt (3 % BSA Lösung) für 1 h bei RT</li>
		<li>Brüten Sie mit Primärantikörpern, die auf die Reparatur-Protein des Interesses, entsprechend den Vorgaben des Herstellers in 3 % BSA Lösung für 1 h bei RT, vor dem Waschen 3 Mal mit 1 X PBS verdünnt.</li>
		<li>Inkubieren Sie die 96-Well-Platte/Deckgläsern, mit Sekundärantikörper laut Protokoll des Herstellers in 3 % BSA Lösung verdünnt. Bestätigen Sie, dass die sekundäre Fluorophore nicht überlappende Erregung oder Emissionsspektren verfügen.</li>
		<li>Fügen Sie nach dem Waschen der Zellen mit PBS 3 Mal DAPI, entsprechend den Vorgaben des Herstellers in 1 X PBS verdünnt und 5 min bei RT inkubieren.</li>
		<li>Montieren Sie die Deckgläsern auf Objektträger mit einem Tropfen des Montage-Agents, sicherstellen, dass die Seitenflächen der Zelle nach unten. Drücken Sie vorsichtig die Deckgläsern und überschüssigen Montage-Agent mit einem Tuch aufsaugen.</li>
		<li>Versiegeln der Deckgläsern mit transparenten Nagellack trocknet schnell und sorgen für eine vollständige Abdichtung des Deckglases mit der Folie.</li>
		<li>Nehmen Sie die confocal Mikroskopbilder durch die Konzentration auf das DAPI-Kanal, vor anderen Kanälen (mit Signalen von DNA-Reparatur-gen von Interesse) um zu vermeiden, Einführung von Voreingenommenheit in das Experiment.</li>
		<li>Alternativ können Bilder erworben werden, indem man Z-Profile aus der gewünschten Region und kondensiert das Bild in einer Ebene alle nachweisbaren Herde zu visualisieren. Hinweis: Wenn DSB Auflösung oder Protein des Interesses zu gewählten Zeitpunkten nicht beachtet wird, bestimmen wann DSB beheben, indem Sie zunächst den unterschiedlichsten Zeitpunkten auswählen (0-48 h post DSB Induktion). Die Zeitpunkte des Interesses variieren je nach der Methode der DSB-Induktion und Reparatur Proteins des Interesses.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie kostenlose ImageJ-Software, um die Kerne in der Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Bildern zu definieren. Hinweis: Um Mikroskopaufnahmen zu öffnen, muss der Bio-Formate-Plugin in ImageJ installiert werden.<ol>
<li>Öffnen Sie die konfokale Bilder (.czi oder .tif) indem Sie die Image-Datei in das ImageJ-Fenster ziehen oder durch Auswahl von "Bio-Formate Importeur" aus der Symbolleiste "Plugin" von ImageJ. Hinweis: Die "Option Bio-Formate" Importieren "" Fenster wird angezeigt.</li>
		<li>Wählen Sie "Split Kanäle" konstitutiven DAPI und fluoreszierende Bilder im Fenster "Bio-Formate-Importoption" das Bild aufgeteilt.</li>
		<li>Wählen Sie "Colorized" in "Farb-Optionen" aus dem Dropdown-Menü. Wählen Sie "OK" zum Öffnen der DAPI und Histon H2AX (H2AX) Bilder als separate Windows und wählen Sie das DAPI-Bild.</li>
		<li>Wählen Sie "Bildsymbolleiste" und "Threshold anpassen" Option zum Kerne auswählen. Hinweis: Eine "Schwelle" Fenster wird angezeigt.</li>
		<li>Passen Sie den Bild-Schwellenwert von der unteren Leiste des Fensters "Schwelle" ganz nach rechts schieben. Einstellen der oberen Leiste, bis die Kerne mit deutlichen Konturen und der Hintergrund schwarz komplett rot angezeigt werden. Wählen Sie nicht gelten. Schließen Sie das Fenster "Anpassen Threshold".</li>
		<li>Wählen Sie die Symbolleiste "Analyze" und "Analysieren Partikel" Option. Sehen Sie eine "Teilchen analysieren" Fenster auf dem Bildschirm erscheinen.</li>
		<li>Geben Sie die minimale Größe eines Kerns. Hinweis: Partikel unterhalb der Größe eingegeben werden nicht als Kerne gezählt werden.</li>
		<li>Wählen Sie aus dem Menü "Zeigen" "Konturen". Wählen Sie die Option "Hinzufügen zum Manager". Klicken Sie auf "OK", um ein "ROI-Manager"-Fenster geöffnet. Hinweis: Die Umrisse der Kerne werden in einem separaten Fenster angezeigt.</li>
		<li>Zuweisen der Kerne, die vom Fenster "ROI-Manager" ausgewählt werden können.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie ImageJ, um H2AX Brennpunkte in Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Bildern zu quantifizieren.
