Name: Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten zu funktionellen Kardiomyozyten durch Transkriptionsfaktoren und microRNAs. Diese Methode erreicht bis zu 60% Effizienz und ermöglicht schlagende Zellen bereits nach sieben Tagen.

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Diese Forschung wurde mit Mitteln der Boettcher Stiftung Webb Waring Biomedical Research Program, American Heart Association Wissenschaftler Development Grant (13SDG17400031), Universität von Kolorado Abteilung von Medizin herausragende Karriere unterstützt. Scholar Program, University of Colorado Division of Cardiology Barlow Nyle Endowment und NIH R01HL133230 (zu K.S). A.S.R wurde von NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Nummer TL1TR001081 und Pre-Promotionsstipendium von der University of Colorado-Konsortium für Forschung der Fibrose und Übersetzung (CFReT) unterstützt. Diese Forschung wurde auch von der Cancer Center Support Grant (P30CA046934), die Haut Krankheiten Kerne Forschungsstipendium (P30AR057212) und der Flow Cytometry Kern an der University of Colorado Anschutz Medical Campus unterstützt.

Alle Experimente erfordern Tiere wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee an der UC Denver Anschutz Medical Campus genehmigt.
1. Isolierung der MEFs
<ol><li>Kaufen Sie Schwangere Mäusen C57BL/6 in E13. Schiff über Nacht.</li>
	<li>Einschläfern die Mutter nach genehmigten IACUC Protokolle (ex: ~1.3 L/min CO2 bis Tier tot erscheint gefolgt von zervikale Dislokation)</li>
	<li>Sprühen Sie die Mutter mit 70 % Ethanol und öffnen Sie Bauchhöhle zu. Entfernen der Gebärmutter Horns mit Embryonen und in einer 10 cm Petrischale mit sterilem PBS.</li>
	<li>Machen Sie einen Schnitt in der Embryo-Sac freizugebende Embryo. Übertragen Sie Embryo um 10 cm Teller mit sterilen PBS zu reinigen. Gründlich ausspülen.</li>
	<li>Schneiden Sie den Körper unterhalb der Leber und entsorgen Sie den Kopf und Oberkörper. Inneren Organe entfernen und entsorgen. Das restliche Gewebe auf eine saubere 10 cm Teller mit sterilen PBS übertragen und die Platte auf einer Biosafety Level 1 oder 2 Schrank übertragen. Gewebe aus allen Embryonen in einem sauberen, trockenen 10 cm Teller zu kombinieren und in feine Stücke hacken.</li>
	<li>Hackfleisch / Embryonen 6 mL von 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA hinzufügen. Genannte mehrmals mit Pipette Gewebe aufzubrechen. 40 min bei 37 ° c mit 5 % CO2inkubieren.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen im Wachstumsmedium (Tabelle 1). Die Lautstärke der Medien ist abhängig von der Anzahl der Embryonen geerntet eingestellt. Verwenden Sie in der Regel ein Verhältnis von etwa 25 mL Wachstumsmedien pro 1,2 Embryonen.</li>
	<li>Platte 25 mL resuspendierte Zellen in einer Petrischale 15 cm. Aspirieren Sie nach 24 h die Medien und 25 mL frische Wachstumsmedium auf jede Platte.</li>
	<li>Fügen Sie nach 72 h 2 mL von 0,25 % Trypsin/1 mM EDTA zu jeweils 15 cm Schüssel hinzu. Wenn Zellen aus der Kulturschale Loslösen, Trypsin mit 15 mL Wachstumsmedium zu inaktivieren und Zellen in 50 mL Polystyrol konischen Rohren zu sammeln. Zentrifugieren Sie Zellen für 3 min bei 160 X g bei Raumtemperatur. Die Zelle Pellet im Wachstumsmedium und Filter durch ein 70 µm Pore Zelle Sieb aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und MEFs in 2 Millionen Zellen Aliquote Einfrieren Medium Einfrieren (10 % DMSO, 25 % FBS in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) / hohe Glukose) bei-80 ° C. Übertragen Sie Zellen in flüssigem Stickstoff nach 24 h und Store erst unmittelbar vor Gebrauch. Hinweis: Globale Genexpression in MEFs wurde profiliert durch RNA-Sequenzierung isoliert unter Verwendung dieses Protokolls (RNA-Seq) Zelle Authentifizierung sicherzustellen. RNA-Seq Daten aus KODIEREN MEF-Zellen wurden mit Zbl-Nummer GSE93454 vom NIH Gene Expression Omnibus (GEO) heruntergeladen. RNA-Seq Genexpressionsdaten für die von uns verwendeten MEFs wurden im NIH GEO Zbl-Nummer GSE71405 hinterlegt. Diese zwei Datensätze wurden nach gemeinsamen gen Symbole zusammengeführt. Der Ausdruck Daten wurden dann Log-transformiert und ein Streudiagramm der Ausdruck Daten für unsere MEFs und ENCODE MEFs wurden generiert und fit mit einem linearen Regressionsgeraden (Abbildung 1A). MEFs isoliert unter Verwendung dieses Protokolls sind Molekular ähnlich isoliert von anderen Labors.</li>
