Name: Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie die Charakterisierung aquatischer Biofilme mit Durchflusszytometrie und visuellem Clustering. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse von Biofilmzusammensetzung und Schadstoffnachweis.

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Die vorgestellte Arbeit wurde von einem SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) und ein Velux-Forschungsstipendium (Amplebig) unterstützt. Wir möchten Bettina Wagner für Hilfe bei der experimentellen Arbeit zu danken.

(1) Ökosystem Auswahl und Biofilm-Sampling
<ol><li>Wählen Sie eine aquatische Ökosystem von Interesse und finden Sie Probenahmestellen wo Biofilme wachsen zu. Flache Teile eines Baches mit langsam zum Medium Wasser fließen und einen steinigen Flussbett zur Befestigung der Biofilm sind geeignete17,18.</li>
	<li>Optional: Wenn die Website nicht genügend Flächen zur Befestigung der Biofilm zu verringern und einen die Biofilme Variabilität innerhalb einer Website haben, setzen Sie künstlichen Substraten für Biofilm-Anlage (z.B. Glas-Objektträger, keramische Fliesen) Ortsbild, gleichzeitig aber dafür sorgen, dass Sie befinden sich in der gleichen Richtung in Bezug auf den Wasserfluss und ähnliche Tiefe und Intensität des Lichts19.</li>
	<li>Um festzustellen, die Umweltbedingungen der Probenahme-Website, verwenden tragbare Messgeräte zur Messung der Lichtintensität, ist Temperatur, Leitfähigkeit, Sauerstoff und pH-Wert direkt über der Oberfläche Biofilm, entnommen werden. Im Laufe der Probenahme Maßnahmen Sie wiederholt (3 – 5) um Mittelwerte zu berechnen.</li>
	<li>Optional: Nehmen Wasserproben Ermittlung relevanter Wasser Chemie Parameter (gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC), K+, Na+, Ca2 +, Mg2 +, Cl–, F-, SO42 -, PO42- , Keine32-, SiO44-).</li>
	<li>Mit Schutzhandschuhen, sammeln Sie vergleichbare Steinen (Größe, Form und Art) von jeder Seite (oder künstlichen Substraten). Die Stones sollten ähnliche Flow und Lichtverhältnissen18ausgesetzt werden.</li>
	<li>Filtern Sie genug Strom Wasser von der Website durch 0,22-μm-Filter, so dass es für alle gesammelten Proben (z. B. 15 mL pro Probe) bereit ist.</li>
	<li>Verwenden Sie eine weiche Zahnbürste zum Entfernen des Biofilms vom Substrat in einer Flasche (Bürste, bis alle Biofilm entfernt wird) mit 15 mL gefiltertem Strom Wasser20.</li>
	<li>Befestigen Sie die Proben in 0,01 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd21.</li>
</ol>2. Bestimmung der optimalen Durchfluss-durchflusszytometrischen (FC) Parameter
<ol><li>Teilproben auf einem Lichtmikroskop übertragen (mit einem 40 X / 0,75 Ziel; verwenden Sie ggf. ein 100 × 1,3-Öl-Ziel) und identifizieren die Artenvielfalt in den Proben22,23.</li>
	<li>Bestellung identifiziert einzelne Spezies aus entsprechende Kultur Sammlungen (z.B. experimentelle Phykologie und Kultur Sammlung von Algen an der Universität Göttingen [EPSAG] oder Kultur Sammlung von Algen an der Universität zu Köln [CCAC] Wenn die Überwachung in den zentralen europäischen Ökosystemen erfolgt).</li>
	<li>Wachsen Sie die einzige Art in ähnlicher Umweltbedingungen (z. B. Licht, Temperatur, pH-Wert) kontinuierlich an die Umgebung, die, der die Biofilm Proben entnommen wurden. Innerhalb von 1 ° C und 0,5 pH-Punkt aus der Umweltproben empfiehlt.</li>
	<li>Zum lösen/Dispergieren der Zellen, 15 mL der einzelnen Arten Proben in Zentrifuge Röhren und legen Sie die Rohre in der Mitte von einem Wasserbad und Tauchen Sie, so dass die flüssige Oberfläche der Probe auf dem gleichen Niveau wie die Oberfläche des Bades ist. Beschallen Sie die Proben 1 min 45 kHz24,25.</li>
	<li>Notieren Sie die Absorption und Fluoreszenz Spektren der einzelnen Arten mit einem Teller-Reader. Entnehmen Sie bitte Platte Leser Wahl für Anweisungen. In diesem Beispiel 96-Well Flachboden transparenten Polystyrol-Platten wurden mit 200 µL Probenvolumen geladen und Extinktion gemessen. (Einstellungen verwendet: (a) Fluoreszenz-Scan-Modus; Emission Wellenlänge Schritt Größe 10 nm, Emission Scan Nummer 30, Bandbreite 20 nm, gewinnen 100, 25 Blitze, 20 US Scan Zeit oder (b) Absorption Integrationsmodus; 25 Blitze, Bandbreite 9 nm).</li>
	<li>Richten Sie das Durchflusszytometer mit Laser, dichroitischen Splitter und Filter, die in Kombination diese fluoreszierende Bereiche abdecken, in denen verschiedene Arten bestimmte Eigenschaften haben. Für zentrale europäische Ströme, ein 405 nm, 488 nm und 638 nm Laser brauchbare Ergebnisse produzieren.</li>
	<li>Passen Sie die Spannungseinstellung von den Photomultipliern (gilt nicht für alle fließen Cytometers) und das Leistungsspektrum der gemessenen Ausblühungen um mehr als 99 % aller Ereignisse der Proben erweitert.</li>
	<li>Alternativ, wenn Kenntnisse über Artenvielfalt in den Biofilmen verfügbar ist, beginnen Sie mit Schritt 2.2. Wenn fluoreszierende Eigenschaften bekannt sind, beginnen Sie mit Schritt 2.6.</li>
</ol>3. optional: Vorbereitung einer Flow-durchflusszytometrischen Referenzdatenbank
