Name: Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Mehrfarben-Lokalisierung einzelner Membranproteine in lebenden Säugetierzellen mit einer Präzision von etwa 18 nm. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen von Proteindynamiken in Organellen.

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Die Autoren möchten die Biophysik Gruppe und Jacob Piehler an der Universität Osnabrück für kontinuierliche Unterstützung, Wladislaw Kohl für technische Hilfe und Vorbereitung des Materials und der CellNanOs-Vorstand für die Bereitstellung von Mikroskopen für den Einsatz danken. Das Projekt wurde von der SFB 944 finanziert.

<ol><li>Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+organization+of+mitochondrial+microcompartments+revealed+by+combining+tracking+and+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy.</a> Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Tracking+and+Localization+of+Mitochondrial+Protein+Complexes+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells.</a> Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).</li>
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<li>Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biological+structures+with+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).</li>
<li>Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Probe+Photophysics+in+Localization-Based+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy.</a> Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).</li>
<li>Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific reports. , Available from: 
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<li>Pellett, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+STED+microscopy+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Two-color STED microscopy in living cells.</a> Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).</li>
<li>Ishigaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+super-resolution+imaging+of+mitochondria+labeled+with+TMRM+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells.</a> Mitochondrion. 28, 79(2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+multiple-target+tracing+to+probe+spatiotemporal+cartography+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes.</a> Nat Methods. 5 (8), (2008).</li>
<li>Appelhans, T., Busch, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+mitochondrial+membrane+proteins+in+specific+sub-organelle+membrane+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations.</a> Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).</li>
<li>Wilmes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-color+super-resolution+imaging+of+live+cells%3A+resolving+submicroscopic+receptor+organization+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane.</a> Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).</li>
<li>Niewidok, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+dynamic+biphasic+partition+of+RNA-binding+proteins+in+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules.</a> J Cell Biol. , (2018).</li>
<li>Wurm, C. A., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+distributions+define+two+sub-compartments+of+the+mitochondrial+inner+membrane+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast.</a> FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).</li>
<li>Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+cristae+revealed+with+focused+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial cristae revealed with focused light.</a> Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).</li>
<li>Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+that+mammalian+mitochondrial+nucleoids+have+a+uniform+size+and+frequently+contain+a+single+copy+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).</li>
<li>Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shuttling+of+PINK1+between+Mitochondrial+Microcompartments+Resolved+by+Triple-Color+Superresolution+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy.</a> ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).</li>
<li>Shim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Organelle+Shape+on+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).</li>
<li>Reits, E., Neefjes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).</li>
<li>Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+of+Membrane-Associated+Proteins%3A+Lateral+Diffusion+and+Membrane-Cytoplasmic+Exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange.</a> Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).</li>
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<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
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<li>Yamano, K., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+is+degraded+through+the+N-end+rule+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">PINK1 is degraded through the N-end rule pathway.</a> Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier wurde eine Technik für dual Farbe Einzelmolekül Lokalisierung von mobilen Membranproteine vorgestellt. Nach dem Protokoll Membranproteine sind verschmolzen, zur selbstbeschriftung Proteine, die mit Rhodamin Farbstoffe TMR und SiR konjugiert zu ihrer jeweiligen Substrate reagieren. Rhodamin Farbstoffe sind hell und Photostabil und damit für sich wiederholende bildgebenden1. Für eine erfolgreiche Leistung müssen mehrere Bedingungen und kritische Themen im Auge behalten werden.
<p class="jov...