</ol>2. Herstellung von Retrovirus und Transduktion von MEFs
Hinweis: Alle Schritte in diesem Abschnitt müssen in einem Biosafety Level 2 Schrank durchgeführt werden. Da dieses Protokoll retrovirale Transduktion nutzt, dafür sorgen Sie, dass die Sicherheit, die Vorkehrungen getroffen werden, einschließlich der Behandlung alle mit viralen Medien mit 10 % Bleichmittel für mindestens 20 min. siehe Abbildung 1 b für eine Zeitleiste Abfälle für die Umprogrammierung.
<ol><li>
Produktion von Retrovirus mit Platin E (PE)-Zell-Linie
	<ol>
<li>Halten handelsübliche PE-Zellen in PE Medium (Tabelle 1) enthaltenden Blasticidin und Puromycin Selektionsmarker darauf Ausdruck der gag-Pol und Env -Gene für effiziente retrovirale partikelherstellung36 . Durchgang Zellen auf 1:4 oder 1:5 alle zwei Tage. Achten Sie darauf, um zu verhindern, Überbelegung der Zellen, wie dies retrovirale Produktion Erträge reduzieren kann.</li>
		<li>Am Tag-1 Samen ca. 5 x 106 Zellen pro 10 cm Teller in das Wachstumsmedium (Tabelle 1) 16-20 h vor Transfektion (siehe Tabelle 2 für Galvanik dichten für andere Standardzelle Kultur Schale Größen). Mehrere Male hin und her schütteln es Gerichte und legen Sie vorsichtig in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator, gleichmäßige Verteilung der Beschichtung zu gewährleisten (siehe Abbildung 1 für optimale Beschichtung Dichte vor Transfektion). Hinweis: darauf achten Sie, auf Platte PE Zellen in das Medium frei von Selektionsmarker vor Transfektion um sicherzustellen, dass die generierten retroviralen Partikel-haltigem Medium MEFs nicht tötet.</li>
		<li>Am Tag 0 Vorbereitung DNA zur Transfektion. Für 10 cm Schale Transfection hinzufügen 2 µg von jeder Neuprogrammierung Faktor – GATA4, Hand2, Mef2c und Tbx5, MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) — zu einer 1,5 mL-Tube. Hinweis: Siehe Tabelle 2 , die Menge von DNA benötigt, um andere Standardzelle Kultur Schale Größen transfizieren zu skalieren.</li>
		<li>Fügen Sie in einer separaten 1,5 mL Tube 360 µL reduzierte Serum Medien hinzu. Fügen Sie 36 µL Transfection Reagens direkt reduzierte Serum-Medien. Sanft streichen der Röhre und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Zur Vermeidung von reduzierten Transfection Leistungsfähigkeit fügen Sie sorgfältig Transfection Reagens direkt an die reduzierte Serum-Medien hinzu.</li>
		<li>GHMT2m DNA cocktail reduzierte Serum Medien/Transfection Reagens Mischung hinzufügen. Sanft streichen Sie das Rohr und bei Raumtemperatur 15 min inkubieren. Tun Sie nicht Wirbel.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch tropfenweise hinzufügen PE Zellen sanft Medien für 10-15 s Wirbel und legen Sie in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator. Hinweis: Laut Hersteller PE Zellen erzeugen eine durchschnittliche Titer von 106 bis 107 infektiösen Einheiten/mL. Dieses Protokoll generiert etwa 2 x 106 Infektionen Einheiten/mL von 24 h und 6 x 106 Infektionen Einheiten/mL nach 48 h bei einer durchschnittlichen MOI von 4. Transfektion von GFP/DsRed kann auch als Ersatz für die Transfektion/Transduktion Effizienz bei Bedarf verwendet werden; Transfektion Effizienz wird voraussichtlich 90 % von 48 h (Abbildung 1) nicht überschreiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transduktion von MEFs
	<ol>
<li>Am Tag 0 Mantel Gerichte mit Kollagen und in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator für mindestens 2 h.</li>
		<li>Entfernen Sie MEFs aus flüssigem Stickstoff und Tauwetter. Platte 0,2 x 106 Zellen pro 60 mm Schale in das Wachstumsmedium. Sanft Rock-Platten zu gewährleisten gleichmäßige Beschichtung und in den Inkubator zu platzieren (siehe Abbildung 1 für optimale Beschichtung Dichte und Tabelle 2 für Galvanik dichten für andere Standardzelle Kultur Schale Größen). Hinweis: Diese Beschichtung dichten wurden über mehrere Batches von isolierten MEFs getestet; es sei denn, MEFs-Display deutlich Lebensfähigkeit gefährdet, ist es nicht notwendig, Anpassung der Zelle Dichte Aussaat.</li>