Hinweis: FC erlaubt keine taxonomische Identifizierung der Zellen in den Biofilm. Eine Referenzdatenbank FC Messungen einzelner Arten bekannt, vorhanden in den Biofilmen, unter ähnlichen Bedingungen wie die Biofilme gewachsen sein helfen bei der Interpretation der Daten.
<ol><li>
Hinweis: einzelne Spezies
	<ol>
<li>Mit den optimierten Parametern FC 2,5 – 7 einrichten, die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der einzelnen Arten (in Paraformaldehyd und Glutaraldehyd fixiert und durch Filter von geeigneter Größe für das Durchflusszytometer gefiltert) zu messen.</li>
		<li>Normalisieren Sie die Daten von einzelnen Arten in der gleichen Weise wie die Daten aus den Biofilmen (siehe Schritt 6.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Referenz: beschädigte und zerfallende Zellen Einer der wichtigsten Indikatoren der Biofilm-Gesundheit ist der Anteil der beschädigt/sterben Zellen im Biofilm vorhanden. Zur Quantifizierung dieser Zellen kann ein Verweis der verfallenden Zellen hergestellt werden.<ol>
<li>Nehmen Sie 1 mL Teilproben von verdünnten Biofilmen und Zentrifugieren sie bei Raumtemperatur bei 8.000 X g für 10 Minuten in einer Tischplatte Zentrifuge. Das resultierende Pellet in 1 mL 90 % Ethanol auszusetzen und die Suspension über Nacht bei 4 ° c Lagern Am nächsten Tag wiederholen.</li>
		<li>Mit der optimierten FC-Einstellungen, Messen Sie die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der beschädigten und zerfallenden Zellen (fixiert und gefiltert).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Referenz: mikroplastik Hinweis: bei Interesse bei der Überwachung der Microplastic Partikel in den Biofilmen, prüfen Sie, ob sie genug unterscheiden sich von biotischen Partikel in der optischen und Fluoreszenzeigenschaften zur Identifikation.<ol>
<li>Auszusetzen Sie die Microplastic Partikel gemäß den Anweisungen des Herstellers mikroplastik und Messen Sie ihre optischen und fluoreszierenden Eigenschaften (mit FC-Parameter von 2,7).</li>
		<li>Der Biofilm-Probe die Microplastic Partikel hinzu und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C.</li>
		<li>Filtern Sie die Federung und Messen mit der gleichen FC-Parametern wie oben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Probieren Sie Zubereitung und Lagerung
<ol><li>Nachdem die FC eingerichtet wurde und die FC-Referenz-Datenbank bereit ist, kann man mit der Auswertung der frischen Biofilm Proben entsprechend Schritte 1.1 – 7 Vorgehen. Zum lösen/Dispergieren der Biofilm, übertragen Sie 15 mL der Proben aus den Kolben (siehe Schritt 1,7) in Zentrifuge Rohre.</li>
	<li>Setzen Sie jedes Rohr in der Mitte von einem Wasserbad und Tauchen Sie, so dass die flüssige Oberfläche der Probe auf dem gleichen Niveau wie die Oberfläche des Bades ist. Beschallen Sie die Proben 1 min bei 45 kHz.</li>
	<li>Befestigen Sie die Proben in 0,01 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd (bestand im Nanopure Wasser). Lagerung bei 4 ° C bis zur Analyse bereit.</li>
	<li>Wichtig: Verwenden Sie die Hälfte der Proben für die Durchflusszytometrie Analyse und halten Sie die Hälfte im Speicher für Sicherheit und optional Validierung mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und/oder Lichtmikroskopie (siehe Abschnitt 6). Beachten Sie: gespeichert in den Kühlschrank stellen, sollten die festen Biofilm Proben ihrer optischen und fluoreszierenden Eigenschaften für bis zu drei Wochen halten.</li>
</ol>5. Ausführen des Beispiels durch den FC
<ol><li>Wenn die Proben im Kühlschrank aufbewahrt wurden, Beschallen sie schnell oder pipette mehrmals, um die Partikel zu trennen. Filtern Sie die Teilproben mit 50 μm-Filter (Filtergröße hängt die Breite der FC Kapillare) vor der Messung.</li>
	<li>Laden Sie die einzelnen Samples (1 – 2 mL, dies hängt von der Durchflusszytometer verwendet) in das Durchflusszytometer und die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften jedes Teilchens zu messen. Wiederholen Sie die Messung dreimal pro jedes biologische replizieren (drei technische Wiederholungen).</li>
	<li>Exportieren Sie die Daten aus der FC im CSV-Format.</li>
</ol>6. die Datenaufbereitung und Korrelationsanalyse
FC kann mehrere Parameter (z.B.Signalbereich, Höhe, Breite) für jeden gemessenen optischen Eigenschaften und Fluoreszenz-Bereich analysieren. Führen Sie eine Korrelationsanalyse auf den Messgrößen und halten Sie nur die Messungen, die nicht stark korreliert sind. Dadurch entfällt in der Regel alle, aber ein FC-Parameter (z.B. Signalbereich) und können auch entfernen stark korreliert fluoreszierende Messungen (in der Regel die aus dem gleichen Laser und benachbarten Filter).
<ol><li>
CYT als eine Toolbox in Matlab ausführen:
	<ol>
<li>Der reduzierten FC Importdaten im CSV-Format aus den Proben, die analysiert werden, in die CYT Software16, einschließlich aller technischen und biologischen repliziert. (Klicken Sie auf + Datei *.CSV zu filtern, wählen Sie Dateien für den Import).</li>