Das Ziel dieses Protokolls ist, bieten ein bildgebendes Verfahren zu lokalisieren und einzelne Membranproteine in lebenden Zellen zu verfolgen. Wir nennen diese Methode Tracking und Localization Microscopy (Talmor)1,2. Talmor ist wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm)3 und Photoaktivierungen Lokalisierung Fluoreszenzmikroskopie ((F) PALM)4,5ein einzelnes Molekül-basierte Fluoreszenz Lokalisierung Technik. Es unterscheidet sich jedoch in der Weise, dass die Mobilität von Membranproteinen in Kombination mit sich wiederholenden Darstellung desselben Moleküls an verschiedenen Positionen zeigt die Microcompartment beschriftet, die zugänglich für das mobile Protein ist. Das heißt, werden die möglichen Lokalisierungen des Proteins von der Architektur der Organellen und durch die Mobilität der Protein-1festgelegt. Die Methode ist komplementär zu verschiedenen anderen Höchstauflösung Techniken6,7,8 , weil es zeigt, Lokalisierung und die Flugbahn Karten durch bildgebende mobile Proteine. Die Kennzeichnung basiert auf der Verwendung gentechnisch veränderter Fusionsproteine, die per se nicht fluoreszierenden sind. Diese Schmelzverfahren Proteine sind Enzyme selbstbeschriftung, die kovalent mit einem Substrat zu einem Farbstoff konjugiert zu reagieren. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass die Kennzeichnung Grad kann durch die Menge an zusätzlichen Substrat gesteuert. Darüber hinaus ermöglicht es die Farbe der Fluoreszenz, abhängig von der gewählten konjugierten Farbstoff variieren. Einige selbst Kennzeichnung Enzym-Tags sind verfügbar9. Ein weiterer Vorteil der Verwendung selbstbeschriftung Enzym-Tags ist, dass die konjugierte Farbstoffe sind in der Regel stabiler und heller als fluoreszierende Proteine1 und einzelne Proteine daher mehr aufgezeichnet werden können und vieles mehr, eben bis sie gebleicht werden. Dies ermöglicht die Aufnahme von Trajektorien von mobilen Proteinen und der Gewinnung von Diffusion Koeffizienten10,11.
Hier zeigen wir die Machbarkeit der Talmor mit mitochondrialen Membranproteine, aber es kann auch für andere Intra und extra zellulare Membranproteine, einschließlich andere Zelle Arten12,13angewendet werden. Wir zeigen, dass multi-Color Talmor weiter die gleichzeitige Unterscheidung von Proteinen in verschiedenen Subcompartments in Ergänzung zur bestehenden Höchstauflösung Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken14,15, ermöglicht 16. Talmor ist kompatibel mit live Cell imaging-17. Die Foto-Physik von der gewählten Rhodamine Tetramethylrhodamine (TMR) und Silikon-Rhodamien (SiR), insbesondere ihre Helligkeit und Stabilität, ermöglicht Rekord einzelne Membranproteine über mehrere Frames mit Lokalisierung (und die Flugbahn) Karten. Talmor ist jedoch für die Lokalisierung von löslichen Proteinen mit hohen Diffusionskoeffizienten beschränkt, da die Bewegungsunschärfe zu hoch ist und die gesammelten Photonen pro Frame zu niedrig für die korrekte Lokalisierung sind. Außerdem erfordert Talmor weniger erregerleistung als z.B. Sturm oder stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie6,7, phototoxische Effekte reduzieren. Dies ist wichtig, da phototoxische Stress oft Organellen Morphologie18 und damit Mobilität Analyse19beeinflusst. Zusammenfassend lässt sich sagen, wir präsentieren mehrfarbige Talmor in lebenden Zellen als eine Technik, die eine Lücke zwischen der Lokalisierung Mikroskopieverfahren Sturm/STED füllt / (F) PALM und Techniken, die Protein Mobilität wie Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz analysieren (FRAP)20 ,21, Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie (FCS)22und Fluoreszenz überqueren Korrelation Spektroskopie (FCC)11,23.

