Name: Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Lernen Sie die Bereicherung und Charakterisierung von Tumor-Immun- und Nicht-Immun-Mikroumgebungen in subkutanen murinen Tumoren. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse beider Zellfraktionen.

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JMN erkennt finanziellen Unterstützung vom National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) und dem nationalen Institut der Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) sowohl von den National Institutes of Health. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Dieses Projekt wurde auch durch die Zytometrie und Zellkern Sortierung am Baylor College of Medicine unterstützt mit Mitteln aus dem NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 und S10 RR024574) und die Unterstützung durch Experten der Joel M. Sederstrom.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) vom Baylor College of Medicine genehmigt.
1. Tumor Ernte und Verdauung
Hinweis: Der Zeitaufwand für die Ernte ist ~ 3-5 min/Tumor, und der Zeitaufwand für die Bearbeitung ist ~ 1 h + 2 – 3 min./Tumor.
<ol><li>Einschläfern Sie Mäuse durch Kohlendioxid Einatmen und sprühen Sie jede Maus nach unten mit 70 % Ethanol vor der Ernte um Haare Kontamination zu verhindern. Chirurgisch entfernen Sie subkutane Tumoren von den Mäusen und sicherzustellen Sie, dass die Tumoren frei von kontaminierenden Gewebe (z.B. Haare, Haut, Peritoneum, etc. sind). Jeder Tumor in 1,8 mL Basis RPMI-1640-Medien ohne fetalen bovine Serum (FBS) in einer 24-Well-Platte zu platzieren. Halten Sie für größere ernten die Platten kalt auf dem Eis, zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten. Hinweis: Wenn Sterilität erforderlich ist, müssen alle Tumor Sezierungen in eine biologische Kabinett mit sterilen chirurgischen Werkzeugen (z.B. Scheren, Zangen, etc.) sowie weitere Schritte durchgeführt werden. Tumoren mit der längsten Durchmesser zwischen 0,5 - 1 cm sind optimal, und größere oder kleinere Tumoren erfordern Skalierung der Reagenzien.</li>
	<li>Mit einer Schere die Tumoren in weniger als 1 mm3 Stück innerhalb jedes gut geschnitten.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 10 x Verdauung Cocktail durch Auflösen von Kollagenase ich bei 10 mg/mL, Kollagenase IV bei 2.500 U/mL und DNase I bei 200 U/mL in base RPMI-1640-Medien (ohne FBS). Hinweis: Die Verdauung cocktail kann einen Tag im Voraus zubereitet und bei-20 ° C gelagert werden; längerer Lagerung wird jedoch nicht empfohlen, da Enzyme Aktivität im Laufe der Zeit einmal aufgelöst verliert.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL 10 x Dissoziation Cocktail mit Kollagenase, I, IV Kollagenase und DNase ich in jede Vertiefung mit 1 mm3 Stücken.</li>
	<li>Lassen Sie die Proben für 1 h bei 37 ° C zu verdauen, während leicht bei 60-100 u/min mit einem orbital Platte Shaker schütteln. Hinweis: Die Höhe der Temperatur auf 37 ° C während der enzymatischen Verdauung verursachen immun-Zell-Aktivierung.</li>
	<li>Neutralisieren Sie nach 1 h die Reaktion durch Zugabe von 1 mL RPMI-1640 Medien ergänzt mit 5 % FBS und 2 mM EDTA in jede Vertiefung.</li>
	<li>Die Tumor-Verdauung und die restlichen Stücke der Tumor in einem 40 µm Zelle Sieb sitzt auf einem 50 mL Zentrifugenröhrchen Pipette. Hinweis: Schneiden Sie die Spitze weg von einer 1 mL-PIPETTENSPITZE für einfacher Transfer der Tumor Verdauung in das Sieb.</li>