		<li>Die fluoreszierende Kanäle aller Proben, die Verwendung der hyperbolischen ARCSIN Transformation zu verwandeln. Der Wert der Cofaktor muss ausgewählt werden; für bestimmte Versuchsaufbauten und heterotrophen Biofilme werden 150 Werke für die meisten phototrophe Biofilme und fließen Cytometers sondern Optimierung. (Right-Click/Transform/geben Sie Cofaktor 150)</li>
		<li>Für die Qualitätskontrolle visuell zu vergleichen (im CYT) die Histogramme der einzelnen Proben und optische und fluoreszierende Einzelkanäle um sicherzustellen, dass die technischen und biologischen Ebene der Replikation gibt es keine Ausreißer. Ausreißer werden in deutlich verschobenen Leuchtstoff/optische Verteilungen zwischen den Wiederholungen manifestieren. (Daten auswählen, wählen Sie Kanal, Plot)<ol>
<li>Alternative: laufen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) auf die mittlere Werte der fluoreszierenden Distributionen und stellen Sie sicher, dass technische und biologische Wiederholungen zusammen gruppieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zusammenführung der technischen in jedem biologischen Replikation repliziert und Teilstichprobe der biologischen repliziert, so dass jeweils die gleiche Anzahl von Teilchen (Zellen, Zelle Fragment und abiotischen Partikeln) vertreten ist und damit die Gesamtzahl der Partikel durch analysiert Barnes-Hütte stochastische Nachbar einbetten (bh-SNE) ist rund 150.000 (für beste Visualisierung Ergebnisse26). (Wählen Sie Daten, Rechte Maustaste, Merge/Teilstichprobe)</li>
		<li>Für den Vergleich zwischen Proben ist es wichtig, nur diese Proben auswählen, die verglichen werden sollen. Wählen Sie die Proben und führen Sie bh-SNE27. Sobald der Algorithmus beendet, neue Kanäle ist, erscheinen benannte bh-SNE1 und bh-SNE2. Dies sind die SNE-Koordinaten aller analysierten Partikel, die verwendet werden können, um die Daten in einem Streudiagramm (ViSNE Karte) zu visualisieren. (Daten auswählen, wählen Sie Kanäle, Rechte Maustaste, bh-SNE, ja normalisierten Daten)</li>
		<li>Partikel sind in der Karte ViSNE nach Ähnlichkeit positioniert und in optisch trennbar Cluster gruppiert. Überprüfen Sie den optische/fluoreszierende Eigenschaften der Cluster und Mark und Namen sind gut getrennt und haben verschiedene optische/Fluoreszenzeigenschaften von mit den Zeichenwerkzeugen in CYT erhältlich. (Wählen Sie Kanal bh-SNE1, bh-SNE2)</li>
		<li>Optional: Wenn eine Referenzdatenbank von mikrobiellen Spezies (gemessen mit der gleichen Durchflusszytometrie Einstellung und unter ähnlichen Bedingungen gewachsen!) zur Verfügung steht, ViSNE Karten in Matlab exportieren und die Karten die Referenzdatenbank projizieren. Auf diese Weise können bestimmte Cluster an bestimmten Arten/taxonomischen Gruppen (Skripte zum Download unter https://github.com/anzezupanic/FC_analysis) angeschlossen werden. (Sitzung/speichern)</li>
		<li>Problembehandlung: Wenn die bh-ans-Analyse nicht optisch trennbar Cluster, sondern eine einzige große zurück, zu viele Partikel in der bh-ans dienten. Wiederholen Sie den Vorgang mit weniger Partikel pro Probe. Wenn es keine Cluster, aber eher spärlich Einzelpunkte gibt, erhöhen Sie die Anzahl der Teilchen verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optional: Anstatt auf bh-SNE für das clustering, andere clustering Methoden (z.B.hierarchische, Schwerpunkt-basierte oder Dichte basierend clustering) verwendet werden können auf die normalisierten Daten und dann überlagert die ViSNE Karte (https://github.com/ Anzezupanic/FC_analysis).</li>
	<li>Sobald der Cluster identifiziert wurden, die Anzahl der Teilchen pro Cluster gehören zu jedem biologischen replizieren in jeder Probe. Bewerten Sie Unterschiede zwischen den Proben mit ANOVA und Tukey Test mit entsprechenden (z. B.Holmes) Korrektur für mehrere Vergleich.</li>
</ol>7. optional: Validierung von Cluster-Interpretation mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung
<ol><li>Sobald der Cluster identifiziert haben, verwenden Sie Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS), um sie aus den Proben, wenn gewünscht, zu sortieren, sofern die FACS (identische oder ähnliche) Konfiguration von Lasern und fluoreszierenden Filter hat.</li>
	<li>Für jeden identifizierten Cluster bietet CYT optische und fluoreszierende Tore, die den Cluster zu definieren. Verwenden Sie diese Tore zu sortieren, die Partikel in jedem Cluster mit dem FACS und dann die sortierten Zellen mittels Lichtmikroskopie zu identifizieren.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das oben beschriebene Protokoll ist relativ einfach zu implementieren. Während die vorgestellten Standardeinstellungen für alle phototrophe Biofilm getestet bisher geeignet gezeigt wurden, ist jedoch Optimierung (wie im Protokoll beschrieben) notwendig, die Informationen aus der Methode zu maximieren. In der Tat, die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften von Biofilmen können variieren, abhängig von den Umgebungsbedingungen (Jahreszeit, Temperatur, chemische Zusammensetzung des Wassers)1. Da...

