Name: Gedruckte Glycan Array: Eine sensible Technik für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in Kleintiere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Analyse zirkulierender Anti-Glykan-Antikörper in Kleintieren mittels gedrucktem Glykan-Array. Diese hochsensible Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung hunderter Glykan-Ziele aus minimalen Probenmengen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) gewähren PI13/01098 von Carlos III Health Institute, des spanischen Gesundheitsministeriums. DB-G wurde von einer doctoral Research Position gefördert durch die Europäische Union siebten Rahmenprogramm (RP7/2007-2013) unter Grant Agreement 603049 (TRANSLINK) profitiert. NK, NS, und NB wurde von Grant #14-50-00131 der russischen Science Foundation unterstützt. DB-G will seine Dankbarkeit gegenüber Marta Broto, J. Pablo Salvador und Ana Sanchis für hervorragende technische Unterstützung und Alexander Rakitko um Hilfe bei der statistischen Analyse zum Ausdruck bringen. Mit der Unterstützung der "Pla de Doctorats Industrials De La Secretaria d'Universitats ich Recerca del Departament d'Empresa ich Coneixement De La Generalitat de Catalunya (Gewährungsnummer 2018 DI 021). Wir bedanken uns bei CERCA Programm / Generalitat de Catalunya für institutionelle Unterstützung.