		<li>Am Tag 1, 24 h nach Transfektion, verwenden Sie eine 30 mL Spritze retrovirale Medium erzeugt durch PE-Zellen zu sammeln. Übergeben Sie das Medium durch einen 0,45 µm Porengröße Filter in ein 50 mL konische Röhrchen. Hinzu kommt eine Endkonzentration von 6 µg/mL Hexadimethrine Bromid Transfection Reagens. Fügen Sie 10 mL frisches Wachstumsmedium sorgfältig PE Zellen durch pipettieren Medien an die Wand der Kulturschale, Verschiebung der Zellen zu verhindern hinzu.</li>
		<li>Aspirieren Sie das Medium aus MEFs und jedes Gericht fügen Sie 4 mL frisch geernteten retrovirale Medium hinzu. Der Inkubator MEFs zurückzukehren. Fügen Sie 10 % Bleichmittel auf alle Materialien virale mediumberührte retroviralen Partikel zu neutralisieren.</li>
		<li>Am Tag 2, 48 h nach Transfektion, wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 und 2.2.3. PE-Zellen werden nach der 2Nd -Sammlung des Mediums retrovirale verworfen. Hinweis: Fügen Sie 10 % Bleichmittel auf abgelegten PE-Zellen für mindestens 20 Minuten, unerwünschte Retrovirus zu neutralisieren.</li>
		<li>Am 3. Tag, Aspirieren Medium aus MEFs und Auffüllen mit 4 mL iCM (Tabelle 1)-haltigem Medium 0,5 µM A-83-01, TGF-β Typ I Rezeptor-Inhibitor. ICM-Medium mit A-83-01 alle 2 Tage zu ergänzen. Hinweis: Wenn GFP als Transduktion Steuerelement verwenden, wird der Ausdruck voraussichtlich mehr als 90 % bis zu diesem Zeitpunkt (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Durchflusszytometrie für Kardiale Marker
<ol><li>Aspirat Medium von Tag 9 umprogrammiert MEFs und waschen (1 X) mit 1 X PBS, abgestorbene Zellen und Schmutz zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 0,25 % Trypsin/EDTA für 5 min bei 37 ° c. Überprüfen Sie Zellen mit einem Lichtmikroskop und schütteln Sie Gericht; Wenn Zellen nicht wegziehen, inkubieren Sie 5 weitere Minuten bei 37 ° c bis Zellen lösen.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen mit 1 X PBS-Puffer mit 5 % FBS und Filter durch ein 70 µm Pore Zelle Sieb.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 160 X g für 3 min bei Raumtemperatur und aspirat Flüssigkeit aus dem Pellet. Hinweis: Um die Zellausbeute zu erhöhen, lassen Sie etwa 50 µL Flüssigkeit über die Zelle Pellet.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen mit 500 µL 1 X PBS mit 1 % BSA.</li>
	<li>Fix-Zellen mit 0,2 mL/1 Million Zellen Fixierung Lösung für 20 min auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 1 X eiskalten Perm/Waschpuffer. Hinweis: Der Hersteller Lösung ist 10 X.</li>
	<li>Zellen bei 160 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert und Aspirieren überstand.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.7 und 3.8 eine zusätzliche Zeit. Nach der Wäsche 2Nd direkt zum nächsten Schritt gehen oder Zellen bei 4 ° C über Nacht halten.</li>
	<li>Block mit 100 µL 5 % ziegenserum und Esel Serum 1 x Perm/Waschpuffer für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>100 µL verdünnter Primärantikörper hinzufügen. Hinweis: Für dieses Protokoll Zellen wurden mit Maus Troponin T (1: 200) und Maus α-Actinin (1: 200) zu quantifizieren, den Prozentsatz der Zellen positiv für die wichtigsten Komponenten der kardialen sarkomers. Inkubieren Sie Primärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Zellen bei 160 X g für 5 m bei 4 ° C zentrifugiert, Aspirieren überstand und 2 X mit eiskalten Perm/Waschpuffer waschen.</li>
	<li>100 µL verdünnter Sekundärantikörper hinzufügen. Hinweis: Für dieses Protokoll wurden Zellen mit Anti-Maus 647 nm Sekundärantikörper (1: 200) beschriftet. Inkubieren Sie Sekundärantikörper für 45 min bei Raumtemperatur auf eine durchgängige über Rohr-Rotator. Schützen Sie Zellen durch das Röhrchen in Folie einwickeln vor Licht.</li>
	<li>Zellen bei 160 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, Aspirieren überstand und 2 X mit eiskalten Perm/Waschpuffer waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 1 % BSA mit PBS-Puffer und durchführen Sie FACS sofort. Hinweis: Erstellen Sie ein forward Scatter Vs Seite Streudiagramm zu lebensfähige Zellen zuerst Tor bei der Durchführung von FACS. Alternativ können Sie einen handelsüblichen lebenden/Toten Zelle Fleck vor der Befestigung Zellen identifizieren Leben und tot Zell-Populationen.</li>