Biofilme sind dynamische Konsortien von Mikroorganismen, die eine in Süßwasser-Ökosystemen, Primärproduktion Schlüsselrolle, nährstoffkreisläufe und Wasseraufbereitung bis hin zu beeinflussen die Verteilung der Mikroorganismen und ihrer Artenvielfalt des Ökosystems 1. wenn Biofilme an sich verändernde Umweltbedingungen oder Stressoren, wie Chemikalien, ausgesetzt sind rückt die Gemeinschaftsstruktur schnell toleranter Arten2,3. Ihre hohe Empfindlichkeit verwandelt sich Biofilme in attraktive Modellsysteme für ökologische Überwachung4, jedoch keine der aktuellen Methoden perfekt geeignet ist, um die Dynamik einer Biofilm-Gemeinschaft tatsächlich in eine schnelle und einfache Weise zu verfolgen.
Die häufig verwendete Satz von Methoden zur Charakterisierung von Biofilmen besteht aus der Messung der funktionellen und strukturellen Endpunkte. Auf der Ebene der gesamten Gemeinschaft enthält Photosynthese und Atmung sowie die Aktivität extrazellulärer Enzyme Informationen über den Funktionszustand der Biofilm5,6,7,8 ,9. Biomasse-Abgrenzung dient als Indikator für Gesamtwachstum Biofilm. Strukturelle Veränderungen sind derzeit entweder mit traditionellen speziesidentifizierung mit Lichtmikroskopie oder Nukleotid-basierte Techniken (z.B.Denaturierenden Gradienten Gelelektrophorese (DGGE), automatisierte ribosomale intergenetischer Distanzstück gemessen. Analyse (ARISA), Metagenomik)10,11,12. Diese Methoden informieren, sondern sind zeitaufwendig, durchzuführen, oder erfordern spezielle Kenntnisse oder sind noch in der Entwicklungsphase. Schließlich neue Methoden zur Bewertung der extrazelluläre Polymere Substanzen (EPS)13,14 und der Biofilm Architektur1, während der empfindlichen, sind niedrig-Durchsatz und noch nicht in Richtung entwickelt worden Überwachungszwecke.
Es ist offensichtlich, dass für eine vollständige Charakterisierung von Süßwasser Biofilmen, es notwendig ist, verschiedene Methoden, die Einblick in die Biofilm-Funktion, die Zusammensetzung und die Architektur zu kombinieren. Für die Umweltüberwachung, auf der anderen Seite ist eine schnelle und empfindliche Methode, die ist erkennen Veränderungen im Biofilm und ermöglichen grundlegende biologische Deutung der Verschiebungen auf die funktionellen und strukturellen Ebene, erforderlich.
Wir haben eine neue Methode zur Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft der phototrophe Komponente von Stream Biofilmen (Periphyton), entwickelt, ist schnell genug für Überwachungszwecke und gleichzeitig ausreichend informiert über den Biofilm-Gemeinschaft Struktur, biologische Deutung15zu ermöglichen. Es basiert auf einzellige Durchflusszytometrie (FC) der Biofilm Proben und gepaart mit computergestützten Visualisierung und bietet Informationen über optische und fluoreszierende Eigenschaften des Biofilms auf der Ebene der einzelnen Zelle.
Der Workflow nach der Probenahme Biofilm besteht der Probenvorbereitung in Form von Beschallung, Fixierung und Größe-basierte Filterung der Proben, gefolgt von der Beurteilung der Probenmaterials durch Durchflusszytometrie. Die erfassten Daten geben Auskunft über mehrere zellulären Eigenschaften in einer einzigen Messung: Partikelgröße, Dichte, Pigmentanteil, abiotische Inhalte (z. B. mikroplastik) im Biofilm. Dieser Satz von Daten ist als über computergestützte Visualisierung mit visuellen stochastische Nachbar einbetten (ViSNE)16, ermöglicht schnelle und einfache Interpretation der Daten analysiert. Obwohl ein paar Wochen erforderlich sind, um einrichten und optimieren die Methode einmal eingerichtet, es dauert nur wenige Stunden von den Biofilm Probenahmen zur Interpretation der Ergebnisse.
Die wichtigsten Vorteile der vorgestellten Methode gegenüber anderen sind die Geschwindigkeit der Analyse und hohen Informationsgehalt. Darüber hinaus können die Proben für mehrere Wochen nach der Entnahme ohne Verlust von ihren optischen und Fluoreszenzeigenschaften gespeichert werden. Dies kann sehr nützlich sein bei der Charakterisierung von einer großen Anzahl von Proben ist erforderlich, wie z. B. große Stichproben Studien oder Biomonitoring-Programme, sondern bieten auch eine beträchtliche Menge an Informationen in kleinere explorative Studien.
Die vorgestellte Protokoll basiert auf Fluss-durchflusszytometrischen Analyse von phototrophe Biofilmen (Periphyton) von verschiedenen Standorten eines Baches gesammelt. Viele Schritte des Protokolls, z. B. die Auswahl der Standorte für Überwachungszwecke, die Ziele der Forschung abhängig und daher können nicht verordnet werden. Andere weniger Freiheit ermöglichen und erfordern, dass das Protokoll aufmerksam verfolgt, wird in das ausführliche Protokoll unten deutlich.
Das Protokoll beginnt mit der Auswahl der Standorte für Biofilm-basiertes Umweltmonitoring. Der nächste Schritt ist Setup Durchflusszytometer (FC), so dass seine Messungen Diskriminierung zwischen verschiedenen phototrophe Organismen in Biofilmen in der überwachten Umgebung ermöglichen. Dies erfolgt durch das Sammeln von Biofilm-Proben von den Sites, identifizieren die fluoreszierenden Eigenschaften der verschiedenen Arten in den Biofilm und Einrichten der Durchflusszytometer mit Laser und Filter, die Messung an den entsprechenden optischen aktivieren Wellenlängen. Nachdem die FC Aufbau wurde, können Biofilme werden gesammelt von den Seiten in regelmäßigen Abständen die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der einzelnen Partikel in den Biofilm-Durchflusszytometrie gemessen und die Daten analysiert durch visuelle clustering. Für bessere Interpretation der Ergebnisse ist es möglich, eine FC-Referenzdatenbank von lokalen Biofilm-Lebewesen und ihre Phänotypen zu bauen und die Datenbank verwenden, um verschiedene Taxonomien in den FC-Daten zu identifizieren. Die Validierung ist möglich durch Fluoreszenz basierende Sortierung der identifizierten Cluster von Einzelzellen mit FACS und Mikroskopie-basierte taxonomische Identifizierung der vorliegenden Art. Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1aufgeführt.