(1) Glycochips Produktion
<ol><li>
Microarray-Vorbereitung
	<ol>
<li>Drucken Sie die Glykoproteinen (50 mM) und Polysaccharide (10 µg/mL) in 300 mM Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 8,5) bei 6 repliziert auf N-Hydroxysuccinimide-derivatisiert Objektträger mit berührungslosen Roboter Arrayer (drop Volumen ~ 900 pL). Jede Folie enthält 4 verschiedene Blöcke Teilgeneratoren (Abbildung 1A, in Farben) 6 Mal wiederholt. Jeder einzelnes Sub-Array besteht aus 112 verschiedene Glycan-Spots, z.B. Steuerelemente (8 Zeilen × 14 Spalten) (Abbildung 1 b). Hinweis: In der zusätzlichen Tabelle1kostenfrei Glycan-bezogene Informationen. Die Glycan-Bibliothek für Druck Mikrochips verwendet ergibt sich aus synthetischen langfristige Bemühungen des Teams IBCh; Beispiele für Synthese werden in Publikationen29,30,31,32,33,34,35,36 beschrieben. ,37,38. Die Glycan-Bibliothek enthalten, Blutgruppen-Antigene und zu den häufig vorkommenden terminal Oligosaccharide sowie Kern Motive von Säugetieren N und O verbunden Glykoproteine und Glycolipide, Kohlenhydrat Tumor-assoziierten Antigene, und Polysaccharide von pathogenen Bakterien.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Folien in Feuchtigkeit-Box (~ 70 % Relative Luftfeuchtigkeit) bei Raumtemperatur (25 ° C) für 1 h.</li>
		<li>Blockieren von Microarrays: inkubieren Sie die Folien für 1,5 h mit blockierenden Puffer bei Raumtemperatur (Borsäure 100 mM, 25 mM Ethanolamin, 0,2 % (V/V) Tween-20 Reinstwasser).</li>
		<li>Waschen Sie Glycochip mit Reinstwasser zu und trocknen Sie es mit dem Flugzeug.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Glycochip Qualitätskontrolle
	<ol>
<li>Analysieren Sie zwei Microarrays aus jeder Charge mit 1mg/mL Lösung von komplexen Immunglobulin Vorbereitung (CIP, mit IgG, IgM und IgA), 10 µg/mL Lösung biotinylierte Ziege-Anti-Human-Immunglobulin als eine sekundäre Antikörper (IgM + IgG IgA), gefolgt von 1 µg/mL Lösung der entsprechenden fluoreszierende Streptavidin-Konjugat (über Protokoll beschrieben, siehe Schritt 2).</li>
		<li>Scannen Sie und analysieren Sie die Glycochips (siehe Schritt 3, Analyse von Glycan Array).</li>
		<li>Verwenden Sie Microarray Chargen mit Intra - und inter - chip Korrelation höher als 0,9.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Glycan-Array-Technik
<ol><li>
Bereiten Sie die folgenden wässrigen Lösungen (Reinstwasser) und bei Raumtemperatur (25 ° C) lagern:
	<ul>
<li>Puffer-1: 1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS, 1 % (V/V) Tween-20 und 0,01 % (w/V) NaN3
</li>
		<li>Puffer-2: 1 % (w/V) BSA in PBS, 0,1 % (V/V) Tween-20 und 0,01 % (w/V) NaN3.</li>
		<li>Puffer-3: 0,1 % (V/V) Tween 20 in PBS.</li>
		<li>Puffer-4: 0,001 % (V/V) Tween 20 in PBS.</li>
	</ul>
</li>
	<li>
Glycochip und Sample-Vorbereitung
	<ol>
<li>Legen Sie die Aufbewahrungsbox mit den Folien auf den Tisch, bis sie Raumtemperatur (25 ° C) erreicht. Hinweis: Verwenden Sie puderfreie Latexhandschuhe. Die Glycochip muss durch den Unterteil des gläsernen Objektträger, manipuliert werden, wo der Barcode befindet. Der Barcode hilft Ihnen zu erkennen rechts, vermeiden den Kontakt mit der Oberfläche, wo die Glykane gedruckt werden.</li>
		<li>Öffnen Sie den Karton, nehmen Sie die Glycochip und legen Sie es in der Inkubation Kammer (25 ° C), bereits mit nassem Filterpapier konditioniert, um Feuchtigkeit im Inneren der Kammer konstant zu halten.</li>
		<li>Unterdessen verdünnen Sie das Mäuse-Serum mit Puffer-1 (01:20) in 1,5 mL-Tuben. Homogenisieren der Serum-Lösung (5 s) mit einem Vortex-Mixer. Hinweis: Die Lautstärke benötigt, um ein einzelnes Glycochip Oberfläche völlig decken ist etwa 1 mL.</li>
		<li>Brüten Sie nach der Homogenisierung die verdünnte Serum bei 37 ° C für 10 Minuten in einem Wasserbad, Immunglobulin-Aggregation zu vermeiden. Zentrifugieren Sie die Röhren für 3 min bei 10.000 x g und 25 ° C, sammeln Sie den Überstand zu und entsorgen Sie ausgefällten Material.</li>
		<li>Legen Sie die Glycochip vorsichtig in die Inkubation Kammer. Inkubieren Sie es für 15 Minuten bei 25 ° C mit 1 mL Puffer-3 Restanhaftungen auf der Oberfläche der Glycochip zu beseitigen.</li>
