Name: Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Lernen Sie das Ex-Vivo-Calcium-Imaging zur Untersuchung neuronaler Reaktionen auf endokrine Signale im Drosophila-Gehirn. Diese Methode ermöglicht die direkte Analyse hormoneller Einflüsse auf das Nervensystem.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid für wissenschaftliche Forschung (15K 07147, 17K 07419) von JSPS (Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), ein Inamori Foundation Research Grant (auf HI) und das Programm der gemeinsamen Nutzung/Forschungsstelle für Entwicklungsstörungen Medizin bei Das Institut für Molekulare Embryologie und Genetik, Kumamoto Universität (HS). Wir danken Dr. Azusa Kamikouchi und Herr Daichi Yamada für ihre Hilfe im Umgang mit dem abbildenden System.

1. Vorbereitung des larvalen Gehirn Explantaten
<ol><li>Machen Sie eine bildgebende Kammer. Hinweis: Stabile Aufnahme erfordert, dass die Gehirn Explantaten angebunden werden. Hier ist eine günstige, handgefertigte bildgebende Kammer in die Ca2 + imaging-System verwendet.<ol>
<li>Mit Pinzette, kratzen Sie unten in der Mitte von einem Kunststoff Kulturschale (35 mm x 10 mm) erstelle ich eine delle für die ventralen Ganglion des larvalen Gehirns machen Montage einfacher (Schritt 1.3, Abbildung 1).</li>
		<li>Platzieren Sie mit einem Zahnstocher einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf beiden Seiten der delle und legen Sie einen Wolfram-Stab (0,125 mm Durchmesser, 6 bis 7 mm Länge) auf den Leim.</li>
		<li>Verwenden ein kleines Stück wiederverwendbare Kitt-wie Kleber, machen eine Ringmauer (10 mm im Durchmesser und 3 mm hoch) rund um die delle (Abbildung 1). Hinweis: Der Raum im Inneren der Wand wird später gefüllt werden mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M PO43-, pH-Wert 7,4 ± 0,05 bei 25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tierische Vorbereitung Hinweis: Für das Kalzium Imaging, wird ein Indikator für Kalzium, GCaMP6s, in der Zelle Art von Interesse, ausgedrückt, häufig mit Kombinationen von gewebespezifischen GAL4 und FH-GCaMP6serreicht ist. Um sicherzustellen, dass das Signal durch den Kandidaten-Rezeptor vermittelt wird, drückt sich GCaMP6s auch in einen mutierten Rezeptor defekt.<ol>
<li>Wenn experimentelle Vergleiche für verschiedene Genotypen wie Wildtyp und Mutanten erforderlich sind, Altern Sie Spiel Test Larven zur Vermeidung von GCaMP6 Ausdruck Ebene Variationen und physiologischen Unterschiede aufgrund der Entwicklungsphasen.</li>
		<li>Halten Sie Eltern fliegen (30 fliegen für jedes Geschlecht) in einem kulturfläschchen mit standard fliegen Essen für 8 h zur Eiablage auf die Oberfläche der Lebensmittel ermöglichen. Kultur-Larven in der Masse unter einen 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 ° C und 60-70 % relativer Luftfeuchtigkeit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissektion des larvalen Gehirns<ol>
<li>Bei 90-120 h nach der Eiablage (AEL) sammeln Sie Larven und waschen Sie sie mindestens 3 Mal mit destilliertem Wasser, anhaftende Speisereste zu entfernen.</li>
		<li>Ort eine Larve auf einem quadratischen 1,5-Zoll-Uhrglas gefüllt mit Eis kaltem PBS. Hinweis: Die nächsten beiden Schritte werden in diesem Uhrglas unter dem sezierenden Mikroskop durchgeführt.</li>
		<li>Verwenden Sie Zange, sanft den Mittelteil der Larve greifen. Verwenden Sie eine andere Zange zu greifen die Mund-Haken und ziehen die Mund Haken vorsichtig, um den vorderen Teil der Larve, enthält das Gehirn vom Rest des Körpers zu trennen. Hinweis: Alternativ können chirurgische Scheren verwendet werden.</li>
		<li>Halten Sie die vordere Spitze von Pinzetten und umkrempeln Sie die Larve. Entfernen Sie überflüssige Gewebe des Gehirns, z. B. Ring Drüse imaginalen Festplatten und Fett Körper befestigt. Trennen Sie vorsichtig das Gehirn aus der Mundwerkzeuge.</li>
		<li>Das Innere der Ring aus der Kitt-ähnliche wiederverwendbaren Klebstoff in der bildgebenden Kammer zuweisen Sie 200 µL PBS. Saugen Sie sezierten Gehirns mit PBS in einer Pasteurpipette sanft zu, und übertragen Sie es dann in die bildgebenden Kammer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Einstellung des Gehirns in der bildgebenden Kammer<ol>
<li>Verwenden Sie die Zange, um Muskelfasern erstreckt sich von der ventralen Ganglien zu greifen. Legen Sie das Gehirn sanft in die delle unterhalb der wolframdraht.</li>
		<li>Eine andere Zange, ziehen den wolframdraht leicht bis zu platzieren das Gehirn an der richtigen Stelle für imaging (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Erwerb von Ca2 + Fluoreszenzbilder
Hinweis: Gehirn Explantaten inmitten der PBS sind abgebildet mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einer 20 X Eintauchen in Wasser Objektiv ausgestattet (N.V. = 0,5). PBS wird nicht Zellen im Gehirn aktiviert. Wenn z-Bilder benötigt werden, ist das Objektiv mit einem Piezo-aktivierte Objektiv Mover montiert. Eine drehende Scheibe konfokale Kopf wird verwendet, um die zeitliche Auflösung zu verbessern. Für Low-Light-Bildgebung ist ein Elektron Multiplikation – Coupled Ladegerät Kamera am Mikroskop montiert. Die Darstellung der GCaMP6s Fluoreszenz (Anregung/Emission: 488/509 nm) erfordert einen 488 nm Laser Erregung mit ein dichroitischer Strahlteiler und eine Emission Filter (zB., 528 ± 38 nm Band Bandpass-Filter).