<table><tbody><tr><td>Multimeter</td><td>WTW</td><td>MultiLine 3620 IDS</td><td>Zur Messung von Temperatur, pH-Wert, gelöstem Sauerstoff</td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>VWR International</td><td>97043-986</td><td>Tankabmessungen: 15*14*10 cm</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Gallios Laser: 405, 488 und 638 nm. Filtert die Bänder in der ergänzenden Tabelle 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.&nbsp;</td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>zur Auswahl der geeigneten Einstellung des FC-Zellsortierers</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td>Einstellungen in der ergänzenden Tabelle 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td>Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0,75 Objektiv</td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2013a</td><td>Software für numerisches Rechnen</td></tr><tr><td></td><td>CYT Dana Pe'er Lab</td><td>Version 1.1</td><td>kostenloses interaktives Visualisierungstool zur Analyse von Zytometriedaten</td></tr></tbody></table>

charakterisierung der aquatischen biofilme mit durchflusszytometrie

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilme sind dynamische Konsortien von Mikroorganismen, die eine Schlüsselrolle in Süßwasser-Ökosystemen spielen. Durch die Veränderung ihrer Gemeinschaftsstruktur, Biofilmen schnell auf Veränderungen der Umwelt reagieren und können somit als Indikatoren für die Qualität des Wassers verwendet werden. Derzeit basiert Biofilm Bewertung meist auf integrative und funktionalen Endpunkte wie photosynthetische oder Atemwege Tätigkeit, die keine Informationen über die Struktur der Biofilm-Gemeinschaft bieten. Durchflusszytometrie und computergestützte Visualisierung bieten eine alternative, sensibel und leicht zu bedienende Methode zur Beurteilung der Gemeinschaft Zusammensetzung, insbesondere von den photoautotrophen Teil von Süßwasser Biofilmen. Es erfordert nur grundlegende Probenvorbereitung, nach deren Ablauf die gesamte Probe durch das Durchflusszytometer ausgeführt ist. Die einzelligen optische und fluoreszierende Informationen wird für computergestützte Visualisierung und biologischen Interpretation verwendet. Die wichtigsten Vorteile gegenüber anderen Methoden sind die Geschwindigkeit der Analyse und der hohe Informationsgehalt Natur. Durchflusszytometrie liefert Informationen über verschiedene Zell- und Biofilm Eigenschaften in einer einzigen Messung: Partikelgröße, Dichte, Pigmentanteil, abiotische Inhalte in den Biofilm und groben taxonomische Informationen. Jedoch bietet es keine Informationen über Zusammensetzung der Biofilm auf Artniveau. Wir sehen hohes Potential bei der Verwendung der Methode für die Umweltüberwachung aquatischer Ökosysteme und als erste Biofilm Evaluation Schritt, die stromabwärts informiert detaillierte Untersuchungen durch ergänzende und genauere Methoden.

Mit dem Verfahren hier vorgestellten (Abbildung 1), wurden Proben aus mehreren Standorten von einem lokalen Strom in der Schweiz analysiert. An jedem Standort drei ähnliche große Steinen (10 – 12 cm) entstanden und Biofilmen waren die Stones abgebürstet. Die Proben wurden dann beschallt, fixiert, gefiltert und später durch Durchflusszytometrie analysiert. Das Setup der Durchflusszytometer und Referenz-Datenbank verwendet, waren die gleichen wie in einem frühe...

Durchflusszytometrie in Kombination mit visuellen clustering bietet eine einfach zu bedienende und schnelle Methode zur Untersuchung von aquatischer Biofilms. Biofilm-Charakterisierung, Erkennung von Veränderungen in der Struktur der Biofilm-Gemeinschaft und die Detektion von abiotischen Partikeln eingebettet im Biofilm einsetzbar.

