Name: Intrakranielle Subarachnoidal Route der Infektion für die Untersuchung Rollen von Streptococcus Suis Biofilmen in Meningitis in einem Mausmodell der Infektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Erfahren Sie die intrakranielle subarachnoidale Infektionsmethode zur Untersuchung von Streptococcus suis-Biofilmen bei Meningitis im Mausmodell. Diese Technik ermöglicht direkte Analysen immunologischer Reaktionen im Gehirn.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Key Research und Development Program of China [2017YFD0500102]; die National Natural Science Foundation of China [31572544]; die State Key Laboratory ätiologische Veterinärbiologie [SKLVEB2016KFKT005]; Shanghai-Landwirtschaft angewandte Technologie Entwicklung Programm, China [G2016060201].

Die Maus-Infektions-Experimente wurde genehmigt durch das Labor Tier Monitoring Committee der Provinz Jiangsu, China und in Laboratory Animal Center of Nanjing Agricultural University durchgeführt (Anzahl zu ermöglichen: SYXK (Su) 2017-0007).
1. Vorbereitung von Bakterien
Hinweis: S. Suis Serotyp 2 virulenten Stamm P1/7 wurde von einem Kranken Schwein mit Meningitis19isoliert. Sorte P1/7 wuchs in Todd Hewitt Brühe (THB, Formel pro Liter THB: Herz Infusion, 3,1 g Neopeptone, 20,0 g Traubenzucker, 2,0 g, Natriumchlorid, 2,0 g; binatrium Phosphat, 0,4 g; Natriumcarbonat, 2,5 g) und vergoldeten auf Todd Hewitt Agar (THA, Formel pro Liter THA: Herz-Infusion, 3,1 g; Neopeptone, 20,0 g; Traubenzucker, 2,0 g; Natrium-Chlorid, 2,0 g; binatrium Phosphat, 0,4 g; Natriumcarbonat, 2,5 g; Agar, 15,0 g) bei 37 ° C und 5 % CO2.
<ol><li>Sammlung von Stamm P1/7 planktonischen Zellen<ol>
<li>Sammle 5 mL von planktonischen Zellen von Mid Log-Phase Kultur (OD600= 0,6) für 3 min bei 8000 × g zentrifugiert und dann 3 Mal mit PBS waschen.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zellen mit 5 mL 25 % Glycerin in THB, aliquoten in 5 Röhren, und dann speichern bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammlung von Stamm P1/7 Biofilm Zustand Zellen<ol>
<li>Nehmen Sie 20 mL einer Übernacht-Kultur und 180 mL frisch THB hinzufügen; Teilen Sie die verdünnte Kultur in 10 Runden Kultur Platten gleichermaßen, und setzen Sie dann die Platten in einem Inkubator bei 37 ° C in 5 % CO2 für 24 h.</li>
		<li>Nach der Inkubation schütteln die Platte vorsichtig, um die Bakterien aufzuwirbeln, die die Platte nicht eingehalten haben, und verwerfen Sie den Überstand durch Absaugen. Hinweis: Schütteln Sie die Platte leicht und vermeiden Sie resuspending Sediment.</li>
		<li>Hinzugeben Sie 5 mL PBS Biofilm Zustand Zellen zu ernten, völlig das Sediment aufzuwirbeln und übertragen Sie dann die Probe auf eine neue Tube.</li>
		<li>Beschallen die Biofilm Zustand Zellen aus dem letzten Schritt mit den folgenden Parametern: 60 W, 4 Zyklen, 5 s auf und 10 s aus.</li>
		<li>Für 3 min bei 8000 × g zentrifugiert und den Überstand bei-80 ° c Lagern Hinweis: Der Überstand enthält möglicherweise Komponenten von Biofilm und es kann verwendet werden, um den Biofilm-Bakterien vor der Infektion wie beschrieben im Tierversuch (Schritt 3) Aufschwemmen.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie das Sediment mit 10 mL 25 % Glycerin in THB und dann speichern Sie die Biofilm Zustand Zellen bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Scannen Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Analyse
<ol><li>Befestigen Sie den gesammelten Biofilm Zustand Zellen und planktischen Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 12-24 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Die Proben schnell mit destilliertem Wasser spülen und die Proben nacheinander mit einer zunehmenden Konzentration von Ethanol (25 %, 50 %, 70 %, 90 % und 100 %) für 30 min in jeder Lösung zu entwässern.</li>
	<li>Halten Sie die getrockneten Proben um Metall-Halter mit doppelseitigem Klebeband und schließlich in einem Verdampfer mit Gold und Palladium zu beschichten.</li>
	<li>Beobachten Sie die Proben durch ein Rasterelektronenmikroskop mit den folgenden Parametern: EHT (Extra High Tension) = 10 kV; WD (Arbeitsabstand) = 7.0 oder 8.0 mm; Vergrößerung = 5000 ×; Signal A = SE1.</li>
</ol>(3) Tierversuche
<ol><li>Verwenden Sie SPF 6 Wochen alten weiblichen BALB/c Mäusen in dieser Studie. Alle Mäuse durch die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion deren Einstichstelle befindet sich 3,5 mm von der Bregma rostral ist zu infizieren. Die stereotaktischen Koordinaten der Injektionsstelle wurden eindeutig von Chiavolini Et Al17beschrieben.<ol>
<li>Zur histopathologischen Analyse infizieren zwei Gruppen von Mäusen (5 Mäusen pro Gruppe) mit planktonischen Zellen oder Biofilm Zustand Zellen in einer Dosierung von 3 × 107 koloniebildenden Einheiten (KBE), und ein weiteres 5 Mäusen wurden mit PBS als Steuerelement injiziert.</li>
		<li>Für die Erkennung von mRNA Expression von TLR2 und Zytokine im Gehirn, infizieren zwei weitere Gruppen von Mäusen (6 Mäuse pro Gruppe) Zellen mit planktonischen Zellen oder Biofilm Zustand in einer Dosierung von 3 × 107 KBE.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien durch Ausplattieren Verdünnungsreihen an THA.</li>