	<li>Verwenden Sie einen 10 mL Spritzenkolben, um mechanisch die Tumor-Stücke durch das Sieb disaggregieren. Spülen Sie regelmäßig das Sieb mit 2 mL ergänzt RPMI-1640-Medien (mit 5 % FBS) und wiederholen Sie, bis die Zelle Sieb frei von Tumor ist. Hinweis: Ca. 4-10 mL der gesamten Medien sollte ausreichen, um das Sieb des Tumors ausreichend spülen. Hinweis: Legen Sie Proben auf Eis bis dieser Schritt, für alle Proben abgeschlossen ist, zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten.</li>
	<li>Passen Sie jede 50 mL Zentrifugenröhrchen, das gleiche Volumen mit Hilfe der ergänzten RPMI-1640-Medien. Hinweis: Die Einstellung der Lautstärke ist wichtig für den Ausgleich der Zentrifuge. Überspringen diesen Schritt führen Zentrifuge Sach- oder Personenschäden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Zellsuspensionen (805 X g, 5 min, 4 ° C), verwerfen Sie die Überstände zu und neu in 2 mL ergänzt RPMI-1640 Medien auszusetzen. Hinweis: Es kann eines zellverbandes bilden nach der Zentrifugation, die schwer zu Aufschwemmen. Verwenden Sie eine serologische 5-mL-Pipette und mischen schnell, um es oben zu brechen, bevor Sie fortfahren.</li>
</ol>2. Trennung von immun- und Tumor zellulären Brüche
Hinweis: Der Zeitaufwand für diesen Schritt ist ca. 1 h.
<ol><li>3 mL Dichte Gradienten Medium am unteren Rand eine 15 mL Zentrifugenröhrchen hinzugeben. Bereiten Sie vor und beschriften Sie genug Rohre für jeder Tumor.</li>
	<li>Schicht 2 mL der Tumor Zellsuspension auf Dichte Gradienten Mediums durch pipettieren langsam hinunter die Seite des Rohres zu verhindern, vermischen der beiden Schichten.</li>
	<li>Legen Sie vorsichtig die geschichteten Röhren in der Zentrifuge und Spin für 20 min bei 805 X g, 20 ° C, mit keine Bremse. Hinweis: Es ist äußerst wichtig, die richtige Abwägung zu überprüfen und sicherzustellen, dass keine Bremse während der Zentrifugation verwendet wird. Jede Störung dieses Prozesses führt Schicht zu mischen und die vollständige Probenrückgewinnung wird schwierig sein.</li>
	<li>Den Tumor infiltriert Leukozyten (TIL) Schicht und die Top-Medien-Schicht, eine neue 15 mL Tube mit einer transferpipette sorgfältig zu übertragen. Verwerfen Sie alle verbleibenden Dichte Gradienten Medium und Aufschwemmen der Tumor Pellet am Boden des Röhrchens in 2 mL ergänzt RPMI-1640. Hinweis: Nach Zentrifugation werden vier sichtbare Ebenen von oben nach unten die zu entsprechen: Medien, TILs, Dichte-Gradienten-Medium und Tumor Zelle Pellet. Siehe Abbildung 2A ein Beispiel der verschiedenen Schichten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie beide die TIL und tumorproben in Röhren (5 min, 805 X g, 4 ° C) zu trennen und entsorgen den überstand.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie TIL Probe in 200 µL und der Tumor Pellet in 2 mL ergänzt RPMI-1640-Medien. Halten Sie auf dem Eis, Lebensfähigkeit zu erhalten.</li>
</ol>3. Beschichtung und Färbung
Hinweis: Der Zeitaufwand für die Beschichtung ist 30 s/Tumor; der Zeitaufwand für die Oberfläche Färbung ist 1 h; der Zeitaufwand für die intrazelluläre Färbung ist 40 min; der Zeitaufwand für das Flow-zytometrie-Analyse 1 - 4 min/Tumor.
<ol><li>Vorbereiten und Label eine 96-Well U-Boden-Platte für jede Färbung Panel und einer zusätzlichen Platte für Zelle Immune zählt. Hinweis: In der Regel drei Platten sind insgesamt bereit: eine Lymphozyten-fokussierten Panel Platte, einer myeloischen ausgerichtete Panel Platte und eine Zellplatte zählen.</li>