<ol><li>Ort der bildgebenden Kammer, die das Gehirn Explant unter die Lupe genommen.</li>
	<li>Senken Sie das Objektiv bis zum Anschlag der PBS. Positionieren Sie unter Hellfeld Beleuchtung das Gehirn und in den Vordergrund zu bringen. Wechseln Sie zu fluoreszierendes Licht und stellen Sie den Fokus auf die GCaMP6s-markierten Zellen. Hinweis: Die basalen grüne Fluoreszenz der GCaMP6s sollte sichtbar sein.</li>
	<li>Beginnen bei 250 ms/Rahmen bei einer Auflösung von 512 × 512 Pixel in wassergekühlten Modus mithilfe der entsprechenden Datenerfassungs-Software (zB., µManager). Passen Sie die Belichtungszeit um Fluoreszenz-Werte innerhalb des dynamischen Bereichs der CCD Kamera erhalten, aber nicht weniger als 1000 (willkürliche Einheiten), mit 16-Bit-Bilder (Dynamikumfang 0-65.535). Hinweis: Eine geringe Belichtungszeit sollte verwendet werden, um Foto-Bleichen von den GCaMP6s zu minimieren. Belichtungszeit sollte in jedem Experiment optimiert werden, da sie von den Ausdruck GCaMP6 und die Empfindlichkeit des Detection System abhängt. Es war 100 ms in unserem Experiment mit dilp2 > GCaMP6s. Wenn Z-Profile für eine bestimmte bildgebende Tiefe erforderlich sind, können mehrere Z-Abschnitt Bilder je nach der Belichtung Zeit und Frame Abständen erworben werden. Falls die Kamera genügend räumlichen Auflösung verfügt, sollte binning Größe (Anzahl der Register auf dem Chip, der in einem digitalen Pixel klassifiziert wird) erhöht werden, um die Belichtungszeit zu reduzieren.</li>
	<li>Nachdem bildgebende Parameter ermittelt wurden, nehmen Sie Bilder für 1 min vor der Verabreichung von Peptid, Grundlinie Signalintensitäten (F0) zu erkennen.</li>
	<li>Gelten Sie das Test-Peptid; Hierzu auflösen 100 µL peptidlösung mit PBS-Puffer und pipette es direkt in die Larven Wanne um eine optimale Konzentration zu erzielen. Hinweis: Sollte die peptidlösung langsam injiziert werden (z.B. Flow Rate 20 µL/s) in die Badewanne-Lösung mit einer Pipette. Unabhängigen synthetischen Peptid, aufgelöst in PBS dient als Negativkontrolle.</li>
	<li>Die Emission von GCaMP6s für ein paar Minuten aufzeichnen.</li>
</ol>(3) Datenanalyse
Hinweis: Imaging-Daten werden mit der ImageJ offline analysiert. Während die Zeitraffer-Bildgebung verursacht pipettieren der Larven Gehirn zu bewegen. Positionelle Aberrationen der seriellen Bilder sollten daher vor der Analyse korrigiert werden. Die Korrektur kann mit einem ImageJ-Plug-in, TurboReg wie folgt durchgeführt werden.