<table><tbody><tr><td>(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure, 1 M) (HEPES)</td><td>Biochrom</td><td>#1104E</td><td></td></tr><tr><td>DC1: Dicheroider Strahlteiler&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>640 dcxr</td><td>NC506031</td></tr><tr><td>DC2: Polychroitischer Spiegel, Strahlteiler</td><td>Chroma</td><td>zt405/488/561/640rpc</td><td>abgekündigt</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x (ohne Ca & Mg)</td><td>Sigma-Aldrich & Co. KG</td><td></td><td></td>#RNBF8311</tr><tr><td>Earle&acute; s MEM ohne Phenolrot, ohne L-Glutamin und ohne NaHCO3 mit 1% FBS, 0,1% HEPES, 0,1% NEAA, 0,1% Alanyl-L-Glutamin und 34,78% Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3 0,75g/l)</td><td></td><td></td><td>Bildgebendes Medium</td></tr><tr><td>Earle&acute; s minimales essentielles Medium (MEM) mit Phenolrot, enthält 1 % fötales Rinderserum Superior (FBS), 0,1 % HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure, 1 M) und 0,1 % nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)</td><td></td><td></td><td>Wachstumsmedium</td></tr><tr><td>EF: Emissionsfilter Quadbandpass</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F72-866</td><td>Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm</td></tr><tr><td>EMCCD-Kamera</td><td>Andor</td><td>Andor iXON 897</td><td>EMCCD-Kamera</td></tr><tr><td>Emissionsfilter QuadView Filterwürfel, orange</td><td>AHF analysentechnik</td><td>F39-637</td><td>Bandpass 582 - 619 nm</td></tr><tr><td>Emissionsfilter QuadView Filterwürfel, rot</td><td>Chroma</td><td></td><td>Bandpass 655 - 725 nm (HQ 690/70)</td></tr><tr><td>FBS (Fötales Rinderserum) superior</td><td>Biochrom</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierende Kügelchen: TetraSpeck&trade; Mikrosphären, 0,1 & Mikro; m, fluoreszierend blau/grün/orange/dunkelrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7279</td><td>fluoreszierende Mikrosphären</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Biochrom</td><td>#0951C HeLa-Zellen</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td>Zervixkarzinomzellen von Patientin Henrietta Lacks</td></tr><tr><td>Hela-Zellen CI::p aGFP, stabil</td><td>Muster et al., PLOSOne 2010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela-Zellen CV g::Halo7-Tag, stabil</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela-Zellen Tom20::Halo7-Tag, stabil</td><td>Appelhans et al., NanoLett 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bildsplitter</td><td>Photometrics</td><td>Dual-View QV2</td><td>Bildsplitter-Emission</td></tr><tr><td>Software für die Bildverarbeitung&nbsp;</td><td>ImageJ2 / Fiji</td><td>Freeware</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td>444960-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus IX-71/73/83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser 561 nm, 200 mW</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-561-200</td><td>561 nm Emission</td></tr><tr><td>Laser 642 nm, 140 mW</td><td>Omicron</td><td>Luxx-642-140</td><td>642 nm Emission</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Version R2013a</td><td></td></tr><tr><td>MEM mit Earle's Balanced Salt Solution 2,2 g/L NaHCO3, stabiles Glutamin ohne PR</td><td>Biochrom</td><td>FG-0385</td><td></td></tr><tr><td>MEM mit Earle's Balanced Salt Solution mit 2,2 g/L NaHCO3, stabiles Glutamin, Phenolred</td><td>Biochrom</td><td>FG-0325</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; Tiefrot FM</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific M22426</td><td>Farbstoff</td></tr><tr><td>MitoTracker&reg; Green FM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td>Farbstoff</td></tr><tr><td>Multimode-optische Polarisation unter Beibehaltung der Monomode-Faser</td><td>Punktquelle/Qioptiq</td><td></td><td>KineFLEX</td></tr><tr><td>NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer&nbsp;</td><td>Rapp Polymere GmbH T&uuml; bingen</td><td></td><td>Deckglasbeschichtung</td></tr><tr><td>nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)</td><td>Biochrom</td><td>#0802E</td><td></td></tr><tr><td>PEG 800 (Polyethylenglykol) 10 %</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art.-Nr. 0263.1</td><td>Deckglasbeschichtung</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom</td><td>#0122E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid für die PINK1-Halo7-Tag-Expression</td><td>Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin (1,2 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich & Co.</td> KG<td>Katze. No.P9155</td><td>Deckglasbeschichtung</td></tr><tr><td>RGD Peptid (Ac-CGRGDS-COOH)</td><td>Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim</td><td></td><td>Deckglasbeschichtung / Intergrin Rezeptormotiv</td></tr><tr><td>Silizium Rhodamin gebunden an HaloTag&reg;-Ligand (SiRHTL)&nbsp;</td><td>persönliches Geschenk von Kai Johnson</td><td></td><td>dye</td></tr><tr><td>Software-Analyse-Plugin</td><td>self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabbr&uuml; ck</td><td>SLIMFAST 16g</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin / SNAP-Cell&reg; TMR-Star gekoppelt an SNAP-Ligand (TMRstar)&nbsp;</td><td>Neuengland Biolab&reg;</td><td>S9105S</td><td>Farbstoff</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin gebunden an HaloTag&reg;-Ligand (TMRHTL)&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td></td></tr><tr><td>Farbstoff-TIRF-Kondensator</td><td>Olympus</td><td>Cell^TIRF MITICO System</td><td>TIRF-Kondensor</td></tr><tr><td>TIRF-Mikroskop-Steuerungssoftware</td><td>Olympus cellSens 1.12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TIRF-Objektiv</td><td>Olympus</td><td>150x Öl-Objektiv (N.A. 1.45; Trypsin</td><td></td></tr><tr><td>/EDTA 10x</td><td>Biochrom</td><td>#0266</td><td></td></tr><tr><td>Wasser H2O 99,5 % Rotipuran&reg; Niedrig Bio&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Art.-Nr. Nein. HN57.1</td><td></td></tr></tbody></table>

multi-color-lokalisierung mikroskopie des einzigen membranproteine in organellen der lebenden säugetier-zellen