	<li>Aliquoten panel die einzelligen Suspensionen in jede der Färbung Platten und einer eingestellten Lautstärke in die Graf-Platte. Hinweis: Die Graf-Platte wird verwendet, um die Gesamtzahl der Zellen hinzugefügt, um jedes Färbung Paneel, wodurch genaue zellenzahlen Bevölkerung zu berechnen. Ein Durchflusszytometer mit 96-Well-Platte-Probenahme und volumetrische Analyse-Funktionen bieten die Anzahl der Zellen pro Mikroliter in jeder Probe, und deshalb berechnen die Anzahl der Zellen, jede Färbung Panel hinzugefügt. Anzahl Platten können erworben werden, am nächsten Tag nach der Fixierung über Nacht bei 4 ° C, mit FACs Puffer spülen (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % FBS), und resuspending in einem bestimmten Volumen von FACs-Puffer.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 µL Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) pro Probe durch Zentrifugieren (5 min, 805 X g, 4 ° C) und dem abwerfen des Überstands zwischen jedem spülen, freie FBS zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL der Fc-Block, die Proben mit einer Multi-Kanal-Pipette mischen und 20 min bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL 2 X konzentriert extrazelluläre targeting Antikörper und fixierbar Lebensfähigkeit Fleck Mischung, mischen, mit einer Multi-Kanal-Pipette und 30 min im Dunkeln bei RT oder 4 ° c inkubieren Hinweis: Die genaue Färbung Bedingungen für den Antikörper ist abhängig von den Anweisungen des Herstellers. Alle Färbung Verdünnungen müssen DPBS, mit keine zusätzlichen FBS, Sättigung des Farbstoffs fixierbar Lebensfähigkeit zu verhindern. Entnehmen Sie bitte der Tabelle der Materialien/Geräte für die optimale Verdünnungen des Bereichs Färbung verwendet in diesem Manuskript. Antikörper und fixierbar Lebensfähigkeit Färbelösung ist bereit in einer Konzentration von 2 X eine endgültige 1 x Färbung Konzentration in 100 µL Gesamtvolumen Färbung bei dem Fc-Block hinzugefügt.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben zweimal mit FACs Puffer durch Zentrifugieren (5 min, 805 X g, 4 ° C) und die Überstände zwischen jedem spülen zu verwerfen.</li>
	<li>In 200 µL 1 x Fixierung/Permeabilisierung Lösung aufschwemmen und Inkubation über Nacht bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden. Hinweis: Das Experiment kann angehalten werden über Nacht an dieser Stelle: halten Sie die Proben bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden.</li>
	<li>Am folgenden Tag, Zentrifugieren Sie die Platten (805 X g, 5 min, 4 ° C) und verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Einmal mit 200 µL 1 x Permeabilisierung Puffer, Zentrifuge (5 min, 805 X g, 4 ° C), spülen und den überstand verwerfen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL 1 X konzentrierte intrazellulären Antikörper Färbung Panel in 1 X Permeabilisierung Puffer vorbereitet und inkubieren Sie für 30 Minuten im Dunkeln bei RT oder 4 ° C (Dies hängt Färbung Empfehlungen vom Hersteller).</li>
	<li>Spülen, einmal mit 1 X Permeabilisierung Puffer (805 X g, 5 min, 4 ° C), den überstand verwerfen und ein zweites Mal mit FACs Puffer spülen (PBS mit 2 % FBS).</li>
	<li>Aufschwemmen der Proben in 300 µL Puffer FACs (PBS mit 2 % FBS), übertragen Sie die Proben auf Flow Cytometry Röhren und Flow-zytometrie-Analyse durchführen.</li>
</ol>