		<li>Die Glycochip in einer vertikalen Position halten und mit einigen Tropfen von Puffer-3 mit einem Kunststoff Pasteurpipette nachwischen. Entfernen Sie vorsichtig den Puffer von der Glycochip Oberfläche mit Filterpapier.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaktion: Antikörper binden
	<ol>
<li>Legen Sie die Glycochip in der Inkubation Kammer. Die Glycochip Oberfläche mit einer Mikropipette verdünnte Serumprobe verteilt. Inkubieren Sie mit orbital Agitation (30 u/min) bei 37 ° C für 1,5 h stellen Sie sicher, dass alle trockenen Bereich der Glycochip Oberfläche durch verdünnte Serumprobe mit der Spitze der Pipette abgedeckt ist.</li>
		<li>Entfernen Sie alle überschüssige Probe und Tauchen Sie die Glycochip für 5 min in Puffer-3 bei 25 ° C. Dann bewegen Sie die Glycochip in einen Behälter mit Puffer-4 (5 min) und schließlich waschen Sie (5 min) die Glycochip mit Reinstwasser. Zentrifugieren Sie die Glycochip für 1 min bei 175 x g und 25 ° C, die Flüssigkeit zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erkennung: sekundäre Antikörper
	<ol>
<li>Legen Sie die Glycochip in der Inkubation Kammer. Verteilt auf der Glycochip Oberfläche eine Lösung (5 µg/mL) der Ziege Anti-Maus (IgG + IgM) konjugiert, Biotin in Puffer-2. Inkubieren Sie mit orbital Agitation (30 u/min) bei 37 ° C für 1 h.</li>
		<li>Entfernen Sie den ungebundenen Anteil und wiederholen Sie die Waschschritte.</li>
		<li>Inkubieren Sie nach der Zentrifugation die Glycochip in der Dunkelheit bei 25 ° C für 45 Minuten (30 u/min) mit 2 µg/mL der entsprechenden Fluorochrom-markierte Streptavidin-Lösung (im Puffer-2).</li>
		<li>Entfernen Sie in der Dunkelheit den ungebundenen Anteil zu und wiederholen Sie die Waschschritte.</li>
		<li>Trocknen Sie die Glycochip mit dem Flugzeug. Hinweis: Glycochip sollten so bald wie möglich gescannt werden. Aber ist es nicht möglich, sofort nach dem färben zu scannen, zu tun, kann Glycochips in der Dunkelheit an einem kühlen und trockenen Ort gelagert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Analyse der Glycan Array
<ol><li>
Scannen Sie das array
	<ol>
<li>Lassen Sie die Glycochip auf den Tisch, bis es Raumtemperatur in Dunkelheit erreicht. Zur gleichen Zeit, schalten Sie die Dia-Scanners und der Laser (Erregung Wellenlänge von 633 nm).</li>
		<li>Halten Sie die Microarray, schieben Sie die Glycochip in den Schacht, bis er den Rücken berührt.</li>
		<li>Scannen der Glycochip ("run easy Scan"), und den Scan als ein ". TIFF"-Datei.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Array-Quantifizierung
	<ol>
<li>Das Array mit einem ScanArray-Analyse-System zu quantifizieren. Öffnen zuvor gescannten Bildern, indem Sie auf "Datei" in der "Configure & Datei-Gruppe" im Hauptfenster (Abbildung 1 b-D)</li>
		<li>Laden Sie die entsprechenden Array Dateivorlage im GAL-Format (Disposition der gedruckten Glykane auf dem Objektträger) (Abbildung 1).</li>
		<li>Passen Sie GAL Vorlage an, indem Sie sorgfältig das Array ("Grids") mit den Punkten im Bild ausrichten und initiieren Sie Quantifizierung (Abbildung 1) zu.</li>
		<li>Wählen Sie die Quantifizierung Parameter:<ul>
<li>Quantifizierung Typ: Run einfach Quant.</li>
			<li>Quantifizierungsmethode: Kreis behoben</li>
			<li>Auto finden Spots: deaktivieren Sie alle Optionen</li>
			<li>Normalisierung Methode: LOWESS (lokal gewichteten Scatter Plot Glättung).</li>
		</ul>
</li>
		<li>Sichern Sie die quantifizierten Daten als ". CSV-"Datei (Abbildung 1). Übertragen Sie diese Daten in einer gemeinsamen Tabellenkalkulationsdatei mit Microsoft Excel oder eine andere entsprechende Anwendung.</li>
		<li>Der Interquartilbereich (IQR) als die wichtigsten statistischen Methode verwenden: Berechnung des Medians (Quartil 2) aller Signale für jedes Ligand und die interquartile Abweichung (75. und 25. Perzentile oder obere und untere Quartile Q3 und Q1, beziehungsweise).</li>
		<li>Führen Sie interaktiven Exploration von Daten mithilfe einer hierarchischen Clustering Explorer-Anwendung aus.</li>
		<li>Verwendung clustering Parameter: durchschnittliche Gestänge (UPGMA) und euklidische Entfernung wie Ähnlichkeit Abstand messen. Durchführen Sie hierarchische Cluster von Zeilen ohne Normalisierung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Nailya Khasbiullinaund Alexey Nokel sind Mitarbeiter von Semiotik LLC, die der Lieferant die in dieser Studie verwendeten Glycochips ist.