Multi-color Localization Microscopy of Single Membrane Proteins in Organelles of Live Mammalian Cells

Wissen über die Lokalisierung von Proteinen in zellulären Subcompartments ist entscheidend für ihre spezifische Funktion zu verstehen. Hier präsentieren wir Ihnen eine super-Resolution-Technik, die für die Bestimmung der Microcompartments, die zugänglich für Proteine sind ermöglicht durch Erzeugung von Lokalisierung und tracking-Karten dieser Proteine. Darüber hinaus werden durch multi-Color-Lokalisierung-Mikroskopie, die Lokalisierung und Überwachungsprofile von Proteinen in unterschiedlichen Subcompartments gleichzeitig erhalten. Die Technik ist speziell für lebende Zellen und basiert auf die sich wiederholenden Darstellung der einzigen mobilen Membranproteine. Interessierenden Proteine sind genetisch mit bestimmten, sogenannten Self Labelling Tags fusioniert. Diese Tags sind Enzyme, die mit einem Substrat kovalent zu reagieren. Auf diese Substrate konjugiert sind fluoreszierende Farbstoffe. Reaktion der Enzym-markierten Proteine mit der Fluoreszenz beschriftet Substrate Ergebnisse in markierte Proteine. Hier werden Tetramethylrhodamine (TMR) und Silizium Rhodamine (SiR) als Fluoreszenz-Farbstoffen beigefügt, die Substrate der Enzyme eingesetzt. Substrat-Konzentrationen in der pM, nM-Bereich verwenden, wird Sub stöchiometrischen Kennzeichnung erreicht, der deutliche Signale führt. Diese Signale werden lokalisiert, mit ~ 15 – 27 nm Präzision. Die Technik ermöglicht multi-Color Imaging von einzelne Moleküle, wobei die Anzahl der Farben durch die verfügbaren Membran durchlässig Farbstoffe und das Repertoire der selbstbeschriftung Enzyme begrenzt wird. Wir zeigen die Machbarkeit der Technik durch die Bestimmung der Lokalisation des Enzyms Qualitätskontrolle (Pten)-induzierte Kinase 1 (PINK1) in verschiedenen mitochondrialen Kompartimenten während seiner Verarbeitung in Bezug auf andere Membranproteine. Der Test für echte physikalische Wechselwirkungen zwischen unterschiedlich markierte einzelne Proteine durch Einzelmolekül Bund oder Co-Tracking ist jedoch beschränkt, weil die niedrigen Kennzeichnung Grad die Wahrscheinlichkeit verringern dafür, dass zwei benachbarte Proteine gleichzeitig beschriftet. Während die Technik für imaging-Proteine in Membran Fächer stark ist, ist in den meisten Fällen es nicht angebracht, die Lokalisierung der hochmobilen lösliche Proteine bestimmen.

Multi-Color Imaging und ns1 Analyse kann helfen, die Sub-Organellen Lokalisierung der Proteine festzustellen. Wir haben das früher mit der cytosolischen Phosphatase und tensin Homolog, PINK1, das Sub-mitochondriale Standorten aufgrund der Verarbeitung von mitochondrialen Proteasen17hat bewiesen. PINK1 ist ein wichtiger Faktor, die Gewährleistung der mitochondrialen Funktion34,35. Um festzustellen, dass die ...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die multi-Color Lokalisierung der einzelnen Membranproteine in Organellen der lebenden Zellen. Um Fluorophore zu befestigen, sind selbst Kennzeichnung Proteine verwendet. Proteine, befindet sich in verschiedenen Membranen Kompartimenten des die gleichen Organellen lokalisiert werden können, mit einer Genauigkeit von ~ 18 nm.

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Knowledge about the localization of proteins in cellular subcompartments is crucial to understand their specific function. Here, we present a ...