<ol><li>Fouad, Y. A., Aanei, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446472/">Revisiting the hallmarks of cancer.</a> American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+role+in+promoting+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth.</a> Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).</li>
<li>Chiou, V. L., Burotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudoprogression+and+Immune-Related+Response+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).</li>
<li>Menon, S., Shin, S., Dy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Cancer+Immunotherapy+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors.</a> Cancers. 8 (12), 106(2016).</li>
<li>Denkert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Lymphocytes+As+an+Independent+Predictor+of+Response+to+Neoadjuvant+Chemotherapy+in+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+ablative+radiation+on+local+tumor+require+CD8%2B+T+cells%3A+changing+strategies+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment.</a> Blood. 114 (3), 589-595 (2009).</li>
<li>Stakheyeva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+immune+component+of+tumor+microenvironment+in+the+efficiency+of+cancer+treatment%3A+perspectives+for+the+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy.</a> Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-Cytometry%3A+A+Method+for+Highly+Multiplex+Quantitative+Tissue+Imaging+Analysis+Applied+to+Dendritic+Cell+Subset+Microanatomy+in+Lymph+Nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li>
<li>Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cell+Subsets+in+Tumor-Bearing+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).</li>
<li>Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+murine+small+intestine+leukocyte+isolation+for+global+immune+phenotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).</li>
<li>Casadevall, A., Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigorous+Science%3A+A+How-To+Guide%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rigorous Science: A How-To Guide.</a> mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyTOF+supports+efficient+detection+of+immune+cell+subsets+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples.</a> Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).</li>
<li>Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Mass+Cytometry+%28CyTOF%29+for+Functional+and+Phenotypic+Analysis+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells.</a> Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).</li>
<li>Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Tumor-infiltrating+Leukocyte+Subsets+in+a+Subcutaneous+Tumor+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Zur Zeit besteht aus vielfältigen und komplexen zellulären Komponenten und Moleküle. Aktuelle Hinweise darauf, dass genaue Charakterisierung dieser Umgebung bieten ein besseres Verständnis der Behandlungserfolg oder Misserfolg, und sogar helfen kann, Mechanismen der therapeutischen Widerstand zu identifizieren. Intratumorale Anhebung der verschiedenen immunsuppressiven Zellen (d. h. MDSCs, regulatorische T-Zellen, etc.) kann beispielsweise Effektor Immunantworten zu mildern und immuntherapeutischen Wirk...