<ol><li>Öffnen Sie die Analysesoftware und verwenden Sie den ersten Frame (vor Peptid Anwendung) als ein Referenzbild.</li>
	<li>Wählen Sie Plugins | Anmeldung | TurboReg.</li>
	<li>Wählen Sie die serielle Image-Datei als Quelle und die Referenz-Bild als Ziel.</li>
	<li>Überprüfen Sie Rigid Body (Parallelverschiebung und Drehung der Bilder) und präzise ("Schnell" ist grob aber schnelle Analyse stattdessen) bzw. für die Verarbeitung und Qualität.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Batch um die Bildbearbeitung zu starten.</li>
	<li>Wählen Sie mehrere Regionen von Interesse (ROIs) mittels Analyse | Werkzeuge | ROI-Manager in ImageJ.</li>
	<li>Die Pixel-Intensität zu messen, indem Sie mehr auf | Multi-Maßnahme | OK im ROI-Manager-Fenster.</li>
	<li>Berechnen Sie ΔF/F0 = (F - F0) / f0, F ist die ROI-Intensität zum Zeitpunkt des Reizes, wobei F0 ist die Intensität auf ein Zeitfenster unmittelbar vor einem bestimmten experimentellen Ereignis (z. B. 30 frames vor dem Stimulus Onset).</li>
	<li>Wiederhole das Experiment mit mehreren Gehirn Proben, Durchführung von statistischen Verarbeitung um den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwertes (SEM) zu jedem Zeitpunkt zu erhalten.</li>
</ol>

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<li>Apostolopoulou, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+Taste+Signaling+in+Drosophila+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193(2016).</li>
<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
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<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Ca2 + imaging hier beschriebene Methode ist ein nützliches System zum Testen der Funktion der Hormone im Gehirn. In-vivo, das Gehirn erhält Hormone von verschiedenen endokrinen Organen. Darüber hinaus sieht das Gehirn ständig aufsteigende sensorische Informationen, wodurch spontanen neuronalen Aktivierung. Diese ex-Vivo -System beseitigt wie Lärm und ergibt ein besseres Signal-Rauschverhältnis als in-Vivo Bildgebung. In diesem System können Moleküle einzeln oder in Kombination ge...

Orgel, Orgel-Kommunikation ist eine evolutionär konservierte Strategie für die Aufrechterhaltung der Homöostase um Veränderungen der Umwelt gerecht zu werden. Bei Menschen, eine Vielzahl von Hormonen Arereleased von den endokrinen Drüsen in den Blutkreislauf. Viele dieser Hormone gezielt im Hypothalamus des Gehirns, die Stoffwechselprozesse und grundlegende Verhaltensweisen wie Fütterung1,2regelt. Viele Hormone sind mit Säugetieren Modelle entdeckt worden. Die Mechanismen ihres Handelns, vor allem die interorgan Netzwerke, an denen sie teilnehmen, bleiben jedoch weitgehend unklar.
Drosophila Melanogaster hat ein nützliches Modell für das Studium der Orgel, Orgel-Kommunikation entwickelt. Bei Insekten sind viele physiologische Prozesse durch Hormone gesteuert. Frühe Studien mit Schwerpunkt auf Wachstum und Metamorphose verwendet große Insekten. In diesen Studien vorhergesagt die Entfernung oder die Transplantation von bestimmten Organen die Existenz von Inter Orgel Signalmoleküle; später wurden Juvenilhormon (JH), Prothoracicotropic Hormon (PTTH) und Ecdyson biochemisch gereinigten3,4,5. Eine große Familie von interzellulären Signalisierung Peptide wird gedacht, um während der Insekten Lebenszyklus6,7in verschiedenen physiologischen Ereignisse einbezogen werden. Die meisten dieser Peptide wirken auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), obwohl die spezifische GPCRs zunächst schwer zu identifizieren, mit herkömmlichen Ansätzen waren. Die Veröffentlichung der Drosophila ganze Genom-Sequenz8 war der Durchbruch, der die Identifizierung von Drosophila bioaktiven Peptiden basierend auf ihre Homologie mit denen in anderen Insekten aktiviert. Darüber hinaus wurden die Rezeptoren für verschiedene Peptide von GPCRs vorhergesagt im Genom mit Kultur-zellbasierte GPCR-Ligand verbindliche Tests identifiziert. Als nächstes vorhergesagt Expressionsanalysen die Orgel, Orgel-Wege ausgelöst durch diese Peptide und Rezeptoren. Insbesondere werden viele der vermeintlichen Peptid-Rezeptoren ausgedrückt im Gehirn, was darauf hindeutet, dass das Gehirn ein wichtiges Ziel von Peptid-Hormone-9. Darüber hinaus haben die genetische Sonderwerkzeuge in Drosophila zur Identifizierung der physiologischen Rollen von Peptid-GPCR Kombinationen beigetragen. Zum Beispiel ermöglichen die GAL4 und LexA binäre transkriptionelle basierenden gen-Knockdown oder Überexpression räumlich und zeitlich kontrolliert. GAL4, einen Transkriptionsfaktor identifiziert in Hefe, bindet an eine bestimmte Cis-regulatorische Sequenz genannt Upstream Aktivierung