Glycan Microarrays sind unverzichtbare Werkzeuge für die Untersuchung von Protein-Glycan Interaktionen40geworden. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein Protokoll basiert auf PGA-Technologie, das Repertoire der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in den BALB/c Mäusen zu studieren. Da PGA die Möglichkeit, Bildschirm zahlreicher biologisch unbekannten handelt bietet, ist es eine außergewöhnlich günstige Discovery Tool13,15,...

Antikörper spielen eine zentrale Rolle in unserer Verteidigung gegen eindringende Krankheitserreger durch direkt neutralisieren Viren1,2 und Bakterien2,3, durch die Aktivierung der Ergänzung System4,5 und die Verbesserung der Phagozytose6. Darüber hinaus sind sie wesentliche Elemente in Krebs targeting und Beseitigung von bösartigen Zellen7und Homöostase Wartung8,9.
Autoimmun-und Entzündungserkrankungen10 und Krebs11können Störungen des Immunsystems führen. Diese pathologischen Bedingungen erfordern idealerweise eine schnelle Diagnose für eine effiziente Behandlung. Bei Autoimmunerkrankungen ist die serologische Präsenz der Autoantikörper in den meisten Fällen ein Prädiktor für die Diagnose von Autoimmunität10,12. Diese Antikörper reagieren mit der Zelloberfläche und extrazelluläre Autoantigene, und sie sind oft seit vielen Jahren vor der Präsentation der Autoimmunerkrankung10,12. Immunschwäche und Krebs sind auch Blutuntersuchungen diagnostiziert, dass entweder immun Elemente wie Antikörper oder ihre funktionelle Aktivität11messen.
Die Identifikation des Repertoires der zirkulierenden Antikörper und ihre serologischen Ebenen sind ausschlaggebend für eine Prognose festlegen und das Fortschreiten der aller genannten pathologischen Bedingungen zu bewerten. Wir haben zuvor das Potenzial der PGA-Technik für die Analyse von zirkulierenden Antikörper in verschiedenen Tierarten13–16, bewiesen, Minimierung des Einsatzes großer Mengen von serologische Proben, Vermeidung des Problems Antikörper Kreuzreaktivität17 und ermöglicht Hochdurchsatz-Profilierung der ein umfangreiches Repertoire an Antikörpern15zugeordnet.
Glykan-basierten Immunoassays sind hauptsächlich bedingt unter anderem durch die Herkunft und Herstellung der Kohlenhydrate, die die Affinität und Bindung des Liganden15,18,19,20 zu bestimmen, ,21. Glykan-basierten Immunoassays können in Suspension (Mikrokügelchen)15,21,22 oder in Wohnung-aktivierte Oberflächen15,21,22entwickelt werden, 23,24. Die letzte gehören ELISA (die meisten konventionellen Methoden) und PGA. Es gibt nicht viele Daten vergleicht man diese Methoden in der gleichen experimentellen Einstellung15,25,26,27. Zuvor haben wir die Wirksamkeit und Selektivität dieser Immunoassays zum Profil Anti-Glykan Antikörper in individuellen menschlichem Plasma Proben15verglichen. Für einige Antikörper wie diese gezielt Anti-A/B-Blutgruppe die Immunoassays konnte sie mit statistischer Signifikanz erkennen und sie positiv korreliert mit einander15,18,21. Unterdessen Anti-P1 Antikörper wurden in erster Linie mit der höchsten Trennschärfe von PGA erkannt, und es gab keine Korrelation in den Feststellungen der verschiedenen Glycan-basierten Immunoassays15,18, 21. diese Unterschiede zwischen den Methoden wurden vor allem im Zusammenhang mit der Antikörper/Antigen-Verhältnis und Glycan Orientierung15. ELISA und Federung Arrays sind anfälliger für unspezifische Bindung als PGA, denn es eine Überschreitung des Antigens Antikörper in diesen Methoden15 gibt. Darüber hinaus ist die Ausrichtung von Glykoproteinen in der PGA restriktiver als in ELISA und Aussetzung Arrays15. ELISA ist praktisch, wenn die Studie eine begrenzte Gruppe von Glykane enthält. ELISA bietet neben Aussetzung Arrays größere Flexibilität im Hinblick auf Assay Neukonfiguration. PGA ist besonders praktisch für Entdeckung Ansätze15,18,21,28. Trotz dieser klaren Vorteile und Nachteile könnte der drei genannten Immunoassays verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Glycan-Antikörper Interaktionen zu studieren. Das endgültige Ziel der Studie ist, dass einerseits die Auswahl geeigneter Methoden leiten wird.
Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die Verwendung von PGA-Technologie für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Anti-Glykan Antikörper bei kleinen Tieren zu erweitern. Als ein repräsentatives Ergebnis präsentieren wir Ihnen hier ein detailliertes Protokoll, um das Repertoire der natürlichen Anti-Kohlenhydrat-Antikörper bei Erwachsenen BALB/c Mäusen von PGA zu beurteilen.