	<ol>
<li>Wählen Sie das "H2AX" Brennpunkte Fenster (gefärbt mit Gewebekulturen konjugierten Sekundärantikörper). Dann wählen Sie die Symbolleiste "Prozess" und "Maxima finden", die Herde in den Kernen zu finden. Hinweis: Ein "Maxima finden" Fenster wird geöffnet.</li>
		<li>Wählen Sie die Option "Einzelne Punkte" aus dem Dropdown-Menü "Ausgabetyp" und wählen Sie "Vorschau Messfeldwahl" Maxima/Brennpunkte zu visualisieren. Geben Sie einen "Lärm" Toleranzwert abhängig von der Fluoreszenzintensität des Bildes (Abbildung 1). Überprüfen Sie für das Erscheinungsbild der ein weißes Fenster mit kleinen schwarzen Punkten. Hinweis: Diese Punkte stehen für die H2AX Brennpunkte/Maxima, die entdeckt wurden. Der Toleranzwert Lärm muss für alle Bilder, die analysiert wird konstant gehalten werden. Eine niedrige/hohe Lärm-Toleranz wird zeigen zu viele/wenige Maxima (Herde) im Zellkern und werden keine genaue Darstellung der Schwerpunkte innerhalb des Zellkerns.</li>
		<li>Wählen Sie die Kerne für die H2AX Brennpunkte vom Fenster "ROI-Manager" quantifiziert werden müssen. Wählen Sie die Kerne durch Aktivieren der Option "alle anzeigen".</li>
		<li>Wählen Sie "Measure", die Anzahl der Maxima/Schwerpunkte innerhalb der ausgewählten Kernen zu messen. Hinweis: Die Anzahl der Maxima/Brennpunkte erscheinen als ein Vielfaches von 255, d. h., eine maximale hat eine "RawIntDen" (integrierte Dichte) Lesung von 255.</li>
		<li>Kopieren Sie die "RawIntDen" Werte und fügen Sie sie in Software für die Datenanalyse.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analyse der Lokalisierung in eine lang anhaltende Doppel-Strang DNA-Pause
<ol><li>Samenzellen auf 96-Well-Platten/Deckgläsern wie beschrieben in Abschnitt 1.1 und 1.2.</li>
	<li>
Induktion von Doppel-Strang DNA-Brüchen
	<ol>
<li>Transfizieren Sie Zellen mit dem-SceI Expressionsvektor mit Lipid-basierte Transfection Reagens gemäß den Spezifikationen des Herstellers. Warten Sie 24-72 h nach Transfektion den Endonuklease Ausdruck zu maximieren. Bestimmen Sie, ob die Transfektion von Zellen mit einem einzigartigen großen nuklearen γ-H2AX Fokus Ortung erfolgreich war.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aufnahme von Bildern
	<ol>
<li>Fix, permeabilize, blockieren und 96-Well-Platte/Deckgläsern zu waschen, wie in Abschnitt 1.8 beschrieben.</li>
		<li>Co inkubieren Sie Zellen mit einem Antikörper gegen γ-H2AX und Reparatur Proteins des Interesses (hier, ein primärer Antikörper gegen RAD51 eingesetzt wurde) nach den Angaben des Herstellers in 3 % BSA Lösung verdünnt.</li>
		<li>Waschen Sie die 96-Well-Platte/Deckgläsern 3 Mal mit 1 X PBS. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte/Deckgläsern, mit Sekundärantikörper laut Protokoll des Herstellers in 3 % BSA Lösung verdünnt. Bestätigen Sie, dass die sekundäre Fluorophore nicht überlappende Erregung oder Emissionsspektren verfügen.</li>
		<li>Zellen, die einen großen nuklearen γ-H2AX Fokus zu identifizieren. Fotografieren Sie nur diese Zellen, um Verzerrungen zu vermeiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse der lang andauernde-SceI induzierte Brennpunkte
	<ol>
<li>Analysieren Sie lang anhaltende Brennpunkte manuell, durch zählen sowohl die Anzahl der Zellen, die die großen γ-H2AX Brennpunkte und Co lokalisierte Herde Reparatur-Proteins des Interesses zu haben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Analyse von DNA-Schäden reparieren im allgemeinen und die Reparatur von doppelsträngigen DNA-Brüchen ist speziell ein aktives Gebiet der Forschung, da deren Folgen Tumorgenese Grundlagenbiologie6,20 umfassen. Dieses Manuskript-Details, die ein Konzept, das genau den Beitrag von RAD51 und γ-H2AX Proteinen an die Auflösung des DSB durch HR. Ich freue mich, diese Methode seziert verwendet werden, um zusätzliche Funktionen des Reparatur-Proteine bei DSB<sup class...

