Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der kardialen Reprogrammierung zu beantworten, z. B. um zu identifizieren, welche Signalwege die Kardiomyogenese fördern oder reparieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir funktionell induzierte Kardiomyozyten erzeugen können, die effizienter sind als bisher veröffentlichte Methoden. Diese chemische Herzkrankheit führt zum Verlust von Kardiomyozyten und einer Beeinträchtigung der Herzfunktion.

Daher kann diese Technik zu einer hohen Reparatur beitragen, indem sie Fibroblasten in funktionell induzierte Kardiomyozyten umwandelt. Um mit der Produktion von Retroviren zu beginnen, züchten Sie Platin-E- oder PE-Zellen in PE-Medium. Ergänzen Sie es mit Auswahlmarkern in einer 10-cm-Schale in einem Schrank der Biosicherheitsstufe zwei.

Alle zwei Tage passieren die Zellen bei einer bis vier oder einer bis fünften Dilusion. Einen Tag vor der geplanten Transfektion säen Sie PE-Zellen in 10 ml Wachstumsmedium in einer 10-cm-Kulturschale aus und schaukeln Sie die Schalen dann vorsichtig hin und her. Stellen Sie die Schalen vorsichtig in einen Inkubator, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu ermöglichen, und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang.

Geben Sie am Tag der Transfektion den GHMT2M-Cocktail in eine 1,5-ml-Tube. Geben Sie anschließend 360 Mikroliter reduziertes Serummedium in ein separates 1,5-ml-Röhrchen. Geben Sie anschließend 36 Mikroliter Transfektionsreagenz in das reduzierte Serummedium und schnippen Sie vorsichtig mit dem Röhrchen, um es zu mischen.

Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Das in diesem Schritt verwendete Transfektionsreagenz bindet an Kunststoff. Um eine effiziente Transfektion zu vermeiden, achten Sie darauf, das Transfektionsreagenz direkt in das reduzierte Serummedium zu pipettieren und vermeiden Sie es, die Pipettenspitze mit der Röhrchenwand in Berührung zu bringen.

Geben Sie dann die reduzierte Serummedien-Transfektionsreagenzmischung in das Röhrchen, das den GHMT2M-DNA-Cocktail enthält. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig zum Mischen und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Zum Schluss geben Sie das Transfektionsreaktionsgemisch tropfenweise zu den PE-Zellen.

Schwenken Sie das Gericht vorsichtig 10 bis 15 Sekunden lang. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius für 16 bis 20 Stunden. Bestreichen Sie nun 60-mm-Schalen mit Kollagen und inkubieren Sie mindestens zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Geben Sie dann frisch aufgetaute embryonale Mausfibroblasten oder MEFs in die mit Kollagen überzogenen Schalen. Und fügen Sie Wachstumsmedium zu einem endgültigen Volumen von 4 ml pro 60-mm-Schale hinzu. Schütteln Sie die Schalen vorsichtig und stellen Sie sie in den Inkubator.

Beim Plattieren von MEFs ist es wichtig, dass die Zellen gleichmäßig plattiert werden. Vermeiden Sie es, das Geschirr zu verwirbeln, da dies zu einem unebenen Anrichten führen kann. Schaukeln Sie die Schale stattdessen vorsichtig hin und her und stellen Sie sie vorsichtig in den Inkubator.

Verwenden Sie 24 Stunden nach der PE-Zelltransfektion eine 30-ml-Spritze, um das von den Zellen erzeugte retrovirale Medium zu sammeln. Geben Sie die erste Sammlung des retroviralen Mediums durch einen 45-Mikrometer-Filter in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Geben Sie dann 10 ml frisches Wachstumsmedium an die Wand der Schale und achten Sie darauf, dass die PE-Zellen nicht verdrängt werden.

Inkubieren Sie die Zellen weitere 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 7,2 Mikroliter 10 mg pro Milliliter Hexidinmethrinbromid-Transduktionsreagenz in das konische 50-ml-Röhrchen mit dem Virusüberstand hinzu. Aspirieren Sie nun das Medium aus den MEFs und geben Sie 4 ml des frisch geernteten retroviralen Mediums in die Schale.

Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 48 Stunden nach der Transfektion der PE-Zellen, sammeln Sie das retrovirale Medium und führen Sie die Transduktion genau auf die gleiche Weise durch wie bei der ersten Entnahme. Entsorgen Sie die PE-Zellen nach der zweiten Entnahme des retroviralen Mediums und fügen Sie 10 % Bleichmittel zu allen Materialien hinzu, die mit dem retroviralen Medium in Berührung kommen.

Nach der Inkubation aspirieren Sie das retrovirale Medium aus den MEFs und fügen Sie 4 ml ICM-Medium hinzu, das 05 Mikromolare und einen TGF-Beta-Typ-1-Rezeptorinhibitor enthält. Wechseln Sie alle zwei Tage das ICM-Medium, bis es weiter verwendet werden kann. Um mit der Immunfärbung zu beginnen, aspirieren Sie das ICM-Medium von Tag 14 reprogrammierten MEFs.

Waschen Sie dann die Zellen einmal mit 1 ml 1X eiskaltem PBS, pro Well der 12-Well-Platte. Als nächstes aspirieren Sie das PBS, fügen Sie 500 Mikroliter 2%-Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen zu fixieren, und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach dem Aspirieren des Paraformaldehyds waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 ml PBS.

Nach dem Aspirieren des PBS 500 Mikroliter 02%Triton X 100 zugeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Aspiration von Triton X 100 blockieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern 10%igem Pferdeserum für 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Als nächstes aspirieren Sie das Pferdeserum und fügen 500 Mikroliter verdünnten Primärantikörper hinzu. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Aspirieren des Primärantikörpers dreimal mit 1 ml PBS waschen.

Nach der letzten Wäsche von PBS fügen Sie 500 Mikroliter verdünnten Sekundärantikörper hinzu. Wickeln Sie die Platte in Folie ein und inkubieren Sie sie eine Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Zum Schluss den Sekundärantikörper aspirieren und dreimal mit 1 ml PBS waschen.

Wickeln Sie die Platte in Folie ein und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius, bis die Bildgebung abgeschlossen ist. Diese Methode zeigt eine hocheffiziente Umwandlung von MEFs in Kardiomyozyten. Eine repräsentative durchflusszytometrische Analyse, die am neunten Tag nach der Transduktion durchgeführt wurde, zeigt eine aktivierte kardiale Troponin-T-Expression in etwa 70% der Zellen.

In ähnlicher Weise wird die kardiale Alpha-Actinin-Expression in etwa 55% der Zellen im Vergleich zur GFP-Transduktionskontrolle beobachtet. Darüber hinaus zeigt die Immunfärbung für kardiale Marker, die zwei Wochen nach der Transduktion durchgeführt wurde, dass die Mehrheit der Zellen Troponin I, Alpha-Actinin und Troponin T exprimiert.Das Gap-Junction-Protein Cx43 wurde ebenfalls entlang der Peripherie der ICMs nachgewiesen. Darüber hinaus zeigt die Co-Markierung von ICMs mit Alpha-Actinin oder Troponin T und Cx43 die Bildung von Gap Junctions zwischen benachbarten Zellen.

Die GHMT2M-Transduktion und die Behandlung mit A83O1 programmieren einen Teil der MEFs bis zum achten Tag in schlagende Zellen um. Am Tag 11 werden etwa 10000 schlagende Zellen pro Quadratzentimeter beobachtet. Spontane Calciumtransienten werden in schlagenden Kardiomyozyten nachgewiesen.

Die Zugabe des beta-adrenergen Agonisten Isoproterenol erhöht die Häufigkeit spontaner Calciumtransienten signifikant. Im Gegensatz dazu verringert die Aufruhr des L-Typ-Kalziumkanalblockers Nifedipin die Häufigkeit von Kalziumtransienten signifikant. Nach dem Anschauen dieses Videos sollte man ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Fibroblasten in funktionelle, induzierte Kardiomyozyten mit hoher Effizienz umprogrammiert.

Nach diesem Protokoll können andere Methoden, einschließlich RNA-Sequenzierung und Chip-Sequenzierung, verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. die globale Genexpression und der Chromatinstatus, die während der kardialen Reprogrammierung verändert werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Retroviren gefährlich sein kann. Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Arbeiten in einem Schrank der Biosicherheitsstufe zwei, das Tragen persönlicher Schutzausrüstung und die ordnungsgemäße Entsorgung aller retroviralen Abfälle, sollten bei der Durchführung dieses Protokolls immer getroffen werden.