Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, eine Methode zur gleichzeitigen Profilierung sowohl der Immun- als auch der Krebszellfraktion bereitzustellen, die zur Immunmikroumgebung solider Tumoren beiträgt. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen in der Immunonkologie zu beantworten, z. B. welche immunen und nicht-immunen seriellen Veränderungen innerhalb des Tumors nach einer bestimmten Behandlung auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die effektive Anreicherung von immunen und nicht-immunen Komponenten des Tumors ermöglicht und eine gründliche Profilierung des immunologischen Zustands des Tumors ermöglicht.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein effizientes Profil der Immunmikroumgebung des Tumors zu erstellen und behandlungsinduzierte Veränderungen zu identifizieren. Nachdem Sie die Maus mit 70% Ethanol besprüht haben, um eine Haarkontamination zu verhindern, entfernen Sie die subkutanen Tumoren chirurgisch und achten Sie darauf, dass die Tumore frei von kontaminierendem Gewebe sind. Legen Sie dann jeden Tumor in 1,8 Milliliter basisches RPMI 1640-Medium ohne fötales Rinderserum in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte auf Eis.

Wenn alle Tumore gesammelt wurden, schneiden Sie die Proben mit einer Schere in weniger als einen Kubikmillimeter große Stücke und geben Sie 200 Mikroliter eines frisch zubereiteten 10-fachen Dissoziationscocktails mit Kollagenase-1, Kollagenase-4 und DNase in jede Vertiefung. Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius in einem orbitalen Plattenschüttler bei 60 bis 100 U/min wird die Reaktion mit einem Milliliter RPMI 1640 Medium, das mit 5 % FBS und zwei Millimolaren EDTA ergänzt wird, neutralisiert und mit einer modifizierten Ein-Milliliter-Pipettenspitze jede Tumoraufschlämmungsprobe in einzelne konische 50-Milliliter-Röhrchen überführt, die mit einzelnen 40-Mikrometer-Sieben bedeckt sind. Disaggregieren Sie die Tumorstücke mit einem 10-Liter-Spritzenkolben mechanisch durch die Siebe und spülen Sie jedes Sieb regelmäßig mit zwei Millilitern RPMI 1640 Medium plus 5 % FBS, bis die Siebe frei vom Tumor sind.

Wenn alle Tumoren dissoziiert wurden, fügen Sie jedem Röhrchen nach Bedarf Medium hinzu, um alle Proben auf das gleiche Volumen zu bringen, und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Verwenden Sie dann eine serologische Fünf-Milliliter-Pipette, um die Pellets in zwei Millilitern FBS-supplementiertem Medium pro Röhrchen zu resuspendieren. Um die Immun- und Tumorzellfraktionen zu trennen, geben Sie drei Milliliter Dichtegradientenmedium auf den Boden eines konischen 15-Milliliter-Röhrchens pro Probe und schichten Sie langsam zwei Milliliter Tumorzellsuspension an der Seite jedes Röhrchens auf jeden Gradienten.

Achten Sie darauf, dass die Tumorzellsuspensionen vor der Schichtung gut gemischt werden, dass die Zellsuspensionen langsam an der Seite der Röhrchen herunterpipettiert werden und dass die Röhrchen vorsichtig behandelt werden, um eine Vermischung der Schichten zu verhindern. Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation und sammeln Sie das obere Medium und die tumorinfiltrierenden Leukozytenschichten vorsichtig in einem neuen 15-Milliliter-Röhrchen pro Probe. Verwerfen Sie das restliche Dichtegradientenmedium und resuspendieren Sie die Tumorpellets in zwei Millilitern Medium plus FBS pro Röhrchen.

Dann zentrifugieren Sie alle Proben und resuspendieren die tumorinfiltrierenden Leukozyten in 200 Mikrolitern und die Tumorzellen in zwei Millilitern Medium plus FBS pro Röhrchen auf Eis. Um die Zellen zu plattieren, beschriften Sie eine 96-Well-U-Bodenplatte für jedes Immunfärbepanel plus eine zusätzliche Platte für die Zellzählung und aliquotieren Sie die Einzelzellsuspensionen in jede der Färbeplattenplatten und die Calc-Platte. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 Mikrolitern Dulbecco's PBS pro Probe und blockieren Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern FC-Block pro Vertiefung für 20 Minuten bei vier Grad Celsius.

Am Ende der Blocking-Inkubation geben Sie 50 Mikroliter eines 2-fach konzentrierten extrazellulären Antikörpers und einer fixierbaren Viabilitätsfärbemischung in jede Vertiefung für eine 30-minütige Inkubation im Dunkeln. Am Ende der Färbeinkubation waschen Sie die Proben zweimal mit FACS-Puffer und resuspendieren die Pellets über Nacht bei vier Grad Celsius lichtgeschützt in 200 Mikrolitern Fixierungs- und Permeabilisierungslösung. Am nächsten Tag werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, gefolgt von einer Wäsche mit 200 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer pro Well.

Markieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern intrazellulärem Antikörper-Färbepanel in Permeabilisierungspuffer für eine 30-minütige Inkubation im Dunkeln, gefolgt von einer weiteren Permeabilisierungspufferwäsche. Waschen Sie dann die Zellen erneut mit FACS-Puffer und resuspendieren Sie die Proben in 300 Mikrolitern frischem FACS-Puffer für ihre Analyse mittels Durchflusszytometrie. Die Tumorverdauung, wie gezeigt, mit oder ohne Dichtegradienten-Mediumanreicherung, führt zu einer etwa 70 bis 90 % lebensfähigen Gesamttumorzellpopulation, die mittels Durchflusszytometrie beurteilt wird.

Die Anreicherung des Dichtegradienten-Mediums bewirkt eine mehr als zweifache Erhöhung der CD45-positiven tumorinfiltrierenden Leukozytenfraktion im Vergleich zu nicht angereicherten Tumorverdauungen sowie zu zahlreichen Immunzelluntergruppen, die häufig in Studien zur Immunmikroumgebung beobachtet werden. Die CD45-negative Tumorzellfraktion kann auch für zahlreiche Tumormerkmale profiliert werden, wie z. B. die allgemeine Tumorviabilität oder Apoptose, die Proliferationskapazität und die Expression verschiedener immunsuppressiver Marker. Um zu bestimmen, wie sich myeloische und lymphozytäre immunologische Untergruppen in einem einzelnen soliden Tumor unterscheiden, kann der Tumor in vier gleiche Teile unterteilt werden, so dass jeder Abschnitt ungefähr gleiche intratumorale Regionen sowie gleiche dermale und peritoneale zugewandte Abschnitte enthält.

Jedes Stück kann dann separat verdaut und wie gezeigt auf das Vorhandensein verschiedener Immunzellpopulationen analysiert werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis 8 Stunden abgeschlossen werden, je nachdem, wie viele Proben Sie haben. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, schnell, aber effizient zu arbeiten, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Dissoziations- und Trennungsschritte Techniken beinhalten, die allein durch geschriebenen Text schwer zu erlernen sind. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie sich zelluläre Populationen innerhalb eines Tumors verändern, sowohl in Bezug auf die Abundanz als auch auf den Phänotyp. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sowohl die immunen als auch die nicht-immunen Komponenten eines etablierten subkutanen murinen Tumors mit den demonstrierten Verdau- und Dichtegradiententrennungstechniken trennen und analysieren können.