</ol>4. Immunostaining umprogrammierten MEFs
<ol><li>Aspirat Medium ab Tag 14 umprogrammiert MEFs und waschen (1 X) mit 1 mL 1 x eiskaltem PBS. Hinweis: Für Immunostaining, Umprogrammierung in 12-well-Platten, Antikörper-Lösung Bände zu minimieren erfolgte. 24-well-Platten können auch verwendet werden; einfach halb alle folgenden Bände.</li>
	<li>Aspirieren Sie und Zellen mit 500 µL 2 % Paraformaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspirieren Sie und waschen Sie Zellen 3 Mal mit 1 mL 1 X PBS (5 min pro Waschgang bei Raumtemperatur).</li>
	<li>Permeabilize Zellen mit 500 µL 0,2 % Permeabilisierung Reagenz mit PBS-Puffer für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspirieren und in 500 µL 10 % Pferd Serum mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur zu blockieren.</li>
	<li>Abzusaugen und mit 500 µL verdünnter Primärantikörper für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Für dieses Protokoll wurden Zellen mit Maus Troponin T oder α-Actinin (jeweils 1: 400) beschriftet und Co beschriftet mit Connexin 43 (1: 400) oder Troponin ich (1: 400).</li>
	<li>Aspirieren Sie Primärantikörper und waschen Sie dreimal mit 1 mL 1 X PBS (5 min pro Waschgang bei Raumtemperatur).</li>
	<li>Abzusaugen und mit 500 µL verdünnter Sekundärantikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Für dieses Protokoll Zellen wurden beschriftet mit Anti-Maus 555 nm Sekundärantikörper (1:800), Troponin T oder α-Actinin erkennen und Anti-Kaninchen 488 nm Sekundärantikörper (1:800), Connexin 43 oder Troponin I. zusätzlich zu erkennen, Kerne waren voller Flecken mit Hoechst (01:10, 000). Schützen Sie Zellen durch Inkubation im Dunkeln vor Licht.</li>
	<li>Aspirieren Sie der Sekundärantikörper und waschen Sie dreimal mit 1 mL 1 X PBS (5 min pro Waschgang bei Raumtemperatur). Wickeln Sie die Platte in Folie Zellen vor Licht schützen und speichern bei 4 ° c</li>
	<li>Bild mit 3-Kanal Epifluoreszenz mikroskopie.</li>
</ol>(5) Calcium Imaging
Hinweis: Wenn bei 10facher Vergrößerung imaging, eignen sich Standardzelle Kultur Schalen und Platten für Kalzium Imaging. Bildgebung bei höherer Vergrößerung erfordert, dass die Zellen auf Glasdeckgläser oder Glasschalen unten beschichtet werden.
<ol><li>Aspirieren Medium und fügen Sie 2 mL (für eine 6 gut Tafel) modifiziert Tyrode Lösung (140 mM NaCl, KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM 1 mM MgCl2, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 0,1 % BSA und 1 % Pyruvat, pH 7.4) mit 5 µM Fura-2 bin und 0,1 % Pluronic F-127 zu schlagen (D14 t o D20) iCMs. 30 Minuten bei 37 ° c inkubieren Hinweis: Schützen Sie Zellen vor Licht, um zu verhindern, dass abschrecken der fluoreszierenden Indikator.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen in 2 mL Tyrode-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur zu de-Veresterung von Fura-2 Uhr.</li>
	<li>Bild mit spinning-Disk konfokalen Mikroskopie bei 340 nm und 380 nm mit Slidebook 5.5 Ca2 + imaging-Software. Führen Sie die Bildgebung bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Kalzium-Transienten errechnen sich aus dem Verhältnis der Fluoreszenzintensität bei 340 nm über die Fluoreszenzintensität bei 380 nm.</li>
	<li>Auf Wunsch behandeln iCMs mit 1 oder 2 µM Isoproterenol oder 10 µM Nifedipin Kalzium Handhabung nach imaging Grundlinie Kalzium Transienten zu manipulieren. Hinzu kommen Verbindungen lokal Zellen und Bild.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die vorliegende Studie beschreibt eine hocheffiziente Strategie zur Fibroblasten in funktionale iCMs über Lieferung von GHMT2m Umprogrammierung Faktoren kombiniert mit Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalwege direkt neu zu programmieren. Mit Durchflusszytometrie, immunofluorescent Bildgebung, Kalzium imaging und schlagen Zellzahlen, wir zeigen die meisten Zellen in diesem Protokoll erfolgreiche Reprogrammierung zu unterziehen und CM Abstammung Schicksal anzunehmen. Wir haben bereits gezeigt, dass der Zusatz von Anti-...