Die unterdrückende Zeit ist vor kurzem als ein Markenzeichen von Krebs erkannt worden und bekannt, um eine bedeutende Rolle in der Entwicklung, Fortschritt und Schutz der soliden Tumoren Krebserkrankungen sowie ihre Anfälligkeit für Immuntherapie1zu mildern. Die Zeit besteht aus zahlreichen zellulären Teilmengen und Phänotypen, die kritischen Einblick in den immunologischen Status des Tumors liefern. Diese immunologischen Teilmengen können weiter in Zellen Lymphozyten oder myeloischen Ursprungs geschichtet werden, bilden zusammen die Mehrheit der angeborenen und der adaptiven Immunantwort2,3. Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Krebsimmuntherapie haben gezeigt, dass immunotherapeutic Strategien (z.B. immun Checkpoint-Inhibitoren, chimeric Antigen Rezeptor T-Zellen, etc.) das Potenzial haben, dauerhafte Krebs auslösen Regressionen; Sie bleiben jedoch relativ unwirksam bei soliden Tumoren Krebserkrankungen4,5. Zahlreiche Gruppen haben der kritische Hürde gezeigt, dass die Zeit am Behandlung Erfolg6,7spielen kann, und somit müssen genau bewertet werden neue Immuntherapien in der präklinischen Einstellung mit Schwerpunkt speziell bleibt auf ihre Fähigkeit, zu modulieren oder zu überwinden, die Zeit8.
Aktuellen Bemühungen um die Zeit in der Regel charakterisieren nutzen entweder Mikroskopie oder flow Cytometry zusammen mit Antikörper labeling Strategien zur Ermittlung immun zellulären Teilmengen und ihre Funktionen9,10. Diese beiden Strategien informieren einzigartig anders, wie Mikroskopie räumliche Aufwertung des zellulären Teilmengen ermöglicht und Durchflusszytometrie hohen Durchsatz und breiteren Quantifizierung der Zellveränderungen bietet. Trotz der jüngsten Verbesserungen in fluoreszierenden multiplex Immunohistochemistry Optimierung spectral imaging Systeme, die nun bis zu 7 Parameter unterstützen können, begrenzt Panelgröße erschwert breiten Ebene immun Profilierung und somit ist diese Technik oft reserviert für weitere Analysen konzentriert. Infolgedessen bleibt Durchflusszytometrie eines der am weitesten verbreitete Immune profiling Techniken. Trotz seiner weiten Verbreitung in Zeit Charakterisierung sind die Methoden zur Verarbeitung und Färbung sehr variabel. Am häufigsten Protokolle nutzen ein Tumors abkoppelt Enzym (d. h. Collagenases, DNase, etc.) und manuelle Dissoziation Methoden, einzellige Suspensionen zu erreichen, gefolgt von Antikörper Färbung und Analyse7. Trotz der Vorteile der einzelnen Methoden haben zahlreiche Gruppen die umfangreiche Variabilität gezeigt, die durch diese Techniken11induziert werden kann. Dadurch Kreuz-Studie Vergleiche des Tumors Mikroumgebung profiling extrem schwierig, selbst wenn das gleiche Modell murine Tumor zu bewerten. Darüber hinaus diese Methoden bieten begrenzten Potential, Tumor zellulären bewerten und Tumor-Immunantwort zu infiltrieren Komponenten unabhängig voneinander, da beide Komponenten nach der Verdauung durchsetzt sind. Probenmenge begrenzt dann Multi-Panel zu beflecken und Analyse, die ein wichtiges Thema wird bei dem Versuch, seltene immunologische Teilmengen zu charakterisieren (z.B. Tumor-spezifischen T-Zellen)12. Neuere Techniken wie Masse zytometrie oder Cytometry durch Flugzeit (CyTOF), ermöglichen hochdimensionalen phänotypische Analyse der zellulären Teilmengen mit einigen Systemen Panel Entwürfe von mehr als 42 unabhängige Parameter13zu unterstützen. Trotz der enormen Kraft CyTOF Technologie in immun-profiling bleibt es wegen der Kosten, Analyse-Kompetenz und der Zugang zu den Geräten begrenzt. Darüber hinaus viele CyTOF Protokolle empfehlen Reinigung immun Teilmengen, Signal-Rausch-Verhältnis14zu verbessern, und so empfehlen wir, dass unsere Bereicherung-Methode verwendet werden könnte oberhalb der CyTOF Analyse zur Verbesserung der Datenqualität.
Hier beschreiben wir eine Tumor Mikroumgebung Verdauung und Analyse-Methode, die Tumor-Immunantwort enthält infiltrieren Trennung. Diese Methode soll ermöglichen, unabhängige Hochdurchsatz-Profilierung der Tumor immun infiltrieren und Tumor zellulären Fraktionen zur weiteren Charakterisierung von Tumor Mikroumgebung. Mit dieser Methode zeigen wir weiter die Bedeutung der ganze Tumor Analyse, wie eine subkutane soliden Tumoren Modell gefunden wurde, um erhebliche räumliche immunologischen Heterogenität zu haben. Insgesamt kann diese Methode genauer und konsequent zwischen Proben vergleichen, weil es für immun zellulären Teilmengen im Tumor bereichert und ermöglicht unabhängige Profilierung der Tumorzelle und immun Bruchteile eines Tumors.