		<li>Alle Mäuse bei 12 h nach der Infektion für die weitere Forschung einschläfern. Hinweis: Glycerin in das Lager Medium muss vor der Infektion entfernt werden. Sowohl planktonischen Zellen und Biofilm Zustand erholte sich von-80 ° C werden 3 Mal mit PBS gewaschen. Planktonischen Zellen sind dann Nukleinsäuretablette mit PBS und verdünnt, um die geeignete Dosis für Infektion; Biofilm Zustand Zellen sind Nukleinsäuretablette mit der gespeicherten überstand (aus Schritt 1.2.5) und verdünnt, um die entsprechende Dosis für eine Infektion. Das Laufwerk für Infektion sollte nicht mehr als 50 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erkennung von mRNA Expression von TLR2 und Zytokine im Gehirngewebe<ol>
<li>Extrahieren Sie die gesamte-RNS von Hirngewebe mit einem RNA-Extraktion-Kit.<ol>
<li>Verwenden Sie für jede Maus ganze Hirngewebe für RNA extrahieren. Teilen Sie ganze Hirngewebe in 5 Rohre. Bis zu 100 mg Hirngewebe und jedes Rohr, die lysiereinrichtung Matrix zur Verfügung gestellt vom Kit enthält fügen Sie 1 mL Lyse-Lösung hinzu.</li>
			<li>Verarbeiten Sie das Rohr in einem Homogenisator für 40 s bei einer Einstellung von 6.0 und dann Zentrifuge das Rohr bei 12000 × g und 4 ° C für 5 Minuten.</li>
			<li>Übertragen Sie nach Zentrifugation die obere Phase auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch.</li>
			<li>Inkubieren Sie die übertragenen Probe für 5 min bei Raumtemperatur; Fügen Sie 300 µL Chloroform, Wirbel für 10 s, und dann 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 12000 × g und 4 ° C für 5 min. die obere Phase auf einen neuen Schlauch übertragen.</li>
			<li>Das Rohr vor für 5mal invertierenden 500 µL kalten absoluten Ethanol hinzu, und speichern Sie dann die Probe bei-20 ° C für mindestens 1 h.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 12000 × g und 4 ° C für 15 min und Entfernen der Überstand. Waschen Sie die Tablette mit 500 µL kalter 75 % Ethanol in RNase-freie H2O.</li>
			<li>Entfernen Sie das Ethanol, Lufttrocknen das Pellet für 5 min bei Raumtemperatur und Aufschwemmen der RNA in 100 µL RNase-freie H2O.</li>
			<li>Inkubieren Sie die RNA für 5 min bei Raumtemperatur und bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit Hilfe einer RNA Bioanalyzer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Führen Sie die cDNA-Synthese, einschließlich der Beseitigung von genomischer DNA (gDNA), mit einem Thermocycler mit einem reversen Transkription (RT)-Reagenz-Kit.<ol>
<li>Fügen Sie 1 µg RNA zu einem Rohr mit 2 µL 5 X gDNA Beseitigung Puffer, 1 µL gDNA Beseitigung Enzym und RNase-freie H2O hinzu, bis das Volumen erreicht 10 µL. 2 min bei 42 ° c inkubieren</li>
			<li>Fügen Sie 10 µL des master-Mix (1 µL RT-Enzym-Mix I, 1 µL RT-Primer-Mix, 4 µL 5 x Puffer 2 und 4 µL RNase-freie H2O), der Reaktionslösung aus dem letzten Schritt und dann vorsichtig mischen. Gehen Sie sofort mit der RT-Reaktion: 37 ° C für 15 min und dann 85 ° C für 5 s.</li>
			<li>Führen Sie die quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) Analyse mit einer Real-Time PCR-Maschine mit einem SYBR RT-qPCR-Kit. Fügen Sie 10 µL 2 x Enzym, 0,8 µL forward Primer, 0,8 µL des rückwärts-Primer, 0.4 µL 50 x ROX Referenz Farbstoff II, 2 µL cDNA-Vorlage und RNase-freie H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 20 µL.</li>
			<li>Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung mit Hilfe der folgenden thermischen Parameter: 30 s bei 94 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 5 s bei 95 ° C und 34 s bei 60 ° C mit einer Endstufe von 15 s bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C , und 15 s bei 95 ° C. Primer für RT-qPCR sind in Tabelle 1aufgeführt. Housekeeping-Gene B2m und 18 s rRNA dienten als die internen Kontrollen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Berechnen Sie die relative Falte ändern sich je nach der 2-ΔΔCt -Methode.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beobachtung der histologischen Abschnitte
	<ol>
<li>Rekonstruieren Sie nach 24 h Fixierung mit 10 % Formalin die festen Hirngewebe in entsprechender Größe Stück Gewebe bei ca. 2-3 mm.</li>
		<li>Die Gewebe in einer Kassette, einbetten und tauchen ein in eine neue Fixativ Lösung für Austrocknung mit einer automatischen Vakuum Dörrgerät.</li>
		<li>Das fixierte Gewebe herausnehmen und nacheinander in steigenden Konzentrationen von Ethanol (70 %, 80 %, 95 %, 95 % und 100 %) für 30 min in jeder Lösung zu entwässern.</li>
		<li>Transparentize der Probe mit Xylol für 15 min, Tauchen sie in flüssigem Paraffin bei 60 ° C 90 min und dann einbetten ein Einbettungs-Automaten.</li>
		<li>Schneiden Sie das Paraffin eingebettet Block Gewebe in 3 µm Scheiben, Fliesen Sie-Scheibe auf dem Wasser bei 45 ° C und dann an der Luft trocknen.</li>
		<li>Abschnitt 3 h bei 60 ° C inkubieren, Färben mit Hämatoxylin und Eosin (HE) Methode, und versiegeln Sie es mit der neutralen Kaugummi.</li>
