Scratch-Test für die In-vitro- Prüfung der Zellwanderung mit einer automatisierten optischen Kamera optimiert

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die Zellen in Echtzeit mit dem automatischen optischen Mikroskop betrachten können. Die Auswirkungen dieser Behandlung erstrecken sich auf die Therapie von chronischen Wunden oder Krebs, bei denen die Migration eine entscheidende Rolle bei diesen Krankheiten spielt. Beginnen Sie damit, eine konfluente Kultur von HaCaT-Zellen zweimal mit fünf Millilitern sterilem magnesium- und kalziumfreiem PBS pro Waschgang zu waschen.

Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit einem Milliliter Trypsin in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator für fünf bis acht Minuten. Nach Bestätigung der Ablösung unter einem Lichtmikroskop stoppen Sie die enzymatische Reaktion mit neun Millilitern Kulturmedium, das mit FBS versetzt ist. Und verdünnen Sie die Zellen auf 7,5 mal 10 bis die vierte Zellen pro 250 Mikroliter Medium plus FBS-Konzentration.

Als nächstes säen Sie 250 Mikroliter Zellen in jede Vertiefung einer 48-Well-Gewebekulturplatte mit rundem Boden und schieben Sie die Platte vorsichtig von einer Seite zur anderen, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig über die Vertiefungsböden verteilt sind. Anschließend wird die Platte in einen Zellkultur-Inkubator überführt. Wenn die Kulturen eine Konfluenz von 90 bis 95 % erreicht haben, ersetzen Sie den Überstand in jeder Vertiefung durch 250 Mikroliter frisch zubereitetes Medium, das mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Mitomycin C ergänzt wird, und stellen Sie die Platte für weitere zwei Stunden wieder in den Inkubator.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit 250 Mikrolitern PBS und geben Sie 250 Mikroliter frisches PBS in jede Vertiefung. Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze, um einen vertikalen Kratzer in jeder Zell-Monoschicht zu machen. Wenn alle Monoschichten zerkratzt sind, ersetzen Sie das PBS in jeder Vertiefung durch 250 Mikroliter mit dem gewünschten Peptidstimulus und montieren Sie die Platte mit intaktem Deckel in ein optisches Kamerasystem.

Um die optische Kamera einzurichten, öffnen Sie das Erfassungsfenster und wählen Sie Wundheilung aus. Wählen Sie den Plattentyp aus, und deaktivieren Sie die nicht verwendeten Vertiefungen. Klicken Sie anschließend auf Aktivieren und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine der Vertiefungen, um den Fokus an die Position der Zellen anzupassen.

Stellen Sie unter Bildintervall den Zeitraum für die Bilder ein und stellen Sie die Anzahl der Wiederholungen so ein, dass sie dem gewünschten Zeitraum entspricht. Wählen Sie dann den entsprechenden Analysetyp aus. Klicken Sie dann auf Start, um mit der Bildgebung der Zellen zu beginnen.

Wenn eine Wunde auftritt, beginnen sich die Hautzellen zu vermehren und über das Wundbett zu wandern, um die Wunde zu schließen, ein Prozess, der durch die optische Kamera beobachtet werden kann. Nach einer 48-stündigen Inkubation induziert die Behandlung mit dem endothelialen Wachstumsfaktor einen Verschluss der Wunde von fast 95 %, verglichen mit einem Verschluss von 38 % in den unbehandelten Kontrollvertiefungen und 33 bzw. 62 % Verschlüssen in den Lactoferrin- und Lactoferricin-Kulturen. Der prozentuale Anteil des Wundverschlusses, der aus den Änderungen der Spaltbreite gegenüber dem ersten Kratzer bestimmt wird, kann ebenfalls für jeden Wachstumsreiz aufgetragen werden.

Dieses Video beschreibt ein einfaches und effizientes Protokoll zur Untersuchung der Migration von Keratinozyten über einen Kratzer, der in einer Monoschicht gesunder Zellen gemacht wurde. Obwohl es sich bei den in diesem Assay verwendeten Zellen um HaCaT-Zellen handelt, kann die Methode auch auf andere Zelllinien, Pilze oder sogar Bakterien angewendet werden, solange sie am Boden der Mikrotiterplatte haften.