Generation der ersten Herz Bereich-wie kardiale Stammväter und ventrikuläre wie Herzzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Der Hauptvorteil dieser einfachen Technik besteht darin, kardiale Vorläuferzellen und Kardiomyozyten mit definierter Herkunft und Subtypen des Herzfeldes zu erzeugen. Im Gegenzug können die daraus resultierenden Zellen für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen verwendet werden, einschließlich grundlegender Entwicklungsbiologie, Proof-of-Concept-zellbasierter Therapie und Modellierungsstudien für Herzerkrankungen. Das Verfahren wird von Sean Spiering und Michael Yu aus meinem Labor vorgeführt.

Beschichten Sie zunächst genügend Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern Beschichtungsreagenz, um die nachfolgenden Schritte der Zellaussaat und der Virusinfektion aufzunehmen, und fügen Sie dann einen Milliliter Dissoziationsreagenz in eine Vertiefung in der Sechs-Well-Platte hinzu, um die ausgesäten pluripotenten Stammzellen zu lösen. Verwenden Sie dann eine sterile Pipette, um die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff zu übertragen. Geben Sie in das Röhrchen fünf Milliliter PBS, das Kalzium und Magnesium enthält, um das Dissoziationsreagenz zu neutralisieren.

Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal g für drei Minuten. Entsorgen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und schnippen Sie dann vorsichtig mit dem Rohr, damit sich das Pellet lösen kann. Lösen Sie dann das Zellpellet in einem Milliliter Stammzellmedium auf.

Verwenden Sie als Nächstes einen automatisierten Zellzähler, um die Anzahl der Zellen zu zählen. Sobald die Zählung abgeschlossen ist, säen Sie 20.000 lebensfähige Zellen in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte aus, die 50 Mikroliter Stammzellmedium enthält, ergänzt mit einem zweimikromolaren RHO/ROCK-Signalweg-Inhibitor. Überwachen Sie nach 24 Stunden die Zellanhaftung und ersetzen Sie das Medium eine Stunde vor der lentiviralen Infektion durch 100 Mikroliter Stammzellmedium.

Als nächstes tauen Sie das Id1-Lentivirus auf Eis auf und fügen Sie dann drei Mikroliter gereinigtes Lentivirus pro Vertiefung hinzu. Nach der Zugabe des Lentivirus wird die Platte mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius in den Zellkultur-Inkubator zurückgebracht. 24 Stunden nach der Virusinfektion fügen Sie den infizierten Zellen 100 Mikroliter frisches Stammzellmedium hinzu.

Ersetzen Sie nach 48 Stunden das virushaltige Medium durch 200 Mikroliter frisches Stammzellmedium, das mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin ergänzt wird. Wechseln Sie jeden Tag das Medium mit frischen 200 Mikrolitern Stammzellmedium, das mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin ergänzt wird. Beginnen Sie den Differenzierungsprozess an Tag 0, indem Sie das Stammzellmedium durch 1,5 Milliliter Induktionsmedium mit Activin A in einer 12-Well-Platte ersetzen.

24 Stunden nach Beginn der Differenzierung ersetzen Sie das Medium durch zwei Milliliter Induktionsmedium ohne Activin A.Am dritten Tag ersetzen Sie es durch zwei Milliliter Induktionsmedium ohne Activin A.Am fünften Tag aspirieren Sie das gesamte Medium aus der Vertiefung, die die FHF-L-CPs enthält, und fügen Sie dann sofort einen Milliliter warmes enzymhaltiges Dissoziationsreagenz in die Vertiefung hinzu. Dann inkubieren Sie die Kulturplatte bei 37 Grad Celsius. Schütteln Sie die Platte nach einer Minute im Inkubator und nehmen Sie sie nach zwei Minuten aus dem Inkubator, dann geben Sie einen Milliliter 10 % fötales Rinderserum-haltiges Medium in die Vertiefung. Lösen Sie die Zellen von der Platte, indem Sie die Zellen vorsichtig auf und ab pipettieren.