<table><tbody><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotinyliertes Ziegen-Anti-Human-Igs</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Ref. #: 31782</td><td></td></tr><tr><td>biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-IgM + IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: 31807</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5&nbsp;</td><td>Scienion AG, Berlin, Deutschland</td><td>http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/</td><td></td></tr> <tr><td>Fleckenschale (Objektträger-Inkubationskammer)</td><td>Simport, Beloeil, QC, Kanada</td><td>Ref. #: M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland&nbsp;</td><td>Ref. #: 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>http://www.gilson.com/en/Pipette/</td><td></td></tr> <tr><td>Diascanner</td><td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td><td>ScanArray GX Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelinkubator</td><td>Cole-Parmer, Staffordshire, UK</td><td>Ref. #: SI50</td><td></td></tr><tr><td>Biologische Proben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c Mäuseseren Dieses</td><td>Papier</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Complex Immunoglobulin Preparation (CIP)</td><td>Immuno-Gem, Moskau, Russland</td><td>http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531</td><td></td></tr><tr><td><stark>Chemikalien, Reagenzien und Glykane&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glykanbibliothek</td><td>Institut für Bioorganische Chemie (IBCh), Moskau, Russland</td><td>N/ A</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,&nbsp;</td><td>Ref. #: A9418</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: 411000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck Chemicals & Ltd. Life Science S.A., Madrid, Spanien</td><td>Ref. #: 655204</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spanien</td><td>Ref. #: E404</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 555 Konjugat&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Ref. #: S21381</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Cy5-Konjugat</td><td>GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK</td><td>Ref. #: PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimid-derivatisierte Glasobjektträger H&nbsp;</td><td>Schott-Nexterion, Jena, Deutschland</td><td>Ref. #: 1070936</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Filterpapier&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Ref. #: WHA10347509</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Ref. #: 0030120086</td><td></td></tr><tr><td>Software und Algorithmen</td>ScanArray Express Microarray-Analysesystem <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>PerkinElmer</td><td>http://www.per</td><td></td></tr><tr><td>kinelmer.com/microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hierarchical Clustering Explorer-Anwendung</td><td>University of Maryland, MD, USA</td><td>http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/</td><td></td></tr></tbody></table>

gedruckte glycan array: eine sensible technik für die analyse des repertoires der zirkulierenden antikörper anti-kohlenhydrat in kleintiere

Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals

Das Repertoire des zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat von einem bestimmten Individuum ist häufig verbunden mit seiner immunologischen Status. Nicht nur die einzelnen immun Zustand entscheidet über den Erfolg bei der Bekämpfung von internen und externen potenzielle Bedrohung Signale, sondern auch die Existenz eines bestimmten Musters der zirkulierenden Anti-Glykan Antikörper (und ihren serologischen Ebene Variation) könnte sein, eine deutliche Markierung von der Entstehung und Progression von bestimmten pathologischen Zuständen. Hier beschreiben wir eine gedruckt Glycan Array PGA-basierte Methode, die bietet die Möglichkeit, Hunderte von Glycan Ziele mit sehr hoher Empfindlichkeit zu messen; mit einer minimalen Menge an Beispiel, das ist eine gemeinsame Beschränkung vorhanden, wenn kleine Tiere (Ratten, Mäuse, Hamster, etc.) dienen als Modelle zur Adresse Aspekte menschlicher Krankheiten. Als ein repräsentatives Beispiel für diesen Ansatz zeigen wir die Ergebnisse aus der Analyse des Repertoires der natürlichen Anti-Glykan Antikörper in Mäusen BALB/c. Wir zeigen, dass jede BALB/c Maus an der Studie, trotz genetisch identisch und gepflegt unter den gleichen Bedingungen ein bestimmtes Muster der natürlichen Anti-Kohlenhydrat-Antikörper entwickelt. Diese Arbeit behauptet, die Verwendung von PGA-Technologie zu untersuchen, Repertoire (Besonderheiten) und das Niveau der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrate, in Gesundheit und während jeder Krankheitszustand zu erweitern.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Zusammenfassung der repräsentative Ergebnisse aus der Quantifizierung des Repertoires der natürlichen Anti-Glykan Antikörper in einer Population von 20 BALB/c Mäuse. Die Glycochips, die in dieser Studie verwendeten enthaltenen 419 verschiedenen Glycan Strukturen. Die meisten Glykane synthetisiert als -CH2CH2CH2NH2 Abstandhalter-bewaffnet O-Glykoside, in mehreren Fällen als -CH2CH2NH...

Diese Arbeit zeigt das Potenzial der gedruckten Glycan Array (PGA) Technologie für die Analyse von zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat bei Kleintieren.