Diese Technik kann Schlüsselfragen in regulatorischen Prozessen beantworten, z. B. welche Rolle die Dynamik und Organisation von Proteinen bei der funktionellen Anpassung spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in lebenden Zellen durchgeführt werden kann, wodurch die Proteindynamik auf Einzelmolekülebene sichtbar wird. Obwohl diese Methode ursprünglich implementiert wurde, um Einblicke in die räumlich-zeitliche Organisation von mitochondrialen Membranproteinen zu erhalten, kann sie auch auf andere Organellen und andere Membranproteine angewendet werden.Die Technik wird von Timo Appelhans, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Nach der Transfizierung und Präparation von Zellproben und dem Mikroskop gemäß dem Textprotokoll montieren Sie die vorbereitete Probe mit fluoreszierenden Kügelchen in den Probenhalter zwischen dem PTFE-Ring und dem roten Gummiring. Starten Sie das Mikroskop, alle Hardwarekomponenten und die gesamte Software, die für die Mikroskopie benötigt wird.Verwenden Sie ein frisches, fusselfreies, mit Isopropanol besprühtes Taschentuch, um die Objektivlinse und die Unterseite des Deckglases zu reinigen. Geben Sie dann einen Tropfen I

multi-color-localization-microscopy-single-membrane-proteins

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zeitraffer-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Autophagie Marker erlaubt die Überwachung der dynamischen Autophagie Reaktion mit hoher zeitlicher Auflösung. Mit spezifischen Autophagie und Organellen Marker in einer Kombination aus 3 verschiedenen Farben, können wir folgen den Beitrag eines Proteins an Autophagosom Bildung in einem robusten räumlichen und zeitlichen Kontext.

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Quantitative Analyse des Niveaus der Plasmamembran Verein für Gewebekulturen getaggt peripher-assoziierten Protein durchführen. Die Methode basiert auf die rechnerische Zersetzung der Membran und zytoplasmatischen Komponente des Signals beobachtet in Zellen mit Plasmamembran fluoreszierenden Marker gekennzeichnet.

Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierungsdynamik von Proteinen und zur Überwachung morphologischer Veränderungen mithilfe der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus.

Live-Cell Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung subzellulärer Proteinlokalisierung und Zellmorphologie Veränderungen in Bakterien

Herkömmliche BODIPY-Konjugate können für die livezellige Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) durch Ausnutzung ihrer vorübergehend bildenden, rot verschiebeten Bodenzustandsdimer eingesetzt werden. Wir präsentieren ein optimiertes SMLM-Protokoll zur Verfolgung und Auflösung subzellulärer neutraler Lipide und Fettsäuren in lebenden Säugetier- und Hefezellen auf der nanoskopischen Längenskala.

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Dieses Protokoll stellt einen Arbeitsablauf für die Vermehrung, Differenzierung und Färbung von kultivierten SH-SY5Y-Zellen und primären Hippocampusneuronen der Ratte für die Visualisierung und Analyse der mitochondrialen Ultrastruktur unter Verwendung der stimulierten Emissionsverarmungsmikroskopie (STED) dar.

Verwendung von Lebendzell-STED-Bildgebung zur Visualisierung der mitochondrialen Innenmembran-Ultrastruktur in neuronalen Zellmodellen

Dieses Protokoll beschreibt einen Mechanismus zur Verwendung von korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie, um die Wechselwirkung von Mitochondrien und Lysosomen, die mit mEosEM bzw. APEX2 markiert sind, sichtbar zu machen.

Zweifarbige korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die Expression und Quantifizierung neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptor-Untereinheiten mittels der säugetierischen Neuro-2a-Zelllinie. pH-empfindliche fluoreszierende Tags und konfokale Mikroskopie ermöglichen eine präzise Bewertung der Rezeptorlokalisierung an der Plasmamembran im Vergleich zu denen, die in pH-neutralen intrazellulären Kompartimenten exprimiert werden, was die Untersuchung des nAChR-Transports und der pharmakologischen Modulation...

Lokalisierung der Plasmamembran und intrazellulärer neuronaler nikotinischer Acetylcholinrezeptoren mittels quantitativer Bildgebung in Säugetierzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Single-Antibody-Markierung (SAL), um die nanoskalige räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu klären. Durch die Nutzung kumulativer Antikörper-Epitope-Interaktionen auf Einzelmolekülebene kartiert Membran-SAL (mSAL) lokale Epitope-Verteilungen und erfasst gleichzeitig das Antikörperbindungsverhalten in der nativen zellulären Umgebung.

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung

Erfahren Sie die Mehrfarben-Lokalisierung einzelner Membranproteine in lebenden Säugetierzellen mit einer Präzision von etwa 18 nm. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen von Proteindynamiken in Organellen.

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

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