Beurteilung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakterielle Konsortiums auf der In-vitro- Darm Host-Mikrobe Oberfläche

Dieses Modell ist der nächste Schritt bei der Festlegung von Mikrorichtungen des Wirts für den oberen Verdauungstrakt. Es ermöglicht die Beantwortung mechanistischer Forschungsfragen und bietet viele Möglichkeiten für die Lebensmittel-, Pharma- und Nutrazeutikaindustrie sowie die Toxikologie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein Modell des Magen-Darm-Systems mit der Mikroschnittstelle des Wirts kombiniert, einschließlich einer komplexen Mikrobengemeinschaft.

Es ist sehr anwendbar und auch sehr flexibel. Diese Methodik kann mit anderen Zelltypen angewendet werden, um die Lebensfähigkeit von Krankheitserregern und die daraus resultierenden Informationen zu bewerten. Veränderungen können auch verwendet werden, um die Besiedlungskapazität von probiotischen Mischungen und letztendlich die potenzielle Wirkung von Bakterien auf den persystemischen Kreislauf zu unterstützen.

Zu Beginn autoklavieren Sie das Medium und fügen Sie dann fünf Mikrogramm pro Milliliter Hemen und ein Mikrogramm pro Milliliter Menadion hinzu. Geben Sie neun Milliliter des Mediums in Hungate-Röhrchen und verschließen Sie die Röhrchen mit einem Gummistopfen und einer Aluminiumkappe. Spülen Sie dann die Rohre mit einem Gemisch aus 90 % Stickstoff und 10 % Kohlendioxid.

Verwenden Sie die Spritze, um einen Milliliter anaerobes Medium zu entnehmen, und geben Sie es in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Wählen Sie einzelne Kolonien jeder Bakterienart aus und resuspendieren Sie sie im Medium. Übertragen Sie dann die Kolonien in das anaerobe modifizierte BHI und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Verwenden Sie nach der Inkubation filtriertes sterilisiertes PBS, um die Kulturen auf 10 bis fünfte Zellen pro Milliliter zu verdünnen. Verwenden Sie dann die Durchflusszytometrie mit dem cybergrünen Propidiumiodid-Farbstoff, um die Zellzahl zu messen. Die Bewertung der Zusammensetzung und Lebensfähigkeit der Mikrobiomgemeinschaft ist wichtig, um Verzerrungen in unserem Experiment zu vermeiden.

Nehmen Sie das Zellkulturmedium aus den Kolben und verwenden Sie dann fünf Milliliter PBS ohne Kalzium oder Magnesium, um die Zellen einmal zu waschen. Geben Sie zwei Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellen. Verteilen Sie die Lösung, indem Sie den Kolben vorsichtig bewegen.

Entfernen Sie dann 1,5 Milliliter der Trypsinlösung und inkubieren Sie den Kolben 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem unter dem Mikroskop überprüft wurde, ob sich die Zellen abgelöst haben, werden fünf Milliliter supplementiertes Zellkulturmedium in den Kolben gegeben, um das Trypsin zu inaktivieren, und auf und ab pipettiert, um eine homogene Einzelzellsuspension zu erhalten. Mischen Sie sofort ein 50-Mikroliter-Aliquot der Zellsuspension mit einer sterilen 0,4%igen Trypanblau-Lösung in einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von 1:1 für KCO2-Zellen und einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von 1:5 für HT29MTX.

Mischen Sie durch Pipettieren und laden Sie die Suspension in eine Zählkammer, bevor Sie die Zellen unter dem Mikroskop zählen. Nach der Vorbereitung von KCO2- und HT29MTX Zellsuspensionen gemäß dem Textprotokoll werden die Suspensionen homogenisiert und das entsprechende Volumen an KCO2- und HT29MTX-Zellen in einen vorgefüllten sterilen Behälter mit zugesetztem Zellkulturmedium gegeben. Das vorinkubierte Medium wird von der apikalen Seite der zuvor vorbereiteten Kammer aspiriert.

Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig durch Pipettieren und geben Sie 1,5 Milliliter in das apikale Kompartiment der Kammereinsätze, wobei Sie die Zellsuspension alle ein bis drei Wells mischen, um eine konstante Homogenisierung zu gewährleisten. Bewegen Sie die Platten vorsichtig hin und her und dann von rechts nach links, um die Zellen gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen. Übertragen Sie die Platten in den Inkubator und wiederholen Sie die Bewegung der Platten.

Das Sitzen der Zellen muss mit ständiger Homogenisierung der Zellsuspension erfolgen, um eine gleichmäßige Verteilung in der Vertiefung zu gewährleisten. Um die Integrität der Epithelbarriere vor dem Start der ASA zu messen, stellen Sie sicher, dass die Stufengeräte vollständig aufgeladen sind, bevor Sie mit den Messungen beginnen. Trennen Sie die Etagenausrüstung von der Stromversorgung und decken Sie sie mit einem Autoklavenbeutel aus Kunststoff ab.

Machen Sie ein Loch in den Beutel, um die Elektrode in den Eingangsanschluss des Messgeräts einzuführen. Besprühen Sie dann den Beutel mit 70 % Ethanol, bevor Sie die Etagenausrüstung in den Durchflussschrank umfüllen. Um die Elektrode zu desinfizieren, tauchen Sie die Elektrodenspitzen 15 Minuten lang in 70%iges Ethanol

Lassen Sie die Spitzen 15 Sekunden lang an der Luft trocknen und verwenden Sie dann Zellkulturmedium, um die Elektrode zu spülen. Lassen Sie die Zellen im Durchflussschrank auf Raumtemperatur kommen. Stellen Sie sicher, dass das Messgerät vom Ladegerät getrennt ist, stellen Sie dann den Modusschalter auf Ohm und schalten Sie den Netzschalter ein.