		<li>Beobachten Sie die histopathologischen Veränderungen des Gehirns mit einem optischen Mikroskop. Eine Vierpunkt-grading-System wurde zur histologische Veränderungen zu bewerten. Verwenden Sie einen ungepaarten t -Test für statistische Analysen. Staus/Blutung: fehlt, score 0; kleiner Bereich der fokalen Staus/Blutungen, Tor 1; großen Bereich der fokalen Staus/Blutungen oder mehrere Standorte der kleine Bereich der fokalen Staus/Blutungen, Tor 2; bis zu drei große fokale Staus/Blutung Standorte Tor 3; diffuse Staus/Blutungen, Note 4. Nekrose: fehlt, score 0; Fokale Nekrose, Tor 1; Auftreten von 1-10 nekrotische Zellen diffundieren, 2 Punkte; Brennpunkte der konfluierende Nekrose score 3; umfangreiche konfluierende Nekrose, Note 4. Entzündliche Zelle eindringen: fehlt, score 0; Paar und fokale Infiltrationen, Tor 1; multifokale Infiltration oder Infiltrationen mit Bildung von Aggregaten, score 2; bis zu drei Aggregate Tor 3; und mehr als vier Aggregate, Note 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%3A+a+new+emerging+or+an+old+neglected+zoonotic+pathogen%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen?</a> Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).</li>
<li>Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis%2C+an+important+pig+pathogen+and+emerging+zoonotic+agent-an+update+on+the+worldwide+distribution+based+on+serotyping+and+sequence+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing.</a> Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45(2014).</li>
<li>Kerdsin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Streptococcus+suis+serotype+9+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).</li>
<li>Hatrongjit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+human+case+report+of+sepsis+due+to+infection+with+Streptococcus+suis+serotype+31+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect+Diseases%22%5BJournal%5D)">First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand.</a> BMC Infect Diseases. 15, 392(2015).</li>
<li>Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+involved+in+the+pathogenesis+of+the+infection+caused+by+the+swine+pathogen+and+zoonotic+agent+Streptococcus+suis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis.</a> Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA%3A+a+major+proinflammatory+component+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).</li>
<li>Isiaku, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+is+associated+with+chronic+streptococcal+meningoencephalitis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish.</a> Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).</li>
<li>Oggioni, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+from+planktonic+to+sessile+life%3A+a+major+event+in+pneumococcal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis.</a> Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).</li>
<li>Xiao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+small+RNA+rss04+contributes+to+the+induction+of+meningitis+by+regulating+capsule+synthesis+and+by+inducing+biofilm+formation+in+a+mouse+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model.</a> Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+suis+serotype+2%2C+an+important+swine+and+human+pathogen%2C+induces+strong+systemic+and+cerebral+inflammatory+responses+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection.</a> Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).</li>
<li>Seitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+intranasal+mouse+model+for+mucosal+colonization+by+Streptococcus+suis+serotype+2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2.</a> Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).</li>
<li>Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+of+pigs+against+Streptococcus+suis+serotype+2+infection+using+a+live+avirulent+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain.</a> Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).</li>
<li>Williams, A. E., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+Streptococcal+meningitis+following+intravenous+intracisternal+and+natural+routes+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).</li>
<li>Dominguez-Punaro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+cochlear+inflammation+and+vestibular+syndrome+in+an+experimental+model+of+Streptococcus+suis+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).</li>
<li>Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+Studies+of+Different+Sequence+Types+and+Geographical+Origins+of+Streptococcus+suis+Serotype+2+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection.</a> Pathogens. 5 (3), (2016).</li>
<li>Chiavolini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+inducing+experimental+pneumococcal+meningitis+in+outbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice.</a> BMC Microbiology. 4, 36(2004).</li>
<li>Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otitis+interna+is+a+frequent+sequela+to+Streptococcus+suis+meningitis+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs.</a> Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).</li>
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<li>Takeuchi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+suilysin+to+the+pathogenesis+of+Streptococcus+suis+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis.</a> Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion, die hier beschriebenen hat offensichtliche Vorteile gegenüber anderen Wege der Infektion. Es ermöglicht Ermittler zu studieren, die Host-Bakterium-Interaktion und die Wirkung von bakteriellen Komponenten auf Host Immune Antworten direkt im Gehirn, die bakterielle Eingang in das zentrale Nervensystem zu imitieren. Diese Route der Infektion kann so erweitert werden, für die Untersuchung der Mechanismen der Meningitis verursacht durch andere Bakterien. Darüber hinaus kö...

