Isolation von menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen für In-vitro- Decidualization

Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im Bereich der Reproduktionsmedizin zu beantworten, die sich auf die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Dezidualisierung beziehen und die Rolle spezifischer Gene bei der Dezidualisierung von endometrialen Stromazellen verstehen. Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die Isolierung humaner endometriumer Stromazellen und die anschließende künstliche Dezidualisierung durch die Supplementierung von Hormonen zu den Kulturmedien. Die Expression von hormonellen Veränderungen, wie z.B. Prolaktin und insulinähnliches Wachstumsfaktor-bindendes Protein eins, kann verwendet werden, um den Grad der Dezidualisierung zu bestätigen und zu quantifizieren.

Wichtig ist, dass auch die Machbarkeit dieses Protokolls zur Durchführung eines genspezifischen Knockdowns demonstriert wird. Die Biopsie wird mit einer sterilisierten Pinzette in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit zehn Millilitern frischem HBSF überführt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 500x G für 90 Sekunden. Entfernen Sie mit einer Ein-ml-Pipette das Medium und fügen Sie drei mL vorgewärmtes hES-Isolationsmedium hinzu.

Dekantieren Sie die Biopsie in eine 10-Zentimeter-Schale mit fünf ml hES-Isolationsmedium und beginnen Sie mit dem Zerkleinern mit einer Dumont 5-Pinzette und einer feinen Geradstichschere für etwa 20 Minuten. Übertragen Sie die gehackte Biopsie mit einer ml-Pipette in ein neues 50-ml-Röhrchen und geben Sie weitere sieben mL hES-Isolationsmedium in die Schale, um die restlichen Stücke in das 50-ml-Röhrchen zu übertragen. Zentrifugieren Sie die Probe dann zwei Minuten lang bei 800x G und entfernen Sie den Überstand mit einer Ein-ml-Pipette.

Filtrieren Sie anschließend die DNase-1- und Kollagenase-Aufschlussmischung durch einen 0,2-Mikron-Filter, der an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, direkt auf das Pellet. Drehen Sie dann das Röhrchen 10 Sekunden lang, um das Pellet wieder zu suspendieren, und inkubieren Sie es 90 Minuten lang in einem Wasserbad. Wirbeln Sie den Schlauch alle 10 Minuten lang durch, um sicherzustellen, dass das Gewebe richtig verdaut wird.

Nach der Inkubation filtrieren Sie die Suspension durch ein 40-Mikron-Zellsieb, das über einem neuen 50-Milliliter-Röhrchen gestapelt ist, um die Stromazellen zurückzugewinnen, und zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen dann 2,5 Minuten lang bei 800x G. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand mit einer Ein-Milliliter-Pipette und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören. Anschließend wird das Zellpellet in 10 Millilitern frischem hES-Isolationsmedium resuspendiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 800x G für 2,5 Minuten.

Nach der Zentrifugation wird der Überstand vorsichtig abgesaugt und die Zellen in sechs Millilitern frischem hES-Medium resuspendiert. Um anschließend Blutzellen zu entfernen, schichten Sie die resuspendierten Zellen langsam auf drei Milliliter Dichtegradientenmedium und zentrifugieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei 400x G. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand aufgefangen, ohne das Dichtegradientenmedium zu stören.

Fügen Sie dann hES-Medien hinzu, um das Gesamtvolumen auf 10 Milliliter zu erhöhen, und zentrifugieren Sie die Probe erneut bei 800x G für 2,5 Minuten. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und die Zellen in sechs Millilitern hES-Medium resuspendiert. Anschließend werden die Zellen in einen 75-Zentimeter-Kolben gegeben, indem sechs Milliliter der Zellresuspension und 10 Milliliter hES-Medium in den Kolben gegeben werden, gefolgt von einem sanften Mischen durch Schütteln des Kolbens.

Überprüfen Sie nach dem Plattieren die Zelldichte unter dem Mikroskop und kultivieren Sie die Zellen dann drei bis fünf Tage lang in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator, wobei Sie darauf achten, das hES-Medium alle zwei Tage zu wechseln. Nach 48 Stunden sollten die Zellen als Monoschicht wachsen. Im Allgemeinen erreichen die Zellen nach fünf Tagen eine Konfluenz von 80 bis 90 % in einem 75-Zentimeter-Kolben.

Für die siRNA-Transfektion beginnen Sie damit, 800.000 Zellen pro Well in einer Sechs-Well-Platte in dreifacher Ausführung für jede Bedingung zu plattieren, und inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator, um sich auf die Transfektion vorzubereiten. Nach zwei Tagen geben Sie 150 Mikroliter Opti-MEM serumfreies Medium in ein Fünf-ml-Röhrchen, gefolgt von der Zugabe von fünf Mikrolitern Transfektionsreagenz. Durch Inversion gut mischen und fünf Minuten inkubieren.

Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Opti-MEM serumfreies Medium in ein neues Fünf-ml-Röhrchen hinzu, gefolgt von der Zugabe von 16 Nanomol SRC-2 siRNA. Geben Sie dann 100 Mikroliter Opti-MEM serumfreies Medium in ein Fünf-ml-Röhrchen, gefolgt von der Zugabe von 16 Nanomol-Kontroll-siRNA. Kombinieren Sie nach der Inkubation das verdünnte Transfektionsreagenz mit der SRC-2 siRNA und mischen Sie es gut, indem Sie vorwärts und rückwärts pipettieren.