<table><tbody><tr><td>6 bis 12 Wochen altes Männchen C57BL/6 Mäuse</td><td>Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Mäuse, die in unseren Tumorstudien verwendet wurden</td></tr><tr><td>MEER Murine Syngene Krebszelllinie</td><td>Erworben von einem Kooperationspartner&nbsp;</td><td>N/A</td><td>E6/E7 HPV-Antigen, das murine Tonsillenepithelkarzinom-Zelllinie exprimiert&nbsp;</td></tr><tr><td>70% Isopropylalkohol&nbsp;</td><td>EMD Milipore&nbsp;</td><td>PX1840</td><td></td></tr><tr><td>Murine Chirurgischer Werkzeugsatz</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td>Benötigt in erster Linie nur eine Schere, eine Pinzette und ein Skalpell.</td></tr><tr><td>24-Well-Platte&nbsp;</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>T1024</td><td>Oder eine 24-Well-Platte mit flachem Boden.&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase I&nbsp;</td><td>EMD Milipore</td><td>234153</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Low Speed Orbital Shaker</td><td>BioExpress (Lieferant: Genemate)&nbsp;</td><td>S-3200-LS</td><td>Oder ein beliebiger Orbitalschüttler.&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermoregulierender Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-255-27</td><td>Oder ein anderer thermoregulierter Inkubator</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>AMRESCO</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipette und Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>13-690-032</td><td>Oder eine andere Pipette und Spitzen</td></tr><tr><td>40 um Zellsiebe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td> 15 mL konische Röhrchen <td></td></tr><tr><td></td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok Spritze ohne Nadeln</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep Density Gradient Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P7212</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-U-Bodenplatten</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>D8573</td><td></td></tr><tr><td>FoxP3 Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>00-5523-00</td><td>Fix/Permeabilisierungspuffer und Permeabilisierungspuffer</td></tr><tr><td>Thermoregulierte Zentrifuge</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Durchflusszytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Für die volumetrische Zählung von 96-Well-Zellen&nbsp;</td></tr><tr><td>Gereinigtes Ratten-Anti-Maus-CD16/CD32 (Maus-BD-Fc-Block) Klon 2.4G2&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>553141</td><td>Fc Block</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixierbarer blauer Totzellen-Fleckenkit, für UV-Anregung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34962</td><td>Fixierbarer Viabilitätsfleck</td></tr><tr><td>CD45 Monoklonaler Antikörper (30-F11), APC-eFluor 780</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>47-0451-80</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta Monoklonaler Antikörper (H57-597), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8-& alpha; Antikörper (KT15), PE</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53473&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Monoklonaler Antikörper (GK1.5), PE-Cyanin5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0041-81</td><td></td></tr><tr><td>MHC Klasse II (I-A/I-E) Monoklonaler Antikörper (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>56-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Monoklonaler Antikörper (N418), PE-Cyanin5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15-0114-82</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Monoklonaler Antikörper (BM8), eFluor 450</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48-4801-80</td><td></td></tr><tr><td>CD11b Monoklonaler Antikörper (M1/70), APC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6G (Gr-1) Monoklonaler Antikörper (RB6-8C5), PE</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoklonaler Antikörper (MIH5), PE-Cyanin7</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25-5982-80</td><td></td></tr><tr><td>CD273 (B7-DC) monoklonaler Antikörper (122), PerCP-eFluor 710</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46-9972-82</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 monoklonaler Antikörper (B56), BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563755</td><td></td></tr></tbody></table>