Streptococcus suis (S. Suis) ist eine große bakterielle Erreger von Schweinen weltweit, verursacht schwere Krankheiten wie Meningitis, Lungenentzündung, Blutvergiftung, Endokarditis und Arthritis1. Es ist auch ein emerging zoonotische Agent. Bisher wurde berichtet, dass neun Serotypen Infektion beim Menschen, darunter Serotypen 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 und 312,3,4auslösen können. Bei Menschen und Schweinen ist Meningitis eine der wichtigsten klinischen Zeichen von S. Suis Infektionen. S. Suis ist in Vietnam und Thailand die wichtigste Ursache der Meningitis bei Erwachsenen5. Mikrobielle Biofilme sind Mikroorganismen, die zueinander halten und an einer Schnittstelle konzentriert sind; Sie sind unerlässlich für bakterielle Virulenz, Überleben in verschiedenen Umgebungen und Antibiotika-Resistenz-5. Biofilme sind in der Regel eine extrazelluläre Matrix umgeben, die in der Regel Polysaccharide, Proteine und DNA-6 enthält. Letzteres ist in der Lage, Host Entzündungsreaktionen und Cytokine Produktion7zu entlocken. Biofilmbildung wurde berichtet, an Streptokokken Meningitis in früheren Studien zu beteiligen. Biofilme tragen Streptococcus Agalactiae Meningitis in einem Tilapia-Fisch-Modell und Biofilmbildung im Hirngewebe aufgedeckt worden und um meningealen Oberflächen in Vivo durch intra-abdominalen Impfung8. Bei Meningitis Streptococcus Pneumoniae ist in einem Biofilm-ähnlichen Zustand und Bakterien in einem solchen Biofilm Zustand waren effektiver bei der Induktion von Meningitis in einem Maus-Infektion Modell9. Darüber hinaus in unserem früheren untersuchen, der Biofilm Zustand zugeordnet S. Suis im Gehirn der Maus trägt zur bakteriellen Virulenz von überleben Analyse10. Direkte Beweise für Biofilm Beteiligung an S. Suis Meningitis Bedarf jedoch weiterer Untersuchungen.
Tiermodelle der S. Suis Infektionen wurden bei Mäusen mit der intraperitonealen (i.p.)11, intranasale (i.n.)12, intravenös (i.v.)13und die Intracisternal (i.c) Wege der Infektion14, entwickelt 15 , 16. jedoch die i.p., i.n. und i.v. Infektionswege sind nicht geeignet für die Rollen von S. Suis Bauteilen in Meningitis direkt im Gehirn zu studieren. Dazu gehören die extrazellulären Matrix von Biofilmen. Obwohl die i.c-Impfung für S. Suis Infektion verwendet wurde, wurde die genaue Einstichstelle nicht in diesen Papieren beschrieben. Im Gegensatz dazu der stereotaktischen Koordinaten der Injektionsstelle intrakranielle Subarachnoidal Impfung ist eindeutig in einer früheren Studie17beschrieben worden. Dies erlaubt leichte Erkennbarkeit von der Impfung und weitere vereinfachende experimentelles Protokoll. Darüber hinaus imitiert die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion bakterielle Eingang in das zentrale Nervensystem aus die Nasennebenhöhlen oder das Mittelohr17und die Beziehung zwischen dem Mittelohr und Meningitis verursacht durch S. suis Madsen Et al.18nachgewiesen wurde. Darüber hinaus haben wir durch die Anwendung der intrakraniellen Subarachnoidal-Route der Infektion bei Mäusen, gezeigt, dass kleine RNA-rss04 S. Suis Meningitis in unserem vorherigen Studie10trägt.
In der vorliegenden Studie, die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion wurde bei Mäusen verwendet, um die Rollen von Biofilmen in S. Suis Meningitis zu untersuchen. Mäuse wurden mit planktonischen Zellen oder Biofilm Zustand von S. Suis auf diesem Weg der Infektion angesteckt. Histopathologische Analyse und erhöhte mRNA Expression von TLR2 und Zytokine aus Hirngewebe von Mäusen injiziert mit Biofilm Zustand Zellen deutlich erklärt, dass S. Suis Biofilm zur Meningitis beiträgt.