Messen Sie den Zellwiderstand, indem Sie die Elektrode mit der kürzeren Spitze in den Einsatz und der längeren Spitze aus der Vertiefung eintauchen. Halten Sie die Elektrode in einem 90-Grad-Winkel zum Platteneinsatz. Um die orale Verdauung zu simulieren, übertragen Sie drei Milliliter der Bakteriengemeinschaft in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen und mischen Sie es mit drei Millilitern simulierter Speichelflüssigkeit oder SSF.

Fügen Sie 75 Einheiten pro Milliliter Alpha-Amylase aus menschlichem Speichel Typ 9A und zwei Gramm pro Liter Mucin aus Schweinemagen Typ 2 hinzu. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius und 100 U/min für zwei Minuten. Entnehmen Sie eine zwei Milliliter große Probe für die DNA-Extraktion und die Quantifizierung der Durchflusszytometrie.

Um die Magenverdauung zu simulieren, geben Sie vier Milliliter simulierte Magenflüssigkeit oder SGF zu drei Millilitern der Bakterien. Verwenden Sie einen molaren HCl, um den pH-Wert bei Bedarf auf drei einzustellen. Inkubieren Sie die Probe zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 100 U/min.

Entnehmen Sie dann eine Probe von zwei Millilitern. Für die Dünndarmverdauung fügen Sie den Bakterien vier Milliliter simulierte Darmflüssigkeit oder SIF hinzu. Verwenden Sie bei Bedarf Natriumhydroxid, um den pH-Wert anzupassen.

Dann inkubieren Sie die Probe zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 100 U/min. Und entnehmen Sie eine Probe von zwei Millilitern. Nach dem Waschen und Einstellen der Zelldichte der Dünndarmverdauung gemäß dem Textprotokoll entfernen Sie das apikale Medium aus dem Transwell-System und fügen Sie 1,5 Milliliter der Bakteriensuspension hinzu.

Co-Kultur des Systems unter allgemeinen Zellkulturbedingungen für zwei Stunden. Messen Sie nach der Inkubation die Stufenwerte, um die Integrität der Epithelbarriere zu bewerten, wie weiter oben im Video gezeigt. Fügen Sie 0,5 Milliliter 10 millimolares n-Acetylcystein und HPSS hinzu, um den vom HT29MTX produzierten Schleim zu lösen und die anhaftenden Bakterien zurückzugewinnen.

Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für eine Stunde unter Rühren. Gewinnen Sie das NAC HPSS in einem Mikrozentrifugenröhrchen zurück und verwenden Sie einen Milliliter DPBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Geben Sie 0,5 Milliliter 0,5 % Triton-x100 auf die Monoschichten und zerkleinern Sie die Zellen durch Pipettieren.

Dann die Flüssigkeit eine Minute lang schnell im Wirbel zurückgewinnen. Geschwindigkeit ist entscheidend, um die Bakterienzellen mit dem Reinigungsmittel nicht zu beschädigen. Analysieren Sie die Proben gemäß dem Textprotokoll.

Wie hier berichtet, betrug die Anzahl intakter Zellen aus einzelnen Stämmen vor der Entstehung der synthetischen Gemeinschaft etwa 10 bis acht Zellen pro Milliliter, während der Multispezies-Mikrokosmos während der Gründung der Gemeinschaft über 90% lebensfähige Zellen enthielt. Basierend auf der Quantifizierung der Lebendtoten nimmt die Lebensfähigkeit der Bakterien nach jedem Verdauungsschritt ab, was auf den sauren pH-Wert während der Magenpassage und die in den Dünndarmverdauungsflüssigkeiten enthaltenen Biosalze zurückzuführen ist. Die rauen Bedingungen der Magen- und Dünndarmverdauung können Bakterien in lebensfähige, aber nicht in kultivierbare Zellen verwandeln, bei denen es sich um lebende Bakterien handelt, die weder wachsen noch sich teilen.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, sind lebensfähige Zellen, die aus der Schleimhautgrenzfläche gewonnen werden, in der Durchflusszytometrie-Grafik blau gefärbt. Es wurde jedoch kein Wachstum beobachtet, wenn diese Schleimproben plattiert wurden. Die Fraktion, in der Bakterien höhere Überlebensraten aufweisen, sind die zellulären Trümmer, wie sie durch Plattenzählung aufgedeckt werden.

Die Anzahl der Kolonien kann variabel sein, aber das Vorhandensein von metabolisch aktiven Bakterien ist in den weniger verdünnten Proben zu finden. Nach dieser Entwicklung kann diese Technik von Forschern aus den Bereichen Nutrigenomik oder Pharmakomikrobiomik genutzt werden, um den Wirt mikrokosmisch zu untersuchen. Nach diesem Protokoll können andere Techniken wie Transkriptom oder Stoffwechselanalyse durchgeführt werden, um ein mechanistisches Verständnis für den erfolgreichen Besiedlungsprozess entsprechend zu erhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein komplexes In-vitro-Modell erstellt, das für die Verdauungsprozesse repräsentativ ist, einschließlich der Wechselwirkung zwischen den Wirtszellen und dem Rest des Mikrobioms. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit pathogenen Bakterien äußerst gefährlich sein kann und es wichtig ist, Vorsichtsmaßnahmen für die biologische Sicherheit zu berücksichtigen.