Modellierung von Osteosarkom mit Li-Fraumeni-Syndrom, die Patienten abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen

Dieses iPSC-basierte Osteosarkommodell des Li-Fraumeni-Syndroms kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Osteosarkomforschung zur Verwendung von iP-Zellen von Patienten in der Krebsmodellierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieses Modells besteht darin, dass es die Erzeugung unbegrenzter Zellen in allen Stadien der Entwicklung des Osteosarkoms für mechanistische Studien, die Identifizierung von Biomarkern und das Wirkstoffscreening ermöglicht. Ruoji wird das Zellkulturverfahren demonstrieren und ich werde das Tierverfahren demonstrieren.

Nach zwei Wochen der embryonalen Fibroblasten (MEF) der Maus wird die 80 bis 90%ige konfluente iPS-Zellkultur mit fünf Millilitern DPBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter Zellablösungslösung zu den Zellen für eine dreiminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Es ist wichtig, iPS-Zellen mindestens 14 Tage lang unter guten Bedingungen auf MEFs zu halten, damit sich die Zellen an eine mit Gelatine beschichtete Platte anheften können, um sie in mesenchymale Stammzellen zu differenzieren. Wenn sich die Zellen vom Plattenboden gelöst haben, geben Sie neun Milliliter MEF/MSC-Kulturmedium zu den Zellen, um die Zellablösungslösung zu neutralisieren, und überführen Sie die Zellsuspension in eine unbeschichtete 100-Millimeter-Gewebekulturplatte.

Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich die MEFs an die Platte anlagern und den nicht gebundenen iPS-Zell-haltigen Überstand vorsichtig sammeln können. Zentrifugieren Sie die iPS-Zelllösung und resuspendieren Sie das Pellet in sechs Millilitern-Differenzierungsmedium. Säen Sie dann zwei Milliliter Zellen in jede der drei mit 0,1 %ige Gelatine beschichteten Vertiefungen einer Sechs-Well-Kulturplatte und legen Sie die Platte für 28 Tage in den Zellkultur-Inkubator, wobei Sie die Zellen alle zwei Tage mit frischem Medium füttern, um nicht gebundene oder abgestorbene Zellen zu entfernen.

Am Tag 28 werden große Massen differenzierter Zellen sichtbar sein, wobei Fibroblasten-ähnliche MSCs an den Rändern der Cluster beobachtet werden. Waschen Sie die Zellkulturen mit einem Milliliter DPBS pro Vertiefung, gefolgt von deren Ablösung mit 0,5 Millilitern 0,25 % Trypsin-EDTA pro Vertiefung bei Raumtemperatur. Nach drei Minuten neutralisieren Sie das Tyrypsin mit 1,5 Millilitern MEF/-Kulturmedium pro Vertiefung und poolen Sie die abgelösten MSEs in ein einzelnes konisches 15-Milliliter-Röhrchen für ihre Zentrifugation.

Resuspendieren Sie das Pellet in drei Millilitern MEF/-Kulturmedium und säen Sie die Zellen auf eine mit 0,1 %ige Gelatine beschichtete 60-Millimeter-Platte, wobei das Medium alle zwei Tage gewechselt wird, bis die Zellen eine Konfluenz von 100 % erreichen. Nach der Teilung der 100%igen konfluenten Kultur im Verhältnis eins zu drei vermehren sich die MSCs schnell, zeigen eine fibroblastenähnliche Morphologie und bilden ein wirbelartiges Kulturmuster, wenn die Kultur eine hohe Dichte erreicht. Die aus iPS-Zellen gewonnenen MSCs können auch durch eine Immunfluoreszenzfärbung auf mesenchymale Stammzellmarker zu jedem Zeitpunkt ihrer Differenzierung untersucht werden.

Um die in Osteoblasten zu differenzieren, wird die entsprechende Anzahl von aus einer 95%igen konfluenten Zellkultur 24 Stunden lang auf eine Zellkulturplatte mit dem entsprechenden Volumen des MEF/MSC-Kulturmediums aufgefüllt. Beginnen Sie dann am nächsten Tag und danach alle zwei Tage bis zum Ende der Kulturperiode mit dem entsprechenden Volumen des Osteoblasten-Differenzierungsmediums. Zum Nachweis der knochenassoziierten alkalischen Phosphatase, die von Präosteoblasten produziert wird, und der mineralischen Ablagerung, die von reifen Osteoblasten erzeugt wird, führen Sie eine alkalische Phosphatase- bzw. Alizarinrot-S-Färbung gemäß dem Protokoll des Herstellers zu den entsprechenden experimentellen Zeitpunkten durch.