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Umweltwissenschaften zu beantworten, wie z.B. die Auswirkungen chemischer Verschmutzung oder des Klimawandels auf aquatische Ökosysteme. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass alle einzelnen Schritte einfach und schnell durchzuführen sind. Obwohl der Schwerpunkt des Verfahrens auf der Charakterisierung autotropher Biofilme liegt, kann es auch zur Charakterisierung heterotropher Biofilme und zum Nachweis von partikelförmigen Schadstoffen wie Mikroplastik verwendet werden.Wählen Sie zunächst einen aquatischen Probenahmeort aus, an dem Biofilme wachsen, dies sind typischerweise flache Teile von Bächen mit langsamer bis mittlerer Wasserströmung und steinigen Flussbetten. Wenn die Stelle nicht genügend Oberfläche für die Anbringung von Biofilmen hat, können Sie künstliche Substrate verwenden, auf denen Biofilme wachsen können. Messen Sie die Umgebungsbedingungen an der Probenahmestelle mit tragbaren Instrumenten, um Leitfähigkeit, pH-Wert, Wassertemperatur und Lichtintensität direkt über der Oberfläche des zu beprobenden Biofilms zu messen.Sammle mit Schutzhandschuhen Steine von jedem Ort ein, die in Größe, Form und Art ähnlich sind. Die Steine sollten aus Bereichen entnommen werden, die ähnlichen Strömungs- und Lichtverhältnissen ausgesetzt sind. Neben der Entnahme von Biofilmproben und der Messung der Wachstumsbedingungen vor Ort erhalten Sie Wasserproben zur Messung wasserchemischer Parameter.Um die Biofilmproben zu verarbeiten, filtrieren Sie zunächst 15 Milliliter Bachwasser von der Stelle durch einen 0,22-Mikrometer-Filter. Entfernen Sie dann mit einer weichen Zahnbürste den Biofilm vom Substrat, bis er vollständig in einem Kolben aufgehängt ist. Fixieren Sie die Biofilmproben mit 0,01 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd.Übertragen Sie Teilproben des Biofilms in ein Lichtmikroskop. Wenden Sie sich der für Ihre Probe geeigneten Vergrößerung zu und identifizieren Sie die in den Biofilmproben vorhandenen Spezies. Bereiten Sie Kulturen für die einzelnen Arten vor.Züchten Sie sie kontinuierlich unter ähnlichen Umweltbedingungen wie in der Umgebung, aus der die Biofilmproben entnommen wurden. Sobald sie gewachsen sind, dispergieren Sie die Zellen, indem Sie sie fünf bis 10 Sekunden lang bei 45 Kilohertz beschallen. Legen Sie die dispergierten Zellen in eine 96-Well-Platte.Nach der Dispergierung zeichnen Sie die Absorptions- und Fluoreszenzspektren der einzelnen Spezies mit einem Plattenlesegerät auf. Als nächstes richten Sie das Durchflusszytometer mit dichroitischen Splittern und Filtern ein, um die Fluoreszenzbereiche abzudecken, in denen die verschiedenen Spezies spezifische Eigenschaften aufweisen. Um eine Referenz für eine einzelne Spezies zu erstellen, verwenden Sie die optimierten Durchflusszytometrie-Parameter, um die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften einzelner Spezies zu messen.Bereiten Sie anschließend beschädigte und zerfallende Zellen vor, indem Sie eine Teilprobe von einem Milliliter verdünntem Biofilm entnehmen, sie 10 Minuten lang bei 8.000 g zentrifugieren und dann das Pellet in einem Milliliter 90%igem Ethanol resuspendieren. Lagern Sie die Suspension über Nacht bei vier Grad Celsius und wiederholen Sie den Vorgang am nächsten Tag erneut. Messen Sie mit den gleichen optimierten Durchflusszytometrie-Einstellungen die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der geschädigten und zerfallenden Zellen.Nach dem Einstellen der Parameter des Durchflusszytometers und dem Aufbau der Referenzdatenbank ist es an der Zeit, mit der Probenentnahme für die Überwachungskampagne zu beginnen. Die Proben sollten entnommen und verarbeitet werden, wie in den vorangegangenen Schritten gezeigt, mit der Ausnahme, dass die Beschallung bei 45 Kilohertz eine Minute dauern sollte. Sobald Sie zur Analyse bereit sind, nehmen Sie Proben aus dem Lager.Um eine Verstopfung des Durchflusszytometers zu