<table><tbody><tr><td>Todd Hewitt Brühe(THB)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>DF0492078</td><td>30 g des Pulvers in 1 l gereinigtem Wasser auflösen. Autoklav bei 121°; für 15 Min.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>DSBIO</td><td>16C0050</td><td>15 g des Pulvers in 1 L THB auflösen. Autoklav bei 121°; für 15 Min.</td></tr><tr><td>Milli-Q Referenz-Wasseraufbereitungssystem</td><td>Merck KGaA</td><td>Z00QSVCUS</td><td>ohne Dnase/ Rnase</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,42 g Na2HPO3, 0,27 g KH2PO4 in 1 l gereinigtem Wasser auflösen. Autoklav bei 121°; für 15 Min. Verwenden Sie KOH, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.</td></tr><tr><td>Na2HPO3</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009012-01-09</td><td>Lösen Sie 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,42 g Na2HPO3, 0,27 g KH2PO4 in 1 l gereinigtem Wasser auf. Autoklav bei 121°; für 15 Min. Verwenden Sie KOH, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009017-01-09</td><td>Lösen Sie 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,42 g Na2HPO3, 0,27 g KH2PO4 in 1 l gereinigtem Wasser. Autoklav bei 121°; für 15 Min. Verwenden Sie KOH, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009019-01-09</td><td>Lösen Sie 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,42 g Na2HPO3, 0,27 g KH2PO4 in 1 l gereinigtem Wasser auf. Autoklav bei 121°; für 15 Min. Verwenden Sie KOH, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>9009014-01-09</td><td>Lösen Sie 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,42 g Na2HPO3, 0,27 g KH2PO4 in 1 l gereinigtem Wasser auf. Autoklav bei 121°; für 15 Min. Verwenden Sie KOH, um den pH-Wert auf 7,4 einzustellen.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Verdünnt mit dem gleichen Volumen gereinigtem Wasser, Autoklav bei 121 ° / 15 min</td></tr> 4 <tr><td>% Paraformaldehyd</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>80096675</td><td></td></tr><tr><td>25 % Glutaraldehyd</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>30092436</td><td>10-fach mit gereinigtem Wasser zur Fixierung verdünnt.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10006818</td><td></td></tr><tr><td>Spctrophotometer</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11 +</td><td></td></tr> <tr><td>Ultraschall-Zellbrecher</td><td>NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd</td><td>JY96-IIN</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Hitachi Koki Co., Ltd</td><td>CT15RE</td><td></td></tr><tr><td>Kühlschrank</td><td>Aucma Co., Ltd</td><td>DW-86L500</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>EVO-LS10</td><td></td></tr><tr><td>FastRNA Pro Green Kit</td><td>MP Biomedicals</td> <td># 6045-050</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 Instrument</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>Instrument für PCR</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>1124310110</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485689</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR820A</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT Reagenzienkit mit gDNA Eraser</td><td>Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>Vollständig geschlossener Gewebeprozessor</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ASP200S</td><td></td></tr><tr><td>beheiztes Paraffineinbettungsmodul</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>halbautomatisches Rotationsmikrotom</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad für Paraffinschnitte</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer XL</td><td>Leica Biosystems Nussloch GmbH</td><td>ST5010</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr></tbody></table>

