Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Endokrinologie sowie der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. unsere Forschung zur Überprüfung der Reaktionen des Gehirns auf endokrine Signale. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die direkten Auswirkungen endokriner Signale auf das Gehirn getrennt von anderen Geweben untersuchen können. Um dieses Verfahren zu beginnen, kratzen Sie mit einer Pinzette die untere Mitte einer Plastikkulturschale, um eine Delle zu erzeugen, um das Ventralganglion des Larvengehirns nach der Dissektion leichter zu befestigen.

Gib mit einem Zahnstocher einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf jede Seite der Delle und befestige einen Wolframstab an dem Kleber. Machen Sie dann mit einem kleinen Stück kittähnlichem, wiederverwendbarem Klebstoff eine kreisförmige Wand, die die Delle umgibt. Um das Larvengehirn zu sezieren, sammeln Sie 90 bis 120 Stunden nach der Eiablage die Larven und waschen Sie sie mindestens dreimal mit destilliertem Wasser, um anhaftende Speisereste zu entfernen.

Legen Sie als Nächstes eine Larve auf ein quadratisches, eineinhalb Zoll großes Uhrenglas, das mit eiskaltem PBS gefüllt ist. Greife mit einer Pinzette vorsichtig nach dem mittleren Teil der Larve. Verwenden Sie eine weitere Pinzette, um die Mundhaken zu greifen und vorsichtig daran zu ziehen, um den vorderen Teil der Larve, der das Gehirn enthält, vom Rest des Körpers zu trennen.

Halten Sie dann die vordere Spitze mit der Pinzette fest und drehen Sie die Larve auf links. Entfernen Sie das Fremdgewebe, das am Gehirn befestigt ist, wie z. B. Imaginalscheiben, Fettkörper und Ringdrüse. Trennen Sie vorsichtig das Gehirn von den Mundwerkzeugen.

Tragen Sie anschließend 200 Mikroliter PBS auf die Innenseite des zuvor in der Bildgebungskammer vorbereiteten Kleberings auf. Saugen Sie das präparierte Gehirn vorsichtig mit PBS in eine Pasteur-Pipette und übertragen Sie es in die Bildgebungskammer. Fassen Sie in der Bildgebungskammer die Muskelfasern, die sich von den ventralen Ganglien erstrecken, und führen Sie das Gehirn vorsichtig in die Delle unter dem Wolframdraht ein.

Ziehen Sie dann den Wolframdraht leicht nach oben, um das Gehirn in die richtige Position für die Bildgebung zu bringen. Um Kalziumfluoreszenzbilder zu erhalten, legen Sie die Bildgebungskammer mit dem Gehirnexplantat unter das Mikroskop. Senken Sie die Objektivlinse, bis sie das PBS berührt, und positionieren Sie das Gehirn unter Hellfeldbeleuchtung und stellen Sie es in den Fokus.

Schalten Sie auf Fluoreszenzlicht um und stellen Sie den Fokus auf die mit GCaMP success markierten Zellen ein. Starten Sie die Aufnahme bei 250 ms/Frame bei einer Auflösung von 512 x 512 Pixeln im wassergekühlten Modus. Passen Sie dann die Belichtungszeit an, um die Fluoreszenzwerte innerhalb des Dynamikbereichs der CCD-Kamera zu erhalten, jedoch nicht niedriger als 1000 beliebige Einheiten mit 16-Bit-Bildern.

Sobald die Bildgebungsparameter bestimmt sind, nehmen Sie die Bilder eine Minute lang auf, bevor Sie das Peptid verabreichen, um die Signalintensität zu Beginn zu ermitteln. Anschließend wird das Testpeptid direkt angewendet, indem 100 Mikroliter der vorbereiteten Peptidlösung in das Larvenbad pipettiert werden. Zeichnen Sie die erfolgreiche GCaMP-Emission einige Minuten lang auf.

Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie die Analysesoftware und verwenden Sie das erste Frame, das vor der Peptidapplikation war, als Referenzbild. Wählen Sie dann Plugins, TurboReg aus. Wählen Sie die Serienabbilddatei als Quelle und das Referenzabbild als Ziel aus.

Aktivieren Sie als Nächstes Steifer Körper und Präzise für die Verarbeitungsmethode bzw. Qualität. Klicken Sie anschließend auf Stapel, um die Bildverarbeitung zu starten. Wählen Sie mehrere interessante Bereiche aus, indem Sie Analysieren, Tools, ROI-Manager in der Bildleiste verwenden.

Messen Sie dann die Pixelintensität, indem Sie im Fenster ROI-Manager auf Mehr, Mehrfachmessung, OK klicken. In diesem Experiment wurde das Wildtyp-Gehirn CCHa2, Ghrelin und Nociceptin ausgesetzt, während das CCHa2-Rezeptor-mutierte Gehirn CCHa2 ausgesetzt wurde. GCaMP6-Signale in insulinproduzierenden Zellen wurden durch konfokale Mikroskopie bei 250 ms/Bild detektiert, und hier sind die Standbilder ausgewählter Zeitpunkte.

Das Verhältnis der Änderung der ROI-Intensität zur Signalintensität zu jedem Zeitpunkt wurde grafisch dargestellt. ROIs wurden auf Zellkörper gesetzt, die in der gleichen Fokusebene detektiert wurden. Die durchgezogenen Linien geben den Mittelwert von fünf bis 10 Stichproben an, und die gestrichelten Linien markieren die oberen und unteren Grenzen des Standardfehlers des Mittelwerts.

Die schattierten Bereiche zeigen die Variation der Signale in den Experimenten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig vorgeformt ist. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Gehirnprobe schnell vorzubereiten, um Schäden zu vermeiden.

Dieses Verfahren kann mit der Genetik kombiniert werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. zur Rezeptorspezifität zu beantworten. Das in diesem Protokoll verwendete System ist einfach vorzubereiten und wiederverwendbar. Daher wird dieses Protokoll nützlich sein, z. B. beim Screening.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Endokrinologie und Neurowissenschaften, um hormonelle Netzwerke zu erforschen, die die Gehirnfunktion in Drosophila steuern.