Ischämischer Herzkrankheit ist eine führende Ursache des Todes in den Vereinigten Staaten1. Ca. 800.000 Amerikaner Erfahrung eine erste oder wiederholte Myokardinfarkt (MI) pro Jahr1. Nach MI beeinträchtigen der Tod von Herzmuskelzellen (CMs) und kardialer Fibrose, hinterlegt von aktivierten kardialen Fibroblasten, Herz-Funktion2,3. Fortschreiten der Herzinsuffizienz nach MI ist weitgehend irreversibel durch die schlechte Regenerationsfähigkeit des Erwachsenen CMs4,5. Während die aktuellen klinischen Therapien Fortschreiten der Erkrankung zu verlangsamen und verringern Risiko für zukünftige kardiale Ereignisse6,7,8,9, umkehren keine Therapien Fortschreiten der Erkrankung aufgrund der Unfähigkeit CMs-Post-Infarkt-10zu regenerieren. Neuartiger Therapien zur Behandlung von Patienten nach MI. enttäuschend entstehen, klinische Studien liefern Stammzellen ins Herz nach MI so weit haben gezeigt, nicht schlüssig regenerative potenzielle11,12, 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18.
Die Generation der Menschen abgeleitet induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) von Fibroblasten durch Überexpression von vier Transkriptionsfaktoren, erstmals nachgewiesen von Takahashi & Yamanaka, öffnete die Tür zu neuen Durchbrüchen in Zelle Therapie19. Diese Zellen können in alle drei mikrobeschichten19, und mehrere hoch effiziente Methoden zur Generierung zahlreicher CMs haben bisher gezeigt,20,21. HiPSC abgeleitet CMs (Hüften-CMs) bietet eine leistungsstarke Plattform, um Cardiomyogenesis zu studieren und eventuell wichtige Implikationen für die Reparatur von Herzen nach Verletzung. Jedoch kann Hüften-CMs derzeit translationale Hürden aufgrund von Bedenken der Teratom Bildung22, und ihre unreife Natur Pro-Arrhythmogenic23. Reprogrammierung von Fibroblasten in HiPSCs löste Interesse an direkt Umprogrammierung Fibroblasten in andere Zelltypen. Ieda Et Al. zeigten, dass Überexpression des GATA4, Mef2c und Tbx5 (GMT) in Fibroblasten führt direkte Reprogrammierung zu kardialen Abstammung, wenn auch mit geringer Effizienz24. Umprogrammierung der Effizienz wurde mit dem Zusatz von Hand2 (GHMT)25verbessert. Seit diesen frühen Studien haben viele Publikationen gezeigt, dass Veränderung des Neuprogrammierung Faktor-Cocktails mit zusätzlichen Transkription26,27,28,29 Faktoren, Chromatin Modifikatoren30,31, Micro-RNAs32,33oder kleine Moleküle, die34 zu verbesserten führt Umprogrammierung Effizienz und/oder Reifung der induzierten Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen (iCMs ).
Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll um iCMs aus Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) mit hohem Wirkungsgrad zu erzeugen. Wir zeigte zuvor, dass die GHMT cocktail mit dem Zusatz von MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) deutlich verbessert wird und wird weiter verbessert, wenn Pro-fibrotische Signalwege einschließlich Umwandlung Wachstumsfaktor β (TGF-β) Signalisierung oder Rho-assoziierten Protein-Kinase (ROCK) Signalwege sind gehemmt35. Anhand dieses Protokolls zeigen wir, dass etwa 60 % der Zellen kardiale Troponin T (cTnT Express), ca. 50 % α-Actinin Express und eine hohe Anzahl von Schlägen Zellen so früh wie Tag 11 nach Transduktion beobachtet werden der Neuprogrammierung Faktoren und Behandlung mit der TGF-β Typ I Rezeptor Hemmer A-83-01. Darüber hinaus diese iCMs express Gap Junction Proteinen einschließlich Connexin 43 und spontane Kontraktion und Kalzium Transienten. Diese deutliche Verbesserung der Effizienz im Vergleich zu früheren Studien Umprogrammierung zeigt das Potenzial, CMs von endogenen Zellpopulationen zu regenerieren, die in der Post-Herzinfarkt bleiben.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 Mäuse</td> Charles <td>River's Laboratory</td><td>027</td><td>Für die MEF-Isolierung</td></tr><tr><td>Platinum E (PE) Zellen</td><td>Cell Biolabs, INC</td><td>RV-101</td><td>Für die Retrovirusproduktion</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Gibco</td><td>SH30022. FS</td><td>Komponente von iCM, PE und Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>Komponente von iCM media</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td>Bestandteil von iCM, PE und Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Spender Pferdeserum</td><td>Gemini</td><td>100508 500</td><td>Bestandteil von iCM media</td></tr><tr><td>MEM Essentielle Aminosäuren, 50X</td><td>Life Technologies</td><td>11130051</td><td>Bestandteil von iCM media</td></tr><tr><td>Natriumpyruvatlösung, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td>Bestandteil von iCM-Medien und für die Calciumbildgebung</td></tr><tr><td>MEM-nicht-essentielle Aminosäuren, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140050</td><td>Bestandteil von iCM media</td></tr><tr><td>MEM-Vitaminlösung, 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11120-052</td><td>Bestandteil von iCM-Medien</td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen</td><td>Gibco</td><td>41400045</td><td>Bestandteil von iCM-Medien</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Bestandteil von iCM-Medien</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Bestandteil von iCM, PE und Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-Glutamin-Ergänzung)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Bestandteil von iCM, PE und Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Blasticidin-HCl</td><td>Life Technologies</td><td>A11139-03</td><td>Bestandteil von PE-Medien</td></tr><tr><td>Puromycin-Dihydrochlorid</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-03</td><td>Bestandteil von PE-Medien</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Zum Ablösen von Zellen aus Kulturschalen</td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>R& D Systems - Tocris</td><td>2939/10</td><td>Behandelt Zellen zur Hemmung der TGF-&beta-Signalübertragung - fördert eine hocheffiziente Reprogrammierung. Verwendung bei 0,5 &Mikro; M</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>85190</td><td>Zur