vermeiden, filtrieren Sie die Teilproben durch 50-Mikrometer-Porenfilter, laden Sie dann ein bis zwei Milliliter der einzelnen Proben in das Durchflusszytometer und messen Sie die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften jedes Partikels. Wiederholen Sie die Messung dreimal für jede Probe. Öffnen Sie MATLAB und führen Sie CYT als Toolbox aus.Importieren Sie dann die Daten der reduzierten Durchflusszytometrie als csv-Datei in die CYT-Software. Verwenden Sie als Nächstes die hyperbolische Arcsine-Transformation, um die Fluoreszenzkanäle aller Proben zu transformieren. Geben Sie 150 als Wert des Co-Faktors ein.Dieser Wert funktioniert für die meisten phototrophen Biofilme und Durchflusszytometer, aber eine Optimierung kann erforderlich sein. Zur Qualitätskontrolle können Sie die Histogramme einzelner Proben und einzelner optischer und fluoreszierender Kanäle grafisch darstellen und visuell vergleichen, um sicherzustellen, dass auf der technischen und biologischen Ebene der Replikation keine Ausreißer vorhanden sind. Ausreißer manifestieren sich in deutlich verschobenen fluoreszierenden optischen Verteilungen zwischen den Replikaten.Führen Sie als Nächstes die technischen Replikate in jedem biologischen Replikat zusammen und unterziehen Sie die biologischen Replikate so, dass jedes durch die gleiche Anzahl von Partikeln repräsentiert wird. Die ideale Anzahl von Partikeln, die mit Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding analysiert werden, liegt bei etwa 150.000. Wählen Sie für den Vergleich zwischen Stichproben nur die Stichproben aus, die verglichen werden sollen, und führen Sie Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding aus.Sobald der Algorithmus abgeschlossen ist, werden neue Kanäle mit den Namen bh-SNE1 und bh-SNE2 angezeigt. Visualisieren Sie die Daten aus den resultierenden Kanälen als Streudiagramm, um alle stochastischen Nachbareinbettungskoordinaten anzuzeigen, die alle analysierten Partikel enthalten. Sind die Cluster visuell nicht trennbar, wurden wahrscheinlich zu viele oder zu wenig Partikel in der Analyse verwendet.Passen Sie die Anzahl der Partikel an und wiederholen Sie die Analyse. In der viSNE-Map werden Partikel nach Ähnlichkeit positioniert und zu visuell trennbaren Clustern gruppiert. Überprüfen Sie die optischen Fluoreszenzeigenschaften der Cluster und markieren und benennen Sie mit den Zeichenwerkzeugen diejenigen, die gut voneinander getrennt sind und unterschiedliche Eigenschaften aufweisen.Exportieren Sie die viSNE-Cluster für die anschließende statistische Analyse in MATLAB. Mit dem hier vorgestellten Verfahren wurden Proben von mehreren Standorten eines lokalen Baches in der Schweiz analysiert. Anhand von viSNE-Karten ist es möglich, zwischen verschiedenen Umweltbiofilmen zu unterscheiden.Hier weisen sechs verschiedene Samples unterschiedliche Dichten in verschiedenen Teilen der viSNE-Karte auf. Die hier gezeigten viSNE-Karten sind mit Partikeln mit unterschiedlichen optischen und Fluoreszenzeigenschaften besiedelt, die Hinweise auf die biotische/abiotische Herkunft der Partikel geben und zu welcher taxonomischen Gruppe die biotischen Partikel gehören. Darüber hinaus kann die Projektion der Referenzdatenbank auf die viSNE-Karte helfen zu interpretieren, welche Teile der Karte von welchen Taxa und/oder abiotischen Partikeln besiedelt sind.Es kann auch festgestellt werden, welche Subpopulationen sich zwischen den Stichproben unterscheiden. Hier wird die Anzahl der Partikel für jede Subpopulation für jedes der verschiedenen biologischen Replikate angezeigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden von der Probenentnahme bis zur fertigen Analyse durchgeführt werden.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung verwendet werden, um die Vorhersagen des visuellen Clusterings zu validieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Durchflusszytometrie und visuelles Clustering zur Analyse aquatischer Biofilme einsetzen können.