Übertragen Sie anschließend die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie. Lösen Sie das Zellpellet nach der Zentrifugation in zwei Millilitern Kryokonservierungsreagenz auf und zählen Sie dann die Zellzahl. Übertragen Sie dann die Zellen in die Kryokonservierungsfläschchen und lassen Sie die Fläschchen im Kühlgerät.

Transportieren Sie das Gerät dann über Nacht bei minus 80 Grad Celsius. Nach 24 Stunden die Fläschchen zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff umfüllen. Kurz vor dem Auftauen der FHF-L CPs beschichten Sie die Vertiefungen der 12-Well-Platte mit zwei Millilitern Beschichtungsreagenz.

Übertragen Sie anschließend die fünf Tage alten FHF-L CPs aus dem flüssigen Stickstoff in einen Trockeneisbehälter. Übertragen Sie das Fläschchen aus dem Trockeneis für zwei Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um ein vollständiges Auftauen zu gewährleisten. Nachdem die Zellen vollständig aufgetaut sind, übertragen Sie die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie dann alle 30 Sekunden 10 Tropfen vorgewärmtes kardiogenes Medium in die Zelllösung.

Fügen Sie das kardiogene Medium so lange hinzu, bis das Verhältnis von Kryokonservierung und kardiogenem Medium eins zu drei erreicht ist. Als nächstes werden die Zellen einer Zentrifugation unterzogen. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und schnippen Sie vorsichtig mit dem Röhrchen, dann lösen Sie das Zellpellet in kardiogenem Medium auf, das mit einem zweimikromolaren RHO/ROCk-Signalweg-Inhibitor ergänzt ist.

Verdünnen Sie die Zellsuspension weiter mit kardiogenem Medium, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen. Anschließend säen Sie die Zellen auf der Kulturplatte mit zwei Millilitern kardiogenem Medium aus. Lassen Sie die Platte 20 Minuten lang in der Gewebekulturhaube, bevor Sie sie in den Inkubator umfüllen.

Überwachen Sie die Zelladhäsion am sechsten Tag der Differenzierung. Am siebten Tag aspirieren Sie die Hälfte des kardiogenen Mediums und ersetzen es durch frisches Medium. Von hier an ersetzen Sie jeden zweiten Tag 50 % des kardiogenen Mediums und quantifizieren Sie dann am 15. Tag die kardiale Differenzierung.

Hier wird das Expressionsniveau von Id1 mRNA in den hESC- und hPSC-Zelllinien quantifiziert. Für die Differenzierung werden nur hPSC-Linien verwendet, die Id1-mRNA in Konzentrationen von mehr als dem 0,005-fachen GAPDH exprimieren. Hier sind Hellfeldbilder nach der Differenzierung von optimalen, subkonfluenten und überkonfluenten hPSCs an Tag 0 zu sehen.

Bei weiterer Differenzierung erreicht die Zellkonfluenz nach 24 Stunden 75%. An Tag 3 bilden die differenzierenden Zellen einen Cluster, und an Tag 5 verbleiben die Zellen in eng verbundenen Clustern mit homogener Morphologie. An Tag 6 bedecken die FHF-L-CPs mehr als 90 % der Oberfläche der Bohrlöcher.

Tatsächlich beginnen die Kardiomyozyten am 12. Tag zu schlagen und zeigen Herzkontraktionen. Im weiteren Verlauf des Differenzierungsprozesses kommt es nach Tag 15 zu erhöhten mRNA-Expressionsniveaus von MYL2 und IRX4. Beide Proteine stellen ventrikuläre spezifische Marker innerhalb der Kardiomyozyten dar.

Hier repräsentiert die Aktionspotentialkurve die schnellen Auf- und Abschlagsgeschwindigkeiten sowie das ventrikuläre Plateau. Diese Raten waren charakteristisch für ventrikuläre Kardiomyozyten am Tag 25 der Differenzierung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es etwa zwei Wochen dauert, um Id1-überexprimierende humane pluripotente Stammzellen zu erzeugen, dann dauert es etwa fünf Tage, um erste herzfeldähnliche Vorläuferzellen zu erzeugen, und etwa 10 Tage, um schlagende ventrikuläre Kardiomyozyten zu erzeugen.