Verdünnung und Lagerung von A-83-01 und der Komponente des Gefriermediums</td></tr><tr><td>SureCoat</td><td>Cellutron</td><td>SC-9035</td><td>Zum Beschichten von Schalen auf Platten MEFs</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfektionsreagenz</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Media</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-GATA4</td><td></td><td></td><td>Plasmid mit Reprogrammierungsfaktor</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Hand2</td><td></td><td></td><td>Plasmid mit Reprogrammierungsfaktor</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Mef2c</td><td></td><td></td><td>Plasmid mit Reprogrammierungsfaktor</td></tr><tr><td>pBabe-X Myc-Tbx5</td><td></td><td></td><td>Plasmid mit Reprogrammierungsfaktor</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-1</td><td></td><td></td><td>Plasmid mit Reprogrammierungsfaktor</td></tr><tr><td>pBabe-X miR-133</td><td></td><td></td><td>Plasmid mit Reprogrammierungsfaktor</td></tr><tr><td>pBabe-X GFP</td><td></td><td></td><td>Plasmid mit Reprogrammierungsfaktor</td></tr><tr><td>Polybrene (Hexadimethrinbromid)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td>Zur viralen Induktion. In einer Konzentration von 6 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Vakuumfilter + Flaschen (0,22 &Mikro; m Poren)</td><td>Nalgene</td><td>&nbsp; 569-0020&nbsp;</td><td>Zum Filtern von Medien</td></tr><tr><td>Spritzen</td><td>bd Vacutainer Laborbedarf&nbsp;</td><td>309654</td><td>Für die Virenfiltration</td></tr><tr><td>0,45 &Mikro; m Filter</td><td>Celltreat</td><td>229749</td><td>Für die Virenfiltration</td></tr><tr><td>70 & Mikro; M-Zell-Siebe</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>352350</td><td>Für die MEF-Isolierung und Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm-Lösung</td><td>BD</td><td>554722</td><td>Für die Fixierung und Permeabilisierung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Perm/Wash Buffer&nbsp;</td><td>BD</td><td>554723</td><td>Zum Waschen von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td>Zum Waschen</td></tr><tr><td>von Zellen Rinderserumalbumin</td><td>VWR</td><td>0332-100g</td><td>Für die Durchflusszytometrie und Calciumbildgebung</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G9023</td><td>Zur Blockierung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Sigma</td><td>D9663-10mg</td><td>Zur Blockierung von Zellen für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Maus Troponin T</td><td>Thermo Scientific</td><td>ms-295-p</td><td>1:400 IF, 1:200 Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Maus &alpha;-Actinin</td><td>Sigma</td><td>A7811L</td><td>1:400 IF, 1:200 Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Kaninchen Connexin 43</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6219</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Kaninchen Troponin I</td><td>PhosphoSolutions</td><td>2010-TNI</td><td>1:400 IF</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>62249</td><td>1:10000 IF</td></tr><tr><td>Alexa 488, Kaninchen</td><td>Life Technologies</td><td>A-11034</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 555, Maus</td><td>Life Technologies</td><td>A-21422</td><td>1:800 IF</td></tr><tr><td>Alexa 647, Maus</td><td>Life Technologies</td><td>A-31571</td><td>1:200 Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>27-Farben ZE5 Durchflusszytometer&nbsp;</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>Für FACS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>sigma</td><td>P6148-500mg</td><td>Zur Fixierung von Zellen für IF</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td>Für die Permeabilisierung von Zellen für IF</td></tr><tr><td>EVOS&trade; FL Color Imaging System</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEFC4300</td><td>Für IF</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020-5000</td><td>Für Calcium-Imaging</td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>395</td><td>Für Calcium-Imaging</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C614-500</td><td>Für Calcium-Imaging</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>VWR</td><td>97061-352</td><td>Für Calcium-Imaging</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>sigma</td><td>G7528-250g</td><td>Für die Kalziumbildgebung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>sigma</td><td>H4034-500g</td><td>Für die Kalziumbildgebung</td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Für die Kalziumbildgebung</td></tr><tr><td>Fluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250g</td><td>Für die Kalziumbildgebung</td></tr><tr><td>Nifedipin</td><td>Sigma</td><td>N7634-1G</td><td>Für die Störung von Kalziumtransienten in iCMs - Verwendung bei 10 & Mikro; M</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>sigma</td><td>I6504-1g</td><td>Zur Erhöhung der Anzahl von Calciumtransienten in iCMs - Verwendung bei 1-2 & Mikro; M</td></tr><tr><td>Marianas Spinning Disk Konfokales Mikroskop</td><td>3i</td><td></td><td>Für Calcium-Imaging</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2801</td><td></td></tr><tr><td>Bleiche</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Röhrchen</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr> 227261 <tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td></td><td></td></tr> 188271 <tr><td>15 cm Zellkulturschalen</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>10 cm Zellkulturschalen</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Zellkulturschalen</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatten</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>657160&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Zellkulturplatten</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>665180&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Zellkulturplatten</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>662160&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