intrakranielle subarachnoidal route der infektion für die untersuchung rollen von streptococcus suis biofilmen in meningitis in einem mausmodell der infektion

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Streptococcus Suis ist nicht nur eine große bakterielle Erreger von Schweinen weltweit, sondern auch ein emerging zoonotische Agent. Bei Menschen und Schweinen ist Meningitis eine wichtige Manifestation des S. Suis Infektionen. Eine geeignete Infektionsmodell ist ein wichtiges Instrument zum Verständnis der Mechanismen von Krankheiten durch Krankheitserreger verursacht. Mehrere Wege der Infektion bei Mäusen wurden entwickelt, um die Pathogenese der Infektion S. Suis zu studieren. Die intraperitoneal, intranasale und intravenösem Wege der Infektion sind jedoch nicht geeignet für die Rollen von S. Suis Bauteilen in Meningitis direkt im Gehirn, wie z. B. die extrazelluläre Matrix von Biofilmen zu studieren. Obwohl Intracisternal Impfung für S. Suis Infektion verwendet worden ist, ist die genaue Einstichstelle nicht beschrieben worden. Hier wurde die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion in einem Mausmodell zu untersuchen, die Rollen von Biofilmen in S. Suis Meningitis beschrieben. S. Suis planktonischen Zellen oder Biofilm Staat wurden direkt in den Subarachnoidalraum von Mäusen durch die Einstichstelle befindet sich 3,5 mm von der Bregma rostral injiziert. Histopathologische Analyse und erhöhte mRNA Expression von TLR2 und Zytokine des Hirngewebes von Mäusen injiziert mit Biofilm Zustand Zellen deutlich gezeigt, dass S. Suis Biofilm in S. Suis Meningitis definitive Rollen spielt. Diese Route der Infektion hat offensichtliche Vorteile gegenüber anderen Wege der Infektion, so dass die Studie der Interaktion Host-Bakterium. Darüber hinaus erlaubt es die Wirkung von bakteriellen Komponenten auf Host Immune Antworten direkt in das Gehirn zu beurteilenden und imitiert bakterielle Eingang in das zentrale Nervensystem. Diese Route der Infektion kann erweitert werden, für die Untersuchung der Mechanismen der Meningitis verursacht durch andere Bakterien. Darüber hinaus können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von Medikamenten gegen bakterielle Meningitis zu testen.