bereicherung und charakterisierung von dem tumor immun und nicht-immunen mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen tumoren

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Der Tumor immun Mikroumgebung (Zeit) wurde vor kurzem als kritischer Vermittler der Behandlungserfolg bei soliden Tumoren, vor allem für Immuntherapien anerkannt. Jüngste klinische Fortschritte in der Immuntherapie unterstreichen die Notwendigkeit für reproduzierbare Methoden genau und gründlich den Tumor und seine damit verbundenen immun infiltrieren zu charakterisieren. Tumor enzymatischen Verdauung und durchflusszytometrischen Analyse ermöglichen umfassende Charakterisierung von zahlreichen Immunzelle Teilmengen und Phänotypen; Tiefe der Analyse wird jedoch oft durch Fluorophor Beschränkungen der Panel-Design und die Notwendigkeit, große tumorproben erwerben seltene immun Populationen von Interesse zu beobachten begrenzt. So haben wir eine effektive und hohe Durchsatz-Methode zum Trennen und bereichern das Tumor immun Infiltrat aus den nicht-immunen Tumor-Komponenten entwickelt. Die beschriebenen Tumor Verdauung und zentrifugale Dichte basierenden Trennung Technik ermöglicht separate Charakterisierung des Tumors und Tumor immun Infiltrat Brüche und zelluläre Rentabilität bewahrt und stellt somit eine umfassende Charakterisierung des Tumors immunologischen Status. Diese Methode wurde verwendet, um die umfangreichen räumlichen immun Heterogenität in soliden Tumoren, charakterisieren die weiterer Beweis für die Notwendigkeit einer einheitlichen ganzen Tumor immunologischen profiling Techniken. Insgesamt bietet diese Methode eine wirksame und anpassungsfähige Technik für die immunologische Charakterisierung von subkutanen soliden murinen Tumoren; So kann dieses Tool verwendet werden, um den Tumor immunologischen Funktionen besser zu charakterisieren und in die präklinische Bewertung der neuartigen immunotherapeutic Strategien.

Unsere Ergebnisse zeigen den bedeutenden Nutzen von TIL Trennung von nicht-immunen Tumor Komponenten, wie im Protokoll erklärt. Darüber hinaus zeigen mit der beschriebenen Methode wir die bedeutende immunologische Heterogenität der etablierten soliden Tumoren.
Ein erhebliches Problem mit vielen Tumor Dissoziation Techniken ist der Verlust der Probe Entwicklungsfähigkeit, meist als Folge der harten Verdauung Bedingungen (z.B....

Hier beschreiben wir eine Methode zum Trennen und Bestandteil der Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebung in etablierte subkutane Tumoren zu bereichern. Diese Technik ermöglicht die separate Analyse der Tumor immun infiltrieren und nicht-immunen Tumor Fraktionen die umfassende Charakterisierung der Tumor immun Mikroumgebung ermöglichen können.

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, eine Methode zur gleichzeitigen Profilierung sowohl der Immun- als auch der Krebszellfraktion bereitzustellen, die zur Immunmikroumgebung solider Tumoren beiträgt. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen in der Immunonkologie zu beantworten, z. B. welche immunen und nicht-immunen seriellen Veränderungen innerhalb des Tumors nach einer bestimmten Behandlung auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die effektive Anreicherung von immunen und nicht-immunen Komponenten des Tumors ermöglicht und eine gründliche Profilierung des immunologischen Zustands des Tumors ermöglicht.Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein effizientes Profil der Immunmikroumgebung des Tumors zu erstellen und behandlungsinduzierte Veränderungen zu identifizieren. Nachdem Sie die Maus mit 70% Ethanol besprüht haben, um eine Haarkontamination zu verhindern, entfernen Sie die subkutanen Tumoren chirurgisch und achten Sie darauf, dass die Tumore frei von kontaminierendem Gewebe sind. Legen Sie dann jeden Tumor in 1,8 Milliliter basisches RPMI 1640-Medium ohne fötales Rinderserum in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte auf

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In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von hochreinem Populationen von Leukozyten, die Tumore infiltrieren. Dieses Protokoll wird aus der Miltenyi Biotech-Protokoll geeignet ist, Ausbeute und Reinheit zur Isolierung von Zellen aus komplexen Tumorgewebe zu verbessern.

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

Dieses Video zeigt das Testen einer adjuvanten oder zusätzlichen Therapie in einem Mausmodell mit unvollständig resezierten subkutanen Tumoren. Die teilweise tumorresezierte Maus wird mit einem Antikörper behandelt, der auf das antizytotoxische Protein der T-regulatorischen Zellen abzielt, was möglicherweise das Nachwachsen des Tumors reduziert und auf eine wirksame adjuvante Therapie hindeutet.