Gedruckte Glycan Array: Eine sensible Technik für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in Kleintiere

The repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies of a given individual is often associated with its immunological status. Not only the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, das Profil zirkulierender antiglykanischer Antikörper im Serum von Kleintieren mit einer auf gedruckter Glykan-Array-basierten Technologie zu untersuchen. Dieser Ansatz hat ein Potenzial in der Frühdiagnose und die richtige Behandlung in einigen pathologischen Bedingungen, wo Antikörper gegen glykanische Strukturen eine wichtige Rolle spielen. Der Hauptvorteil bei dieser Technik ist die Möglichkeit, in der gleichen experimentellen Einstellung Hunderte von Glykan-Targets mit einer sehr hohen Empfindlichkeit mit einer minimalen Menge an Probe zu messen.Verwenden Sie zum Vorbereiten des Micro-Arrays einen berührungslosen Roboter-Arrayer. Druckt sechs Replikationen von 50 Millimolaren Glykanen und 10 Mikrogramm pro Milliliter Polysaccharide und 300 Millimolar PBS, pH 8,5 auf n-Hydroxy 6 cinnamic derivatisierte Glasglyide. Jede Folie enthält vier verschiedene Blöcke von Unterarrays, die sechsmal wiederholt werden.Jedes einzelne Subarray wird durch 112 verschiedene Glykanflecken einschließlich Kontrollen gebildet. Inkubieren Sie die Dias in einer Feuchtigkeitsbox bei Raumtemperatur für eine Stunde. Um die Mikro-Arrays zu blockieren, inkubieren Sie die Dias für 1 1/2 Stunden mit Sperrpuffer bei Raumtemperatur.Dann waschen Sie den Glykol-Chip mit ultrareinem Wasser und trocknen Sie ihn an der Luft. Bereiten Sie Puffer eins durch Puffer vier vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Glykol-Chips und Proben vorzubereiten, legen Sie die Aufbewahrungsbox mit den Dias auf den Tisch, bis sie Raumtemperatur erreichen.Öffnen Sie die Box und übertragen Sie den Glykolchip in die Inkubationskammer, die bereits mit Nassfilterpapier konditioniert werden sollte, um die Luftfeuchtigkeit in der Kammer konstant zu halten. In der Zwischenzeit das Mäuseserum mit Puffer eins in 1,5 Milliliter-Röhren verdünnen. Homogenisieren Sie die Serumlösung für fünf Sekunden mit einem Wirbelmischer.Nach der Homogenisierung das verdünnte Serum bei 37 Grad Celsius 10 Minuten in einem Wasserbad inkubieren, um eine Immunglobulinaggregation zu vermeiden. Dann zentrifugieren Sie die Rohre für drei Minuten bei 10.000 mal G und 25 Grad Celsius. Sammle den Überstand und verwerfe jedes gefällte Material.Legen Sie den Glykolchip vorsichtig in die Inkubationskammer. Inkubieren Sie es mit einem Milliliter Puffer drei, um Restmaterial auf der Oberfläche des Glykolchips zu eliminieren. Für 15 Minuten, bei 25 Grad Celsius.Halten Sie den Glykol-Chip in einer vertikalen Position und waschen Sie ihn mit einigen Tropfen Puffer drei mit einer Kunststoff-Pasteurpipette. Entfernen Sie dann vorsichtig den Puffer von der Glykol-Chip-Oberfläche mit Filterpapier. Legen Sie den Glykolchip wieder in die Inkubationskammer.Verteilen Sie die verdünnte Serumprobe mit einer Mikropipette über die Glykolchip-Oberfläche. Stellen Sie sicher, dass alle trockenen Bereiche der Glykol-Chipoberfläche mit der Spitze der Pipette von der verdünnten Serumprobe abgedeckt werden. Inkubieren Sie mit Orbital-Agitation bei 37 Grad Celsius für 1 1/2 Stunden.Nach der Inkubation entfernen Sie überschüssige Proben und tauchen Sie den Glykolchip für fünf Minuten in Puffer drei bei 25 Grad Celsius ein. Den Glykolchip in einen Behälter mit Puffer vier geben und schließlich den Glykolchip mit reinem Ultrawasser waschen. Zentrifuge den Glykol-Chip für eine Minute bei 175 mal G und 25 Grad Celsius, um die Flüssigkeit zu entfernen.Nachdem Sie den Glykol-Chip wieder in die Inkubationskammer geben, eine Lösung der Zufeinerung der Ziege, die zu Biotin konjugiert ist, über die Glykolchip-Oberfläche verteilen. Inkubieren Sie mit Orbital-Agitation bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Entfernen Sie den ungebundenen Bruch, und wiederholen Sie die