Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Diese Technik kann Schlüsselfragen in regulatorischen Prozessen beantworten, z. B. welche Rolle die Dynamik und Organisation von Proteinen bei der funktionellen Anpassung spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie in lebenden Zellen durchgeführt werden kann, wodurch die Proteindynamik auf Einzelmolekülebene sichtbar wird. Obwohl diese Methode ursprünglich implementiert wurde, um Einblicke in die räumlich-zeitliche Organisation von mitochondrialen Membranproteinen zu erhalten, kann sie auch auf andere Organellen und andere Membranproteine angewendet werden.

Die Technik wird von Timo Appelhans, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Nach der Transfizierung und Präparation von Zellproben und dem Mikroskop gemäß dem Textprotokoll montieren Sie die vorbereitete Probe mit fluoreszierenden Kügelchen in den Probenhalter zwischen dem PTFE-Ring und dem roten Gummiring. Starten Sie das Mikroskop, alle Hardwarekomponenten und die gesamte Software, die für die Mikroskopie benötigt wird.

Verwenden Sie ein frisches, fusselfreies, mit Isopropanol besprühtes Taschentuch, um die Objektivlinse und die Unterseite des Deckglases zu reinigen. Geben Sie dann einen Tropfen Immersionsöl auf die Pupille der Objektivlinse. Platzieren Sie anschließend den Probenhalter mit der Kügelchenprobe so auf dem Mikroskoptisch, dass die Unterseite des Deckglases mit dem Öl in Kontakt kommt.

Fokussieren Sie dann die Kügelchen mit Transmissionslicht oder einer Laserlinie. Passen Sie die Leistung der beiden Anregungslaser an, um eine ähnliche Signaldichte in den beiden Fluoreszenzkanälen zu erreichen. Suchen Sie dann nach einem Bereich mit vielen unterschiedlichen Fluoreszenzsignalen.

Generieren Sie eine zusammengeführte Ansicht der Fluoreszenzkanäle mit der Kamerasteuerungssoftware. Verwenden Sie dann die Schrauben am Bildsplitter, um den internen optischen Bildsplitter manuell zu kippen, um die beste Überlagerung der Signale der beiden Leuchtstoffkanäle zu erzielen. Starten Sie die TIRF-Mikroskopsteuerungssoftware und wählen Sie, ob einzelne Kanäle im Live-Stream-Modus angezeigt werden sollen.

Machen Sie ein Schnappschussbild, das Leuchtstoffröhren in allen Kanälen anregt. Verwenden Sie dann dieses Bild, um die Transformationsmatrix zu erstellen. Starten Sie das Software-Analyse-Plugin und laden Sie die zuvor aufgenommenen zweifarbigen Bilder von fluoreszierenden Kügelchen in die Software.

Wählen Sie die verwendete Ausrichtung der Leuchtstoffkanäle. Klicken Sie auf Ja, wenn Sie nach der Kalibrierung von Bildern gefragt werden, und wählen Sie den zuvor aufgenommenen Schnappschuss aus. Öffnen Sie den Einheiten-Manager, um Einheitenumrechnungsfaktoren zu definieren, und öffnen Sie dann den Lokalisierungs-Manager.

Um die Point-Spread-Funktion (PSF) zu bestimmen, drücken Sie die Taste PSF Radius. Definieren Sie im sich öffnenden Fenster PSF-Schätzer die numerische Apertur und das Emissionsmaximum. Klicken Sie dann auf PSF-Radius schätzen.

Akzeptieren Sie als Nächstes die erhaltene experimentelle PSF. Definieren Sie das Auswertungsfeld, die Anzahl der Deflationsschleifen und die Anzahl der Kerne des Computers, die für die Berechnung verwendet werden. Drücken Sie dann die Taste "Lokalisieren", um die Intensitätsverteilung einzelner Partikel mithilfe einer symmetrischen 2D-Gauß-Funktion anzupassen.

Öffnen Sie den Kalibrierungsmanager. Im gerenderten, zusammengeführten Bild der beiden Kanäle werden das Originalsignal und die lokalisierten Zentren angezeigt. Wählen Sie den affinen Modus.

Verbinden Sie dann manuell die entsprechenden Paare lokalisierter Zentren in den beiden Kanälen, die von derselben fluoreszierenden Perle stammen, indem Sie eine Verbindungslinie zeichnen. Verbinden Sie die entsprechenden Signale über das Sichtfeld verteilt. Klicken Sie dann auf Akzeptieren, und speichern Sie die Transformationsmatrix.

Um eine einzelmolekulare Bildgebung von mitochondrialen Membranproteinen durchzuführen, montieren Sie den Abdeckschieber der Probe zwischen dem Gummi und den PTFE-Ringen. Füllen Sie dann die Kammer mit 0,5 bis 0,8 Millilitern Bildgebungsmedium. Reinigen Sie die Objektivlinse und die Unterseite des Deckglases.

Verwenden Sie dann Transmissionslicht oder eine Laserlinie, um auf die Zellen zu fokussieren, nachdem Sie einen Tropfen Öl auf die Linse gegeben haben. Passen Sie dann die Leistung der beiden Anregungslaser an, um eine ähnliche Intensität zu erreichen, und suchen Sie nach einem Bereich mit vielen Fluoreszenzsignalen. Passen Sie den Beleuchtungswinkel in der TIRF-Mikroskopsteuerungssoftware an, um einen Einfallswinkel zu erzeugen, der kleiner als der kritische Winkel ist, oder den TIR-Modus, um den spezifischen Bereich des Interesses über ein HILO-Blatt anzuregen.

