Scratch-Test für die In-vitro- Prüfung der Zellwanderung mit einer automatisierten optischen Kamera optimiert
8. August 2018
Hier beschreiben wir eine Prozedur, um die Zelle Migration in Vitro mit einer automatisierten optischen Kamera Mikroskop zu testen. Der Scratch-Test hat verbreitet wo die Schließung von Grund auf für einen bestimmten Zeitraum gefolgt ist. Das optische Mikroskop ermöglicht eine zuverlässige und preiswerte Erfassung von Zellmigration.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die Zellen in Echtzeit mit dem automatischen optischen Mikroskop betrachten können. Die Auswirkungen dieser Behandlung erstrecken sich auf die Therapie von chronischen Wunden oder Krebs, bei denen die Migration eine entscheidende Rolle bei diesen Krankheiten spielt. Beginnen Sie damit, eine konfluente Kultur von HaCaT-Zellen zweimal mit fünf Millilitern sterilem magnesium- und kalziumfreiem PBS pro Waschgang zu waschen.
Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit einem Milliliter Trypsin in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator für fünf bis acht Minuten. Nach Bestätigung der Ablösung unter einem Lichtmikroskop stoppen Sie die enzymatische Reaktion mit neun Millilitern Kulturmedium, das mit FBS versetzt ist. Und verdünnen Sie die Zellen auf 7,5 mal 10 bis die vierte Zellen pro 250 Mikroliter Medium plus FBS-Konzentration.
Als nächstes säen Sie 250 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer 48-Well-Gewebekulturplatte mit rundem Boden und schieben Sie die Platte vorsichtig von einer Seite zur anderen, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über die Vertiefungsböden verteilt sind. Anschließend wird die Platte in einen Zellkultur-Inkubator überführt. Wenn die Kulturen eine Konfluenz von 90 bis 95 % erreicht haben, ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung durch 250 Mikroliter frisch zubereitetes Medium, das mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Mitomycin C ergänzt wird, und stellen Sie die Platte für weitere zwei Stunden wieder in den Inkubator.
Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern PBS und geben Sie 250 Mikroliter frisches PBS in jede Vertiefung. Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze, um einen vertikalen Kratzer in jeder Zell-Monoschicht zu machen. Wenn alle Monoschichten zerkratzt sind, ersetzen Sie das PBS in jeder Vertiefung durch 250 Mikroliter mit dem gewünschten Peptidstimulus und montieren Sie die Platte mit intaktem Deckel in ein optisches Kamerasystem.
Um die optische Kamera einzurichten, öffnen Sie das Erfassungsfenster und wählen Sie Wundheilung aus. Wählen Sie den Plattentyp aus, und deaktivieren Sie die nicht verwendeten Vertiefungen. Klicken Sie anschließend auf Aktivieren und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine der Vertiefungen, um den Fokus an die Position der Zellen anzupassen.
Stellen Sie unter Bildintervall den Zeitraum für die Bilder ein und stellen Sie die Anzahl der Wiederholungen so ein, dass sie dem gewünschten Zeitraum entspricht. Wählen Sie dann den entsprechenden Analysetyp aus. Klicken Sie dann auf Start, um mit der Bildgebung der Zellen zu beginnen.
Wenn eine Wunde auftritt, beginnen sich die Hautzellen zu vermehren und über das Wundbett zu wandern, um die Wunde zu schließen, ein Prozess, der durch die optische Kamera beobachtet werden kann. Nach einer 48-stündigen Inkubation induziert die Behandlung mit dem endothelialen Wachstumsfaktor einen Verschluss der Wunde von fast 95 %, verglichen mit einem Verschluss von 38 % in den unbehandelten Kontrollvertiefungen und 33 bzw. 62 % Verschlüssen in den Lactoferrin- und Lactoferricin-Kulturen. Der prozentuale Anteil des Wundverschlusses, der aus den Änderungen der Spaltbreite gegenüber dem ersten Kratzer bestimmt wird, kann ebenfalls für jeden Wachstumsreiz aufgetragen werden.
Dieses Video beschreibt ein einfaches und effizientes Protokoll zur Untersuchung der Migration von Keratinozyten über einen Kratzer, der in einer Monoschicht gesunder Zellen gemacht wurde. Obwohl es sich bei den in diesem Assay verwendeten Zellen um HaCaT-Zellen handelt, kann die Methode auch auf andere Zelllinien, Pilze oder sogar Bakterien angewendet werden, solange sie am Boden der Mikrotiterplatte haften.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
In diesem Artikel wird ein Verfahren zur Untersuchung der Zellmigration in vitro mithilfe eines automatisierten optischen Kamerasystems am Mikroskop beschrieben. Der Kratzer-Assay wird als zuverlässige Methode zur Beobachtung der Zellmigration über die Zeit hervorgehoben.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Mikroskopie
- In-vitro-Techniken
Hintergrund
- Der Kratzer-Test ist eine weit verbreitete Technik zur Untersuchung der Zellmigration.