Um ein in vivo Tumorgenesemodell mit den differenzierten Osteoblasten aufzubauen, säen Sie die entsprechende Anzahl von MSC in fünf 100-Millimeter-Schalen aus, um die osteoblastische Differenzierung zu starten. Am 14. Tag der osteoblastischen Differenzierung waschen Sie fünf Kulturplatten mit Osteoblasten mit fünf Millilitern DPBS und behandeln die Zellen mit 1,5 Millilitern Osteoblastenablösungslösung pro Schale. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius bestätigen Sie die Ablösung der Zellen durch Lichtmikroskopie und neutralisieren die Ablöselösung mit frischem Osteoblasten-Differenzierungsmedium.

Poolen Sie die Zellen für ihre Zentrifugation in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie das Pellet in 25 Millilitern frischem Osteoblasten-Differenzierungsmedium. Filtrieren Sie die Zelllösung durch ein 70-Mikron-Sieb, um vor der Zählung alle aggregierten Zellen zu entfernen, und legen Sie 1 x 10 zu den 7 Zellen pro subkutaner Injektion beiseite. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und rekonstituieren Sie die Zellen bei einer 1 x 10 bis zu 7 Osteoblasten pro 50 Mikroliter eiskalter DPBS-Konzentration.

Mischen Sie die Osteoblasten mit einem gleichen Volumen phenolrotfreier Basalmembranmatrix und legen Sie die Zellen bis zu ihrer Injektion auf Eis. Nachdem bestätigt wurde, dass bei einer acht Wochen alten weiblichen immungeschwächten Nacktmaus kein Ansprechen auf das Zehenkneifen zu verzeichnen war, wurden die Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze geladen, die mit der 27-Gauge-Nadel ausgestattet war, und 100 Mikroliter der Zellen subkutan in die desinfizierte Flanke des Tieres injiziert. Überwachen Sie dann die Mäuse mit wöchentlichem Herzklopfen an der Injektionsstelle auf das Wachstum der subkutanen knotigen Dichten.

Die Tumorbildung sollte zwischen sechs und 10 Wochen nach der Injektion beobachtet werden. Etablierte LFS-iPS-Zellklone sollten eine typische humane embryonale Stammzellmorphologie aufweisen und eine positive alkalische Phosphataseaktivität aufweisen. LFS-iPS-Zellen exprimieren auch stark mRNAs mit Pluripotenzfaktoren, die mit menschlichen embryonalen Stammzelllinien vergleichbar sind und viel höher sind als die in elterlichen Fibroblasten beobachteten Werte.

Erfolgreich differenzierte LFS-MSCs exprimieren auch typische MSC-Marker wie CD44, CD73, CD105 und CD166, die durch Immunfluoreszenzfärbung bestimmt werden. Wenn die MSCs osteogenen Differenzierungssignalen ausgesetzt werden, zeigen die differenzierten Zellen ab dem neunten Tag eine positive alkalische Phosphatase-Aktivität und ab dem 21. Tag eine mineralische Ablagerung. Die differenzierenden Osteoblasten zeigen auch eine hochregulierte Expression von Prä-Osteoblasten und reifen Osteoblasten-Genen während ihres Differenzierungsprozesses.

Sechs bis 10 Wochen nach der Osteoblasteninjektion zeigen LFS-Osteoblastentumoren unreife Osteoblastenmerkmale, einschließlich positiver alkalischer Phosphataseaktivität, positiver Kollagenmatrixablagerung und negativer Mineralisierung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man iPS-Zellen des Li-Fraumeni-Syndroms in Osteoblasten unterscheidet und ein in vivo Osteosarkommodell unter Verwendung von patienteneigenen Osteoblasten erstellt. Neben dem Osteosarkom kann dieses auf dem Li-Fraumeni-Syndrom basierende iPS-Zell-basierte Krankheitsmodell auch auf andere Malignome im Zusammenhang mit dem Li-Fraumeni-Syndrom wie Weichteilsarkome, Brustkrebs und Hirntumoren angewendet werden.