Die Anpassung der Beleuchtung des TIRF-Mikroskops an die Anregung von Zellorganellen mit der HILO-Beleuchtung erfordert eine schnelle Beurteilung des Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisses und Erfahrung in der TIRF-Mikroskopie sowie Kenntnisse der Zellmorphologie. Stellen Sie die EM-Verstärkung ein und wählen Sie eine für das Experiment geeignete Belichtungszeit, die genügend Photonen pro Bild sammelt. Passen Sie dann die Laserleistung an, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, da dieses Verhältnis direkt mit der Lokalisierungsgenauigkeit korrespondiert.

Finden Sie einen Bereich in der Zellperipherie mit nicht überlappenden, länglichen Mitochondrien und Einzelmolekülsignalen. Wenn in einem oder beiden Kanälen keine einzelnen Signale sichtbar sind, warten Sie, bis das Bleichen zum Auftreten von Einzelmolekülsignalen führt. Falls nur ein Kanal gebleicht werden muss, schalten Sie den Laser des anderen Kanals aus, um ein Ausbleichen zu vermeiden, bevor Sie diesen Kanal aufnehmen.

Nehmen Sie so lange auf, bis die Anzahl der Signale für eine sinnvolle Fortsetzung zu gering ist. Starten Sie die Bildgebungsverarbeitungssoftware und prüfen Sie auf mitochondriale Strukturen, indem Sie ein kumulatives gerendertes Summenbild von mindestens 1.000 aufgezeichneten Bildern erzeugen. Starten Sie das Softwareanalyse-Plugin.

Um die Datenverarbeitung für die Lokalisierung und Verfolgung durchzuführen, laden Sie die Rohdaten. Aktivieren Sie Multicolor. Wählen Sie die richtige Ausrichtung beider Kanäle.

Wenn Sie nach Bildern kalibrieren gefragt werden, laden Sie die Transformationsmatrix. Die Kanäle werden separat angezeigt. Öffnen Sie die Rohdaten aus dem Bildcontainer, indem Sie auf Anzeigen klicken.

Öffnen Sie dann den Einheitenmanager auf der oberen Registerkarte und definieren Sie die Umrechnungsfaktoren für die Einheit in jedem Kanal. Öffnen Sie den Lokalisierungsmanager auf der oberen Registerkarte und definieren Sie das Auswertungsfeld und die Anzahl der Deflationsschleifen. Klicken Sie auf PSF-Radius, um den PSF-Schätzer zu öffnen.

Stellen Sie die numerische Apertur und das Emissionsmaximum ein, um den theoretischen PSF-Wert zu erhalten. Drücken Sie auf Akzeptieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Kanäle.

Drücken Sie dann Lokalisieren, um die Einzelpartikel-Lokalisierung für die aufgezeichneten Signale in beiden Kanälen zu starten. Warten Sie, bis die Software fertig ist. Nun wird ein superaufgelöstes Bild für jeden Kanal im Bildcontainer des Software-Analyse-Plugins erhalten.

PINK1 ist ein wichtiger Faktor, der die Funktionalität der Mitochondrien garantiert. Um die Lokalisation von PINK1 relativ zu Tom20 in funktionellen und dysfunktionalen Mitochondrien zu bestimmen, wurde eine Zeitreihe von 1.000 Bildern aufgenommen. Das kumulative Bild aller Signale über die Zeit von einem Kanal zeigte, dass PINK1 unter normalen Bedingungen im Zytosol, an der äußeren Membran und in den Mitochondrien lokalisiert war, bevorzugt jedoch in der äußeren Membran depolarisierter Mitochondrien.

Wie die summierten Bilder der lokalisierten Partikel zeigen, ist PINK1 hauptsächlich in polarisierten Mitochondrien verteilt, während Tom20 in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert ist. Noch deutlicher wird dies in dem zusammengeführten Bild von lokalisierten Tom20- und PINK1-Partikeln, das zeigt, dass die Verteilung des äußeren Membranproteins Tom20 viel breiter ist. Um die Lokalisation von PINK1 in den Mitochondrien zu verifizieren, wurde die 30-Kilodalton-Untereinheit des respiratorischen Komplexes eins mit photoaktivierbarem GFP fusioniert und mittels Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisationsmikroskopie aufgezeichnet.

Das kumulative dreifarbige Bild und die Querschnittsverteilung zeigen die Überlagerung von Komplex Eins und PINK1, was den Import von PINK1 in voller Länge bestätigt. Diese Daten zeigen, dass Subpopulationen von PINK1 mehrere mitochondriale Mikrokompartimente besetzen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 Stunden durchgeführt werden, einschließlich Aufzeichnung und Nachbearbeitung von Daten, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, auf Organellenbewegung zu testen. Mit diesem Verfahren kann die relative Lokalisation von Proteinen bestimmt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Einzelpartikelverfolgung von mitochondrialen Proteinen, um ihr Verhalten in Z2 und unter verschiedenen Stoffwechselbedingungen und unter Stress zu beobachten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Doppelsäulenmikroskopie von mitochondrialen Proteinen durchführen, um ihre Position und ihren Transport unter den Organellen aufzudecken.