SEM-Analyse wurde durchgeführt, um Biofilmbildung unter den experimentellen Bedingungen zu untersuchen. Wie in Abbildung 1dargestellt, gibt es ein signifikanten Unterschied in der Biofilmbildung zwischen planktonischen Zellen (Abb. 1A) und Biofilm Zustand (Abbildung 1B). SEM-Analyse zeigte, dass Biofilm Bakterien in Klumpen und mehrere Ebenen, und sie in die extrazel...

Hier beschreiben wir die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion bei Mäusen, Rollen von Biofilmen in Streptococcus Suis Meningitis zu studieren. Diese Infektionsmodell eignet sich auch für die Untersuchung der Pathogenese der anderen bakteriellen Meningitis und die Wirksamkeit neuer Medikamente gegen bakterielle Meningitis.

Intrakranielle Subarachnoidal Route der Infektion für die Untersuchung Rollen von Streptococcus Suis Biofilmen in Meningitis in einem Mausmodell der Infektion

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen über die Rolle der Komponenten von Streptococcus suis an vielen Stellen zu beantworten, z. B. in der extrazellulären Matrix seiner Biofilme. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung bakterieller Komponenten ermöglicht, die beeinflussen, wie das Immunsystem direkt im Gehirn reagiert und den Eintritt von Bakterien in das zentrale Nervensystem nachahmt. Das Verfahren wird von Mister Shouming Zhang, einem Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt.Um planktonische Zellen des Stammes P1/7 zu sammeln, sammeln Sie zunächst fünf Milliliter der Zellen aus Kulturen in der Mid-Lock-Phase. Zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 8000 mal G, bevor Sie die Zellen dreimal in PBS waschen. Suspendieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern 25% Glycerin in THB und aliquotieren Sie sie in fünf Röhrchen.Alternativ können Sie zur Entnahme von Zellen des Biofilmzustands des Stammes P1/7 20 Milliliter einer Übernachtkultur nehmen und zu 180 Millilitern frischem THB hinzufügen. Teilen Sie die verdünnte Kultur gleichmäßig in 10 runde Kulturplatten auf und inkubieren Sie die Platten dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Zhang, S. et al. Intrakranieller subarachnoidaler Infektionsweg zur Untersuchung der Rollen von Streptococcus suis-Biofilmen bei der Meningitis in einem Mausinfektionsmodell. J. Vis. Exp. (2018).Dieses Video demonstriert die Detektion der Zielgenexpression in einem bakteriell infizierten Mausgehirn. RNA wird extrahiert, mit einem DNA-abbauenden Enzym behandelt und rückwärts in cDNA transkribiert. Die cDNA wird durch thermischen Kreislauf mit genspezifischen Primern amplifiziert, während...

Nachweis der Zielgenexpression in einem bakterieninfizierten Maushirn

Quelle: Lenhard, A. et al. Ein Mausmodell für den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zum Erreger bei viraler Koinfektion wiederholt altersbedingte Erkrankungen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video demonstriert ein Modell der Maus-Koinfektion, bei dem das Influenzavirus den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zu einem Krankheitserreger auslöst. Es beschreibt die Schritte, die bei bakterieller Besiedlung, Virusinfektion und Krankheitsprogression beteiligt sind.