Waschschritte.Nach zentrifugieren Sie den Glykolchip in der Dunkelheit bei 25 Grad Celsius für 45 Minuten mit zwei Mikrogramm pro Milliliter der entsprechenden fluorchromen-markierten Streptavidinlösung in Puffer zwei. Nach der Arbeit in der Dunkelheit, um die ungebundene Fraktion zu entfernen und die Waschschritte zu wiederholen, trocknen Sie den Glykol-Chip durch Luft. Um das Array zu scannen, lassen Sie den Glykolchip auf dem Tisch, bis er im Dunkeln Raumtemperatur erreicht.Schalten Sie gleichzeitig den Diascanner und den Laser ein. Halten Sie das Mikro-Array, schieben Sie den Glykol-Chip in den Steckplatz, bis er den Rücken berührt. Scannen Sie den Glykol-Chip, indem Sie EasyScan ausführen, und speichern Sie den Scan als tif-Datei.Quantifizieren Sie das Array mit einem ScanArray-Analysesystem. Öffnen Sie die zuvor gescannten Bilder, indem Sie im Hauptfenster auf Datei in der Konfigurations- und Dateigruppe klicken. Laden Sie die entsprechende Arraydateivorlage im GAL-Format, die die Disposition von gedruckten Glykanen auf dem Glasschlitten darstellt.Passen Sie die GAL-Vorlage an, indem Sie das Array sorgfältig an den Punkten im Bild ausrichten und die Quantifizierung initiieren. Wählen Sie die Quantifizierungsperimeter als Quantifizierungstyp ausführen einfache Quantifizierung und Quantifizierung Sifikationsmethode festen Kreis. Klicken Sie auf alle Optionen für die auto find spots, und wählen Sie Lowess für die Normalisierungsmethode aus.Speichern Sie die quantifizierten Daten als csv-Datei. Übertragen Sie diese Daten mithilfe von Microsoft Excel oder einer anderen geeigneten Anwendung in eine gemeinsame Tabellenkalkulationsdatei. Genetisch identische Mäuse sollten nicht als immunologische Äquivalente betrachtet werden, da sie unterschiedliche Muster natürlicher Anti-Kohlenhydrat-Antikörper entwickelt haben.Wie hier gezeigt, wurden nur 12 Glyglyan-Spezifitäten konserviert. Hier ist ein repräsentatives Beispiel für die Bilder, die aus dem Scannen von Mikrochips mit einem Floreszenzscanner gewonnen wurden. Das Raster wird dann an den Spots in jedem einzelnen Sub-Array ausgerichtet.Die Florescent werden für jeden Punkt erkannt und die Ergebnisse werden in eine gemeinsame Tabellenkalkulationsdatei übertragen. Nach der Inkubation mit Mausserum wurden die Glykochips mit einem Scan-Array-Reader gescannt. Die Daten wurden mit einem Mikro-Array-Analysesystem analysiert und die Ergebnisse wurden in RFU als Median plus minus der absoluten Mittelabweichung ausgedrückt.Blaue und weiße Farben stellen Hintergrundbindungssignale von weniger als 4000 RFU dar. Rote Farbe steht für positive Bindungssignale größer oder gleich 4000 RFU. Die meisten der in den Glykol-Chips exponierten Glykinstrukturen wurden im Repertoire der zirkulierenden antiglygischen Antikörper von Balp-C-Mäusen nicht erkannt.Einmal gemeistert kann diese Technik in fünf Stunden und 45 Minuten durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Technologie des Druckerglycon-Arrays verwenden können, um das Repertoire und den Gehalt an zirkulierenden Anti-Kohlenhydrat-Antikörpern in Serumproben zu untersuchen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Glykochip von einem unteren Teil der Brille Licht manipuliert werden muss.Wo sich der Barcode befindet. Um den Kontakt mit den gedruckten Glykanen zu vermeiden. Stellen Sie außerdem sicher, dass der gesamte trockene Bereich des Glykochips mit der Spitze der Pipette durch die verdünnte Serumprobe abgedeckt wird.Das Volumen, das benötigt wird, um eine einzelne Oberfläche eines Glykochips vollständig abzudecken, beträgt etwa einen Milliliter. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Microsphere Base Suspension Array durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit dem flexiblen Multiplex-Nachweis von Antiglykan-Antikörper-Profil zu beantworten. Nach ihrer Einführung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der biomakulralen Moleküle und Immunologie, um eine nicht proteinreiche Glykol-Wechselwirkung in der Gruppe von Kleintieren zu erforschen.