characterization-of-aquatic-biofilms-with-flow-cytometry

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Protokoll beschreibt die Anwendung einer Messzelle für wachsende und Analyse von mikrobiellen Biofilmen für konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere...

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Quelle: Chapman, I. J., et al., Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Methode zur Unterscheidung von lebenden und toten Microcystis aeruginosa-Zellen durch die Kombination der Fluoreszenzsondenmarkierung mit der durchflusszytometrischen Analyse der Phycocyanin-Autofluoreszenz und des Sondensignals.

Viabilitätsanalyse von Microcystis aeruginosa mittels Durchflusszytometrie

Es wird ein Protokoll für die gleichzeitige Quantifizierung und den Vergleich von drei zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen vorgestellt. Die Methodik umfasst den Einsatz von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie, Biofilm-Strukturanalyse- und Visualisierungssoftware sowie statistischer Analysesoftware.

Gleichzeitige Quantifizierung zellulärer und extrazellulärer Bestandteile von Biofilmen

Hier präsentieren wir ein umfassendes Protokoll zur Bewertung der Verfügbarkeit organischer und anorganischer Nährstoffe sowie der Häufigkeit und Struktur von mikrobiellen und viralen Gemeinschaften in abgelegenen Meeresumgebungen.

Entwirren der unsichtbaren Spieler im Ozean - ein Feld Führer zu Wasserchemie und Marine Mikrobiologie

Biofilme haben komplexe Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung. Um Biofilm-Umwelt-Wechselwirkungen umfassend zu untersuchen, stellen wir hier eine Reihe von Methoden vor, um eine heterogene chemische Umgebung für die Biofilmentwicklung zu schaffen, die lokale Strömungsgeschwindigkeit zu quantifizieren und den Stofftransport in und um Biofilmkolonien zu analysieren.

Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Mikrobenpopulationen enthalten, die wesentliche Zellheterogenität, das allgemeine Verhalten diktieren können. Molekulare Sonde Analyse durch Durchflusszytometrie können physiologische Zustände von Zellen zu bestimmen, aber ihre Anwendung variiert zwischen den Arten. Diese Studie liefert ein Protokoll, um genau zu bestimmen, Zellmortalität innerhalb von einem Cyanobakterium Bevölkerung, ohne zu unterschätzen oder Aufzeichnungs falsch positiven Ergebnissen.

Molecular Probe-Optimierung, um Zellmortalität in einem photosynthetische Organismen Bestimmen (<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Mittels Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zu wachsen und qualitativ bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen durch konfokale und Elektronenmikroskopie analysiert.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Durchflusszytometrischen Analyse hat für die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik bewährt. Wir präsentieren jeweils drei umfassende Arbeitsabläufe, von der Probenahme zur Datenanalyse, Reinkulturen und komplexen Gemeinschaften in klare Medium ebenso wie anspruchsvolle Matrizen.

Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

Beschreiben wir die Montage, Betrieb, und Reinigung von einem Fluss Apparat Bild Pilz Biofilmbildung in Echtzeit unter fließen sollen. Wir bieten und diskutieren quantitative Algorithmen auf die aufgenommenen Bilder verwendet werden.

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Ansatz zur Messung der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie.

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

Lernen Sie die Charakterisierung aquatischer Biofilme mit Durchflusszytometrie und visuellem Clustering. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse von Biofilmzusammensetzung und Schadstoffnachweis.

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

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