Ein Mausmodell zur Untersuchung des pathogenen Übergangs von Streptococcus pneumoniae nach viraler Koinfektion

In diesem Video demonstrieren wir die intrazisternale Verabreichung von Neisseria meningitidis in ein Mausmodell, um eine Meningitis-Infektion zu erzeugen.

Intrazisternale Verabreichung von Meningokokken in Mausmodelle zur Induktion von Meningokokken-Meningitis

Neisseria meningitidis ist ein Menschen bestimmten Erreger infiziert, die Blutgefäße. In diesem Protokoll menschlichen Mikrogefäße werden durch Pfropfen von der menschlichen Haut auf immungeschwächten Mäusen in eine Maus vorgestellt. Bakterien haften umfassend für die menschlichen Gefäße, was zu Gefäßschäden und die Entwicklung der Purpura typischerweise in menschlichen Fälle beobachtet.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Tiermodellen erwiesen haben wertvolle Werkzeuge bei der Definition von Wirt und Pathogen-spezifische Mechanismen, die zur Entstehung der chronischen Entzündung beitragen. Hier beschreiben wir ein Mausmodell der oralen Infektion mit dem menschlichen Erreger Porphyromonas gingivalis und Detail Methoden, um das Fortschreiten der Entzündung an lokalen und systemischen Websites zu beurteilen.

Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Hier wird ein Verfahren für die Festlegung der systemischen Infektion in der neonatalen Ratten mit Kulturen von Escherichia coli K1 beschrieben. Diese nichtinvasive Vorgehensweise erlaubt Besiedlung des Magen-Darm-Trakt, die Translokation des Erregers in den systemischen Kreislauf, und das Eindringen des zentralen Nervensystems in den Plexus choroideus.

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic Escherichia coli Infektion in der neonatalen Ratten

Streptococcus pneumoniae bildet diskrete, nicht eitrige mikroskopische Läsionen im Herzen. Dargestellt ist das Protokoll für ein Mausmodell der kardialen Mikroläsionsbildung. Es werden Anweisungen zur Visualisierung von Mikroläsionen mittels Mikroskopie, zur Unterscheidung zwischen frühen und späten Mikroläsionen und Methoden zum Nachweis des kardialen Umbaus im Herzen von Rekonvaleszenten gegeben.

Visualisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

Hier beschreiben wir eine Methode, um Meningokokken-Meningitis durch einen intrazisternalen Infektionsweg bei erwachsenen Mäusen zu induzieren. Wir präsentieren ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der Meningokokken-Infektion von der Vorbereitung von Inokulum bis zur intrazisternalen Infektion; dann erfassen Sie das Überleben des Tieres und bewerten Sie die bakteriellen Belastungen in murinen Geweben.

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Diese Arbeit beschreibt ein neuartiges Mausmodell für den Übergang von Pneumokokken von einem asymptomatischen Kolonisator zu einem krankheitsverursachenden Erreger während einer Virusinfektion. Dieses Modell kann leicht angepasst werden, um polymikrobielle und Wirt-Pathogen-Interaktionen während der verschiedenen Phasen des Krankheitsverlaufs und über verschiedene Wirte hinweg zu untersuchen.

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung eines Maus-Sepsis-Immunsuppressionsmodells mittels intranasaler Instillation von Klebsiella pneumoniae vor und validieren das Modell anhand verschiedener Indikatoren.

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Erfahren Sie die intrakranielle subarachnoidale Infektionsmethode zur Untersuchung von Streptococcus suis-Biofilmen bei Meningitis im Mausmodell. Diese Technik ermöglicht direkte Analysen immunologischer Reaktionen im Gehirn.

Intrakranielle Subarachnoidal Route der Infektion für die Untersuchung Rollen von Streptococcus Suis Biofilmen in Meningitis in einem Mausmodell der Infektion (Video) | JoVE Journal

Intrakranielle Subarachnoidal Route der Infektion für die Untersuchung Rollen von Streptococcus Suis Biofilmen in Meningitis in einem Mausmodell der Infektion

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