Jeden Tag, jede Zelle im menschlichen Körper wird bombardiert mit einer geschätzten 10.000 DNA-Läsionen1. Diese existentielle Bedrohung gefährdet uns für Mutationen, Onkogenese sowie Zelle Tod. Zum Schutz der Genom-Treue haben Säugerzellen entwickelt, um auf DNA-Schäden mit einer komplexen Abfolge von Protein-Verbände und Änderungen reagieren. Diese Antwort gliedert sich in mehrere Wege, zusammen bekannt als DNA-Schaden Antwort (DDR)2,3. Die DDR besteht aus der Ansammlung von DNA-Reparatur-Proteine an DNA-Läsionen, koordiniert sowohl zeitlich als auch räumlich. DDR induziert häufig Zellzyklus Festnahme zur Vermeidung der Ausbreitung oder Verstärkung von Schäden, die während der Replikation von beschädigten DNA2,4,5auftreten können. Im Gegenzug ist es auch notwendig für die zelluläre Lebensfähigkeit ausschalten Zellzyklus Festnahme durch Reparatur komplexe absetze, nachdem die Reparatur abgeschlossen ist.
Unter den verschiedenen Arten von DNA-Schäden sind DSB die meisten schädlichen. DSB reparieren können Chromosomen-Rearrangements oder großflächige Streichungen wie der Verlust des gesamten Chromosoms Arme Nichtbeachtung. Die Reparatur des DSB gliedert sich in zwei Bahnen6,7,8. Homologe Rekombination (HR) erfordert eine Schwester Chromosom als DNA-Vorlage zu verwenden und somit beschränkt sich auf späte S und G2/M-Phase des Zellzyklus9,10. Nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) verfügt nicht über diese Einschränkungen aber kann verursachen kleine Deletionen bei der DSB11,12Reparatur.
DSB reparieren speziell und die DDR im Allgemeinen sind aktive Bereiche der Untersuchung. Trotz in bequem getrennten Bahnen organisiert wird, gibt es viel Redundanz. In der Tat sind viele Proteine (BRCA1, BRCA2 und komplexe z. B. RPA) in mehreren Bahnen13,14,15,16beteiligt. Die Reparatur einer Läsion durch einen Weg, kann zu einen Schaden Mittelstufe, die durch einen anderen Weg14repariert werden muss. Die Verflechtung dieser Wege, kombiniert mit ihrer komplexen Aufgabe recruiting die richtigen Proteine an die richtige Stelle für die genaue Zeitspanne notwendig, erfordert einen mehrstufigen Regulierungsprozess.
Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigt die Feinheiten der DDR durch den Nachweis, dass Reparatur Komplexbildung, Auflösung und Lokalisierung jeweils separat beeinträchtigt17sein können. Das übergeordnete Ziel der das folgende Protokoll soll endgültig sezieren die Fähigkeit der Zellen, DSB zu reparieren. Mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie, kann Ansammlung von Reparatur-Proteine an den Standorten des Schadens zu den repräsentativen Zeitpunkten nach der Induktion der DSB visualisiert werden.
Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile für häufig verwendete Ansätze. Häufig ist die Reparatur zu einzelnen Zeitpunkten untersucht und nicht in der Lage, den dynamischen Prozess der Versammlung und Dissoziation der Reparatur komplexe vertreten. Beobachten das gesamte Spektrum der Reparatur von der erstmaligen Aktivierung der vollen Auflösung sorgt dafür, dass eine Verzögerung bei der Reparatur ist nicht als vollständige Hemmung misidentified. Umgekehrt, es versichert, dass die Induktion einer Reparatur-Antwort, die nicht in der Lage, diese Antwort zu inaktivieren ist nicht als die normale oder die übermäßige Aktivierung identifiziert ist.
Verzögerten Eiweiß Komplexbildung und die MIS Lokalisierung von Reparatur-Proteine können jedoch nicht eindeutig mit diesem Ansatz unterschieden werden. Um festzustellen, ob Reparatur-Proteine falsch lokalisierten versus in ihrer Lokalisation verzögert sind, kann eine "Long-Lasting" DSB durch enzymatische Spaltung der zellulären DNA eingeführt werden. Die daraus resultierende Läsion ist jedes Mal nachschneiden, die es repariert wird, wodurch sich unterschiedliche großen nuklearen Reparatur und Aufhebung der zeitlichen Beschränkung von der Einstellung. Dies kann erreicht werden, indem Sie ändern das bestehende Konzept mit dem Einsatz von einer seltenen schneiden Endonuklease (z.B. SceI) induzieren eine lang anhaltende DSB. Die Langlebigkeit der DSB ermöglicht die Visualisierung der schwer fassbaren Reparatur-Proteine durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Die verbesserte Fülle könnte auch die Visualisierung verbessern, bei der Erkennung durch Einschränkung der Antikörper-Qualität, ein Feature behindert wird, die nützlich sein könnten, wenn weniger untersuchten Proteine identifiziert werden, als mit Auswirkungen auf die DNA-Reparatur.
Insbesondere bieten wir explizite Anweisungen für ein Kostenloses Bild Verarbeitung und Analyse-Software (z. B.ImageJ). Dies entfernt eine große finanzielle Hürde in Bildanalyse, die Vernehmung von DNA-Reparatur von einem breiteren Publikum zu öffnen.