unterdrückung der pro-fibrotische signalisierung potenziert faktor-vermittelten reprogrammierung von maus embryonalen fibroblasten in induzierte kardiomyozyten

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Trans-Differenzierung des Typs einer somatischen Zelle in eine andere hat ein enormes Potenzial zur Modellierung und menschliche Krankheiten zu behandeln. Frühere Studien haben gezeigt, dass Maus embryonalen, dermale und kardialen Fibroblasten können in funktionale induziert-Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen (iCMs) umprogrammiert werden durch Überexpression von kardiogener Transkriptionsfaktoren einschließlich Hand2, GATA4, Mef2c, und Tbx5 in Vitro und in Vivo. Diese früheren Studien haben jedoch relativ geringen Effizienz gezeigt. Um Herz-Funktion nach Verletzung wieder herzustellen, müssen Mechanismen für kardiale Umprogrammierung zur Steigerung von Effizienz und Reifung der iCMs aufgeklärt werden.
Wir zuvor nachweislich Hemmung der Pro-fibrotische Signalisierung dramatisch Neuprogrammierung Effizienzsteigerungen. Hier zeigen wir Methoden, einen Neuprogrammierung Wirkungsgrad von bis zu 60 % zu erreichen. Darüber hinaus beschreiben wir verschiedene Methoden einschließlich Durchflusszytometrie, immunofluorescent Bildgebung und Kalzium Imaging, Neuprogrammierung Effizienz und Reifung der umprogrammierten Fibroblasten zu quantifizieren. Hier das ausführliche Protokoll verwenden, können mechanistische Studien zur positive und negative Regulatoren der kardialen Umprogrammierung bestimmen durchgeführt werden. Diese Studien können Signalwege zu identifizieren, die angegriffen werden kann, zur Förderung der Neuprogrammierung Effizienz und Reifung, die zu neuartiger Zelltherapien zu menschlichen Herzerkrankungen führen könnten.