Kombinieren Sie dann das verdünnte Transfektionsreagenz mit der Kontroll-siRNA und mischen Sie es gut, indem Sie vorwärts und rückwärts pipettieren. Inkubieren Sie die Komplexe dann fünf Minuten lang. Während dieser Inkubation aspirieren Sie das hES-Medium und fügen Sie jedem Well einen Milliliter Wechselmedium hinzu.

Nach fünf Minuten Inkubation zentrifugieren Sie die Komplexe zwei Minuten lang bei 500x G, um die Lösung zu sammeln. Geben Sie dann 250 Mikroliter der siRNA-Transfektionsreagenzkomplexe in jede Vertiefung, die Zellen und Medien enthält, und mischen Sie durch leichtes Schaukeln, gefolgt von einer fünfstündigen Inkubation in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach fünf Stunden aspirieren Sie das Medium und wechseln Sie zu hES-Medien und setzen Sie die Inkubation zwei Tage lang fort, um sich auf einen In-vitro-Dezidualisierungsassay vorzubereiten.

Nach der 48-stündigen Transfektion und vor Beginn des In-vitro-Dezidualisierungsassays sind die transfizierten siRNA- und SRC-2-siRNA-Zellen der Tagesnullkontrolle zu entnehmen. Saugen Sie zuerst das Medium an und waschen Sie es mit einem ml PBS pro Well. Entfernen Sie dann das PBS, fügen Sie 300 Mikroliter RNA-Lysepuffer pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie drei Minuten lang.

Nach dreiminütiger Inkubation sammeln Sie die Zellen in RNA-Lysepuffer in einem 1,5-ml-Röhrchen für die spätere nachgelagerte Analyse. Bereiten Sie dann das EPC-Medium vor, indem Sie das entsprechende Volumen des Dezidualisierungsmediums aliquotieren und 10 nanomolare Estradiol, ein mikromolares Medroxyprogesteronacetat und 50 mikromolare zyklische Adenosinmonophosphate in ein 50-Milliliter-Röhrchen geben. Für die verbleibenden Vertiefungen am sechsten Tag geben Sie zwei Milliliter EPC-Medien in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für sechs Tage, wobei Sie das EPC-Medium alle 48 Stunden wechseln.

Nach dem sechsten Tag entnehmen Sie die transfizierten siRNA-Zellpellets der Kontrolle am sechsten Tag und die SRC-2 siRNA vom sechsten Tag in RNA-Lysepuffer für die nachgelagerte Analyse mittels Echtzeit-PCR. Die Induktion der Dezidualisierung durch Östrogen, Medroxyprogesteronacetat und zyklisches Adenosinmonophosphat führt zur Umlagerung von Stromazellen des Zytoskeletts von länglichen fibroblastischen Zellen zu abgerundeten Epithelzellen. Die Phalloidin-Färbung von endometrialen Stromazellen zeigt außerdem die Reorganisation des aktiven Faserzytoskeletts, die für die hES-Dezidualisierung charakteristisch ist.

In vehikelbehandelten hES bleiben die Zellen fibroblastisch aussehend, während in EPC-behandelten Zellen hES epithelioid erscheinen. Um die Wirksamkeit des In-vitro-Dezidualisierungsassays zu bestätigen, wurden die mRNA-Transkriptspiegel der Dezidualisierungsmarker Prolaktin und insulinähnliches Wachstumsfaktor-bindendes Protein-1 über einen Zeitraum von 6 Tagen bewertet. Bei der Dezidualisierung der menschlichen endometrialen Stromazellen stiegen die Prolaktin- und IGFBP1-Spiegel zeitabhängig an.

Der zeitabhängige Anstieg der sezernierten Prolaktinspiegel wurde auch durch die Untersuchung der hES-Gewebekulturmedien mittels ELISA-Methode bestätigt. Genspezifische Knockdown-Effekte auf die zellulären und molekularen Veränderungen der Dezidualisierung humaner endometriumer Stromazellen wurden am sechsten Tag der Kultur nach 48-stündiger siRNA-Transfektion mit Kontroll- oder Steroidrezeptor-Co-Aktivator 2 siRNA untersucht. Kontroll-siRNA-transfizierte hES zeigten zelluläre und molekulare Veränderungen, die mit einer korrekten Dezidualisierung übereinstimmen, einschließlich einer morphologischen Veränderung des Kopfsteinpflasters und erhöhter Transkriptspiegel der Dezidualisierungsmarker PRL und IGFBP1.

Beim SRC-2-siRNA-Knockdown blieb hES im Vergleich zu den transfizierten siRNA-transfizierten hES der Kontroll-siRNA fibroblastisch und zeigte signifikant verringerte PRL- und IGFBP1-Transkriptspiegel. Die SRC-2-Transkriptspiegel waren bei SRC-2-siRNA-transfizierten hES im Vergleich zu Kontroll-siRNA signifikant verringert, was auf die Durchführbarkeit dieser Methode zum Gen-Silencing hinweist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie primäre Stromazellen aus Endometriumbiopsien zum Zwecke der In-vitro-Dezidualisierung isolieren und ein bestimmtes Gen von Interesse mithilfe der siRNA-Transfektion ausschalten können.