<table><tbody><tr><td>12 mm Deckgläser</td><td>VWR</td><td>89015-725</td><td></td></tr><tr><td>16 % Paraformaldehyd (PFA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>VWR</td><td>82050-892</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Glasbodenplatte</td><td>Cellvis</td><td>P96-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H2AX Alexa488</td><td>EMD Millipore</td><td>05-636-AF488</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (D4B10)&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8875S</td><td></td></tr><tr><td>Bioformate-Plugin für ImageJ</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>VWR</td><td>89510-194</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11012&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Nationales Institut für Gesundheit (NIH)</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>I-SceI Expression Vector</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack- Insta Dri</td><td>Sally und Hansen</td><td>Clearly Quick (103)</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect Transfektionsreagenz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung von dna-reparaturprozesse bei transienten und langlebige doppel-strang dna-brüchen durch immunfluoreszenz-mikroskopie

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Die Reparatur der Doppelstrang-Brüche (DSB) in DNA ist ein hochgradig koordinierten Prozess, erfordern die Bildung und Auflösung der Reparatur Multi-Protein-komplexe. Dieser Prozess wird durch eine Vielzahl von Proteinen, die der Verein zu fördern und Abgrenzung von Proteinen an dieser Läsionen geregelt. Vielen Dank im großen Teil auf die Fähigkeit, funktionale Bildschirme eine riesige Bibliothek von Proteinen führen, gibt es eine größere Wertschätzung der Gene für die Doppel-Strang DNA Bruch Reparatur notwendig. Oft Knockout oder chemischen Inhibitors Bildschirme identifizieren Proteine beteiligt Reparaturprozesse mithilfe erhöhte Toxizität als Marker für ein Protein, das für DSB-Reparatur erforderlich ist. Zwar nützlich für identifizierende neuartige zelluläre Proteine, die bei der Aufrechterhaltung der Genom-Treue, erfordert Funktionsanalyse die Bestimmung der ob das Protein des Interesses Lokalisierung, Bildung oder Auflösung von Reparatur-komplexe fördert.
Die Anhäufung von Reparatur-Proteine kann ohne weiteres als unterschiedliche nuklearen Brennpunkte durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie erkannt werden. So können Assoziation und Dissoziation dieser Proteine an Standorten von DNA-Schäden durch die Beobachtung dieser nuklearen Brennpunkte in repräsentativen Abständen nach der Induktion der Doppel-DNA-Strangbrüche zugegriffen werden. Dieser Ansatz kann auch falsch lokalisierten Reparatur-Faktor-Proteine, identifizieren, wenn Reparatur Mängel nicht gleichzeitig mit unvollständigen Verzögerungen bei der Reparatur auftreten. In diesem Szenario können langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen entwickelt werden zum Ausdruck bringen, eine seltene schneiden Endonuklease (z.B. SceI) in den Zellen wo die Anerkennung-Website für das besagte Enzym in das zelluläre Genom integriert wurde. Die daraus resultierende Läsion ist besonders schwer zu lösen, wie treu Reparatur wird das Enzym Anerkennung Website, woraufhin eine weitere Runde der Spaltung wieder einzuführen. Infolgedessen sind Unterschiede in der Kinetik der Reparatur beseitigt. Wenn Reparatur komplexe nicht gebildet werden, hat Lokalisierung behindert worden. Dieses Protokoll beschreibt die Methodik, die notwendigen Änderungen in Reparatur Kinetik sowie Reparatur Protein Lokalisierung zu identifizieren.