Mit der Neuprogrammierung Afrikastrategie oberhalb und in Abbildung 1 b, erzielten wir iCMs mit rund 70 % der Zellen mit dem Ausdruck kardiale Troponin T und rund 55 % der Zellen mit dem Ausdruck kardiale α-Actinin, durch Durchflusszytometrie am 9. Tag quantifiziert Anschluss an Transduktion von GHMT2m (Abb. 2A und B). Darüber hinaus die Mehrzahl der Zellen express kardiale Troponin T, Troponin I, und kardiale α-...

Hier präsentieren wir eine robuste Methode zur primären embryonale Fibroblasten in funktionellen Herzmuskelzellen durch Überexpression des GATA4, Hand2, Mef2c und Tbx5, MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) neben Hemmung der TGF-β-Signal neu zu programmieren. Unser Protokoll generiert schlagende Herzzellen bereits 7 Tage nach Transduktion mit bis zu 60 % Wirkungsgrad.

Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der kardialen Reprogrammierung zu beantworten, z. B. um zu identifizieren, welche Signalwege die Kardiomyogenese fördern oder reparieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir funktionell induzierte Kardiomyozyten erzeugen können, die effizienter sind als bisher veröffentlichte Methoden. Diese chemische Herzkrankheit führt zum Verlust von Kardiomyozyten und einer Beeinträchtigung der Herzfunktion.Daher kann diese Technik zu einer hohen Reparatur beitragen, indem sie Fibroblasten in funktionell induzierte Kardiomyozyten umwandelt. Um mit der Produktion von Retroviren zu beginnen, züchten Sie Platin-E- oder PE-Zellen in PE-Medium. Ergänzen Sie es mit Auswahlmarkern in einer 10-cm-Schale in einem Schrank der Biosicherheitsstufe zwei.Alle zwei Tage passieren die Zellen bei einer bis vier oder einer bis fünften Dilusion. Einen Tag vor der geplanten Transfektion säen Sie PE-Zellen in 10 ml Wachstumsmedium in einer 10-cm-Kulturschale aus und schaukeln Sie die Schalen dann vorsichtig hin und her. Stellen Sie die Schalen vorsichtig in einen Inkubator, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu ermöglichen, un

suppression-pro-fibrotic-signaling-potentiates-factor-mediated

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben die Verwendung einer Maus ES-Zell-basierte Assays, um kritische Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal Aktivierung während kardiogenen Induktion zu identifizieren. Die Methode bietet eine standardisierte Plattform, die zuverlässig quantifiziert kardiogenen Effizienz, und es ist für das Studium der anderen Zelllinien.

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Erzeugung von iCMs unter Verwendung der Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Tbx5 und Mef2c in einem polycistronischen Konstrukt. Dieses Protokoll liefert eine relativ homogene Population von reprogrammierten Zellen mit verbesserter Effizienz und Qualität und ist wertvoll für zukünftige Studien zur iCM-Reprogrammierung.

Verbesserte Generierung induzierter Kardiomyozyten Mit einem Polycistronische Construct Ausdruck optimale Verhältnis von Gata4, Mef2c und Tbx5

Hier ist eine Methode zur Visualisierung der extrazellulären Matrix-Ultrastruktur in dezellularisiertem Herzgewebe dargestellt.

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Induktion eines hämogenen Programms in embryonalen Fibroblasten der Maus durch Überexpression eines minimalen Satzes von Transkriptionsfaktoren. Diese Technologie kann auf das menschliche System übertragen werden, um Plattformen für zukünftige Studien zur Hämatopoese, zu hämatologischen Erkrankungen und hämatopoetischen Stammzelltransplantationen bereitzustellen.

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.

Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

In diesem Protokoll zeigen wir und erläutern, wie man humaninduzierte pluripotente Stammzellen zur Kardiomyozytendifferenzierung und -reinigung verwendet und weiter, wie die Transplantationseffizienz mit dem Rho-assoziierten Proteinkinase-Inhibitor verbessert werden kann. Vorbehandlung in einem Maus-Myokardinfarktmodell.

Verbesserung der Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten über eine transiente Hemmung der Rho Kinase Aktivität

Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den...

In-vitro-Beurteilung der kardialen Reprogrammierung durch Messung des kardialspezifischen Calciumflusses mit einem GCaMP3-Reporter

Hier beschreiben wir ein Verfahren, das auf der Verwendung von lentiviralen Partikeln zur langfristigen genetischen Modifikation von neuralen Stammzellen und/oder ihren benachbarten ependymalen Zellen in der adulten ventrikulär-subventrikulären neurogenen Nische basiert und die getrennte Analyse von zellautonomen und nicht-autonomen, nischenabhängigen Effekten auf neurale Stammzellen ermöglicht.

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Erfahren Sie die effiziente Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten zu funktionellen Kardiomyozyten durch Transkriptionsfaktoren und microRNAs. Diese Methode erreicht bis zu 60% Effizienz und ermöglicht schlagende Zellen bereits nach sieben Tagen.

Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten (Video) | JoVE Journal

Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten

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