- Automatisierte optische Mikroskope ermöglichen die Echtzeitbeobachtung von Zellen.
- Das Verständnis der Zellmigration ist entscheidend für Therapien bei chronischen Wunden und Krebs.
- Diese Methode ist kostengünstig und zuverlässig zur Detektion von Zellbewegungen.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der Zellmigration demonstrieren.
- Die Bedeutung der Zellmigration für die Behandlung chronischer Wunden und die Krebstherapie untersuchen.
- Die automatisierte optische Mikroskopie für die Echtzeitanalyse nutzen.
Verwendete Methoden
- Spülen konfluenter Kulturen von HaCaT-Zellen mit PBS.
- Inkubation der Zellen mit Trypsin zur Ablösung.
- Beendigung der enzymatischen Reaktion mit Kulturmedium.
- Verdünnen der Zellen auf eine bestimmte Konzentration zur Analyse.
Hauptergebnisse
- Die Echtzeitbeobachtung der Zellmigration wurde erreicht.
- Die Methode erwies sich als wirksam zur Überwachung des Verschließens von Kratzverletzungen.
- Die Ergebnisse können therapeutische Strategien bei chronischen Wunden und Krebserkrankungen unterstützen.
- Die automatisierte Mikroskopie verbessert die Zuverlässigkeit von Migrationsbewertungen.
Schlussfolgerungen
- Das automatisierte optische Mikroskop ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Zellmigration.
- Diese Technik kann die Forschung im Bereich der Heilung chronischer Wunden und der Krebstherapien voranbringen.
- Weitere Studien könnten ihre Anwendungen in verschiedenen biologischen Kontexten erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Zellwanderungsassays sind entscheidend für die Bewertung therapeutischer Kandidaten in der Wundheilung und Onkologie, doch herkömmliche Kratzerassays weisen Randartefakte und Engpässe bei der manuellen Analyse auf. Dieses optimierte Protokoll behebt Reproduzierbarkeitsprobleme, indem es kationenvermittelte Zellakkumulation vermeidet und automatisierte Bildgebung integriert, wodurch konsistente, quantitative Messungen der Zellmigration ermöglicht werden. Der Ansatz unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien und die mechanistische Risikominimierung, indem er zuverlässige Echtzeitdaten zu migrationsfördernden und -hemmenden Substanzen liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem Migrationsänderungen als Reaktion auf Stimuli wie Lactoferrin oder Wachstumsfaktoren quantifiziert werden.
- Operativer Wert: Verringert die Variabilität durch manuelle Kratzer-Analyse und Temperaturschwankungen mittels automatisierter optischer Bildgebung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, quantitative Metriken zur Wundschlussrate aus identischen Kratzpräparaten über die Zeit.
- Operationaler Wert: Beseitigt den arbeitsintensiven Durchlauf von Bildern und deren Analyse und verbessert so den Durchsatz bei der Wirkstoff-Screening.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verwendet krankheitsrelevante HaCaT-Keratinozyten, um die epitheliale Migration zu modellieren, und unterstützt so die translationale Biomarker-Abstimmung.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Kontinuität im Assay vom Entdeckungsstadium bis zur präklinischen Bewertung durch reproduzierbare, automatisierte Arbeitsabläufe.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess ein, unterstützt die Hypothesenprüfung in der frühen Entdeckungsphase und ermöglicht die quantitative Identifizierung von Leitsubstanzen durch messbare Hemmung oder Stimulation der Migration.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen, indem Migration als abhängige Variable in Reaktion auf Peptid- oder Zytokinbehandlungen isoliert wird.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse (z. B. % Wundverschluss), die den Vergleich zwischen Substanzbibliotheken oder Proteinvarianten ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt zeitliche Migrationsdaten, die für statistische Vergleiche und die Modellierung von Dosis-Wirk-Beziehungen geeignet sind.
- Translationale Forschung: Schafft Bezug zur präklinischen Relevanz durch die Verwendung menschlicher Keratinozyten und des Kontexts der Wundheilung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, automatisierte Plattform für Migrationsassays über mehrere Projekte und Zelltypen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem mechanistische Unklarheiten bei Migrationsassays reduziert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Skalierbarkeit durch automatisierte Bildgebung und konsistente Kratzpräparation.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem zuverlässige, quantitative Migrationsdaten früh im Entwicklungsprozess bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf validierten Migrationswirkungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur und steriler Technik zur Herstellung von Monolayern.
- Benötigt automatisierte optische Kamerasysteme mit Zeitrafferaufnahmen und Analysefunktionen.
- Setzt eine Standardisierung der Kratzbreite und des Zeitpunkts über mehrere Wells hinweg zur Vergleichbarkeit der Daten voraus.
- Beinhaltet die Optimierung der PBS-Waschschritte, um Randartefakte in verschiedenen Zelllinien zu vermeiden.
- Auf adhärente Zellen beschränkt, die mit der Anheftung an den Boden von Mikrotiterplatten kompatibel sind.