Abbildung 1 zeigt die Auswahl der richtigen Lärm Diskriminierung für Maxima/Brennpunkte Quantifizierung mit ImageJ. Die zusammengeführten Bilder von DAPI und Reparatur Proteins des Interesses sind auf der linken Seite. Abbildung 1A zeigt eine Lärm Diskriminierung von 90 und markiert die korrekte Anzahl der Herde. Kerne auf der Kante (dargestellt mit einem rosa Pfeil) und Herde außerhalb der Kerne (dargestellt mit einem gelben Pfe...

Reparatur von Doppel-Strang DNA-Brüchen ist ein dynamischer Prozess, erfordern nicht nur Bildung von Reparatur-komplexen in den Pausen, sondern auch deren Auflösung nach die Läsion gerichtet ist. Hier verwenden wir Immunfluoreszenz-Mikroskopie für vorübergehende und dauerhafte Doppelstrang-Brüche als Werkzeug dieses Genom-Wartung-Mechanismus zu sezieren.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der DNA-Reparatur zu beantworten, z. B. wie die Bildung, Lokalisierung und Auflösung von DNA-Reparaturkomplexen reguliert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Veränderungen eindeutig erkennen und komplexe Lokalisationen und Kinetiken reparieren kann. Zusätzlich zu diesen Studenten in meinem Labor werden drei Doktoranden die Experimente durchführen.Das werden Changkun Hu, Dalton Dacus und Stephen Walterhouse sein. Züchten Sie zunächst U2OS/DR-GFP-Zellen auf einer 10 Zentimeter großen Gewebekulturplatte, bis sie zu 85 bis 90 % konfluent sind. Entfernen Sie dann das Medium, fügen Sie drei Milliliter EDTA hinzu und inkubieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei Raumtemperatur.Ersetzen Sie das EDTA durch einen Milliliter Trypsin und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann fünf Milliliter DMEM hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Nach dem Zählen der Zellen sechsmal 10 bis zur dritten Zelle pro Vertiefung in 200 Mikroliter Medium in einer 96-Well-Platte mit Glasboden aussäen.Alternativ säen Sie viermal 10 bis zu den sechs Vertiefungen in acht Milliliter Med

characterizing-dna-repair-processes-at-transient-long-lasting-double

Research

Forschung

JoVE Journal

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Dieser Artikel beschreibt, GFP-basierte...

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmethode, um die Lokalisation der DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an den Stellen von Doppelstrang-DNA-Brüchen in bestrahlten Zellkernen sichtbar zu machen.

Immunfluoreszenz-basierte Visualisierung von DNA-Reparaturprotein-Interaktionen

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Schadensreaktionsproteine, die an den Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen in menschlichen mononukleären Zellen lokalisiert sind. Die Proteine werden von spezifischen Primärantikörpern erkannt, die wiederum an Fluorophor-markierte Sekundärantikörper binden, die während der mikroskopischen Visualisierung fluoreszieren, was die Visualisierung der Proteine als unterschiedliche Fluoreszenzherde...

Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen

Hier wird gezeigt, wie der in situ Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden kann, um die direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 in Suspensionszellkulturen, die genotoxischen Stress ausgesetzt sind, zu detektieren und zu visualisieren.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

Die strahlungsinduzierte DNA-Schadensreaktion, die durch Neutronen-Mischstrahl aktiviert wird, das in der Bor-Neutronen-Capture-Therapie (BNCT) verwendet wird, ist nicht vollständig etabliert. Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren zum Nachweis von strahlungsinduzierten Brennpunkten (RIF) von Reparaturproteinen durch Immunfluoreszenzfärbung in menschlichen Darmkrebszelllinien nach Bestrahlung mit dem Neutronenmischstrahl.

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Dieser Artikel stellt wesentliche Schritte der Immunfärbung und Chromatin-Immunpräzipitation vor. Diese Protokolle werden häufig verwendet, um DNA-schädigende zelluläre Prozesse zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, zu visualisieren und zu quantifizieren.

Visualisierung und Quantifizierung endonukleasebasierter ortsspezifischer DNA-Schäden

Das folgende Protokoll zeigt den Nachweis einzelsträngiger DNA-Foci in der G1-Phase des Zellzyklus unter Verwendung von Zellzyklussynchronisation, gefolgt von RPA2-Immunfluoreszenzfärbung.

Visualisierung einzelsträngiger DNA-Herde in der G1-Phase des Zellzyklus

Lernen Sie die Immunfluoreszenz-Mikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur in U2OS/DR-GFP-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Reparaturkomplex-Dynamik und Genomstabilität.

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

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