printed-glycan-array-sensitive-technique-for-analysis-repertoire

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In dieser Studie beschreiben wir ein verbessertes Protokoll für eine Multiplex-Hochdurchsatz-Antikörper Mikroarray mit Lektin Detektionsverfahren, das in der Glykosylierung Profilierung spezifischer Proteine ​​verwendet werden können. Dieses Protokoll bietet zuverlässige neue Reagenzien und reduziert den Zeitaufwand, Kosten und Laborgeräte Anforderungen an das vorherige Verfahren verglichen.

Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

Dieses Video demonstriert die gedruckte Glykan-Array-Technologie zur Analyse von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern in Mausserum. Die Antikörper im Serum interagieren mit spezifischen Glykanen auf dem Chip, was durch Immunfärbung und anschließende Fluoreszenzuntersuchung bestätigt wird.

Nachweis von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern mit einem gedruckten Glykan-Array

Unter Verwendung einer gedruckten Glykan-Microarray-Strategie wurde ein konventioneller 96-Well-Plattenassay für die Analyse der Hämagglutinin-Avidität und Spezifität des Influenza-A-Virus für Sialinsäure-haltige Rezeptoren miniaturisiert.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Wir beschreiben hier eine Methode zur Erzeugung anpassbarer Antigen-Microarrays, die für den gleichzeitigen Nachweis von Serum-IgG- und IgM-Autoantikörpern von Menschen und Mäusen verwendet werden können. Diese Arrays ermöglichen den quantitativen Hochdurchsatznachweis von Antikörpern gegen beliebige Antigene oder Epitope von Interesse.

Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

Ein modularer Ansatz für die Synthese von N- Glykanen zur Befestigung an einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas schieben (ACG Folie) wie ein Glycan Microarray entwickelt wurde und seine Verwendung für die Profilerstellung für eine HIV weitgehend neutralisierende Antikörper nachgewiesen.

Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

Ein Sialoglycan-Mikroarray-Assay kann verwendet werden, um Anti-Neu5Gc-Antikörper in menschlichen Seren zu bewerten, was es zu einem potentiellen Hochdurchsatz-Diagnosetest für Krebs und andere chronisch entzündungsvermittelte menschliche Krankheiten macht.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in menschlichen Seren mit einem Sialoglycan-Microarray-Assay

Ein detailliertes Protokoll zur Reinigung und anschließenden Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus geernteter Zellkulturflüssigkeit (HCCF) automatisierter Mikrobioreaktoren wurde beschrieben. Die Verwendung von Analysen zur Bestimmung kritischer Qualitätsattribute (CQAs) und zur Maximierung des begrenzten Stichprobenvolumens zum Extrahieren wichtiger Informationen wird ebenfalls vorgestellt.

Reinigung und Analyse eines monoklonalen Antikörpers aus chinesischen Hamster-Ovarialzellen mit einem automatisierten Mikrobioreaktorsystem

Das Glykosylierungsmuster eines Antikörpers bestimmt seine klinische Leistung, so dass die industriellen und akademischen Bemühungen zur Kontrolle der Glykosylierung bestehen bleiben. Da typische Glykoengineering-Kampagnen zeit- und arbeitsintensiv sind, würde sich die Erstellung eines schnellen Protokolls zur Charakterisierung der Auswirkungen von Glykosylierungsgenen mittels transienter Silencing als nützlich erweisen.

Schnelles Antikörper-Glykoengineering in chinesischen Hamster-Eierstockzellen

Das Microarray-Polymer-Profiling (MAPP) ist eine Hochdurchsatztechnik für die Analyse der Zusammensetzung von Glykanen in biologischen Proben.

Microarray-Polymer-Profiling (MAPP) für die Hochdurchsatz-Glykananalyse

Ein einfaches Slot-Blot-Methode wurde für die Quantifizierung von Influenza Virus Hämagglutinin und Neuraminidase mit universellen Antikörper, die gegen ihre stärksten konservierten Sequenzen durch bioinformatische Analysen identifiziert entwickelt. Dieser innovative Ansatz kann eine sinnvolle Alternative zu quantitativen Bestimmung aller viralen Hämagglutinin und Neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Erfahren Sie die Analyse zirkulierender Anti-Glykan-Antikörper in Kleintieren mittels gedrucktem Glykan-Array. Diese hochsensible Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung hunderter Glykan-Ziele aus minimalen Probenmengen.

Gedruckte Glycan Array: Eine sensible Technik für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in Kleintiere (Video) | JoVE Journal

Gedruckte Glycan Array: Eine sensible Technik für die Analyse des Repertoires der zirkulierenden Antikörper Anti-Kohlenhydrat in Kleintiere

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