Eine adjuvante Therapie im Mausmodell mit einem unvollständig resezierten subkutanen Tumor

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur detaillierten Bewertung von Leukozyten-Untergruppen innerhalb der Tumormikroumgebung in einem Maustumormodell. Chemerin-exprimierende B16-Melanomzellen wurden subkutan in syngene Mäuse implantiert. Zellen aus der Tumormikroumgebung wurden dann gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, was eine detaillierte Analyse der Leukozyten-Untergruppe ermöglichte.

Bewertung der Tumor-infiltrierenden Leukozyten-Untergruppen in einer subkutanen Tumormodell

Wir haben einen durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz angepasst, um die Tumormikroumgebung (TME) nachzuahmen. Das Modell besteht aus einer gemischten Zellkultur, ermöglicht die vereinfachte Generierung hochangereicherter individueller Zellpopulationen ohne Verwendung von Fluoreszenzmarkierung oder Zellsortierung und ermöglicht die Untersuchung der interzellulären Kommunikation innerhalb der TME unter Normal- oder Stressbedingungen.

Ein Mimic des Tumor-Microenvironment: Eine einfache Methode für Enriched Zellpopulationen Generierung und Untersuchung der interzellulären Kommunikation

Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Methode für die Entwicklung einer orthotopen Mausmodell von Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür. Tumoren zeigen klinisch relevante histopathologischen Merkmale der Krankheit, einschließlich der Nekrose, schlechte Differenzierung und Knotenpunkte Metastasen immun Infiltration. Tumor-tragenden Mäusen Symptome klinisch relevante wie Dysphagie, Kiefer Verschiebung und Gewichtsverlust.

Intramucosal Impfung des Plattenepithelkarzinom Zellen in Mäusen für Tumor immun Profilierung und Behandlung Antwort Bewertung

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

Hier stellen wir ein Tumortransplantationsprotokoll zur Charakterisierung von tumorinhärenten und peripherieabgeleiteten tumorinfiltrierten Lymphozyten in einem Maustumormodell vor. Die spezifische Verfolgung des Zustroms von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen mit Durchflusszytometrie zeigt die Dynamik der phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen während der Antitumor-Immunantwort.

Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen

Es wird ein Standardprotokoll beschrieben, um die Antitumoraktivität und die damit verbundene Toxizität von IL-1α in einem syngenen Mausmodell von HNSCC zu untersuchen.

Bewertung der in vivo Antitumoraktivität von Polyanhydrid IL-1α Nanopartikeln

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Mäusen mit menschlichem Immunsystem (KIS) für immunonkologische Studien. Anweisungen und Überlegungen zur Verwendung dieses Modells zum Testen von humanen Immuntherapeutika an menschlichen Tumoren, die in dieses Modell implantiert wurden, werden vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf der Charakterisierung der Reaktion des menschlichen Immunsystems auf den Tumor liegt.

Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren

Diese Arbeit konzentriert sich auf die in vivo subkutane Induktion von lumineszierenden kolorektalen Karzinomzellen in einem Mausmodell und die anschließende Lumineszenzmessung mit Hilfe eines bildgebenden Systems. Das Verfahren zielt darauf ab, ein reproduzierbares Tumorwachstumsmodell für das Echtzeit-Monitoring und die therapeutische Bewertung zu etablieren.

Subkutane Injektion von humanen Darmkrebszellen in athyme Nacktmäuse zur Bewertung der Wirksamkeit von Antitumoren

Mit dem wachsenden Interesse an intratumoraler Immuntherapie ist es unerlässlich, Tumormodelle auszuwählen, die zugänglich und praktisch sind. Subkutane Tumore sind leicht zu etablieren, aber schwer zu visualisieren und zu manipulieren. In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von intradermalen Tumoren, die eine verbesserte Sichtbarkeit und Zugänglichkeit bieten.

Intradermale Tumorimplantation als robustes Modell für Studien zur intratumoralen Immuntherapie bei Murinkrebs

Lernen Sie die Bereicherung und Charakterisierung von Tumor-Immun- und Nicht-Immun-Mikroumgebungen in subkutanen murinen Tumoren. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse beider Zellfraktionen.

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren (Video) | JoVE Journal

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

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