Sequenz (FH). In das GAL4/UAS-System die Treiber Line bietet gewebespezifischen oder Bühne-spezifische GAL4 Ausdruck und die Responder-Linie trägt UAS stromaufwärts des Gens von Interesse oder das Konstrukt Laufwerk ShRNA Ausdruck. LexA/LexAop System basiert auf einem ähnlichen Mechanismus. Phänotypische Analysen der gewebespezifischen Peptid-Zuschlag und gewebespezifische GPCR-Zuschlag Tiere können Informationen über die Peptid-GPCR Signalisierung Modus und Ort des Geschehens zeigen. Allerdings beschränken sich die Schlussfolgerungen, die allein durch genetische Daten erreicht werden können. Auf der anderen Seite sobald das vermeintliche Ziel ein bestimmtes Peptidhormon zu einem Gewebe oder Zellen Typ eingegrenzt, ex Vivo Kalzium imaging in Orgel Explantaten lässt sich die Orgel, Orgel-Kommunikation vermittelt durch Peptid-GPCR Signalisierung zu erhellen. Nach der Aktivierung eine Gq gekoppelt GPCR wird die intrazelluläre Ca2 + Konzentration durch die Freisetzung von Ca2 + aus dem ER10erhöht. Im Gehirn erhebt neuronalen Aktivierung auch die intrazellulären Ca2 + Ebenen. Diese Ca2 + Erhöhungen können durch eine Kalzium-Sensor, GCaMP, erkannt werden die Konformationsänderungen im Beisein von Ca2 + was Fluoreszenz Emission11erfährt.
In diesem Artikel wird ein Kalzium, die bildgebendes Verfahren mit Drosophila Gehirn explants beschrieben. Um die Fähigkeit eines Peptids, spezifische Neuronen aktivieren zu testen, wird eine Test-Peptid auf GCaMP exprimierenden Gehirn Explant angewendet und Fluoreszenz-Änderungen werden von konfokalen Mikroskopie überwacht. Die Einbeziehung der GPCR ist dann bestätigt, indem Sie den gleichen Test mit einem mutierten Gehirn fehlt der GPCR durchführen. Diese Kombination von Bildgebung und Genetik liefert präzise Informationen über die Orgel, Orgel-Kommunikation durch Peptide-GPCRs. möglich Änderungen und Anwendungen dieses Protokolls werden ebenfalls behandelt.

<table><tbody><tr><td>Wolframstab</td><td>A-M Systeme, Sequim, WA, USA</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, Paris, Frankreich</td><td>3049100</td><td>kittartige wiederverwendbare Klebstoffe</td></tr><tr><td>Uhrenglas, quadratisch, 1 5/8 in</td><td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td><td>T900</td><td>Phosphatierte gepufferte Salze</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tokio, Japan</td><td></td><td>Custum-synthetisiertes Peptid</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptide Institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nociceptin</td><td>Peptide Institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4313-v</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland</td><td>Axio Imager A2</td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Objektiv W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland</td><td>420957-9900-000</td><td>Wasser-Immersionsobjektiv</td></tr><tr><td>P-725 PIFOC Objektivscanner mit großem Verfahrweg</td><td>Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland</td><td>N/A</td><td>piezoelektrisch aktivierter Lens Mover</td></tr><tr><td>Konfokale Scannereinheit CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tokio, Japan</td><td>CSU-W1</td><td>Konfokalkopf mit rotierender Scheibe</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td><td>C9100-13</td><td>EM-CCD-Kamera</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td>1178770</td><td>488-nm Laser</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Yokogawa dichroitischer Strahlteiler</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0,5</td><td>dichroitischer Strahlteiler</td></tr><tr><td>528/38 nm BrightLine Singleband-Bandpassfilter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>FF01-528/ 38-25</td><td>Emissionsfilter</td></tr> <tr><td>&Mikro; Geschäftsführer</td><td>von Open Imaging, Inc.</td><td>N/A</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>U. S. National Institutes of Health</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&eacute; venaz, Biomediccal Imaging Group, Eidgenössische Technische Hochschule Lausanne</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

ex-vivo calcium imaging zur visualisierung von gehirn reaktionen auf endokrine signalisierung bei drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Orgel, Orgel-Kommunikation durch endokrine signalisieren, beispielsweise ist von der Peripherie zum Gehirn, unerlässlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase. Drosophila Melanogaster, die genetische Werkzeuge und Genominformationen anspruchsvoll ist, wird als Modell Tier für endokrine Forschung verstärkt eingesetzt. Dieser Artikel beschreibt eine Methode für die Kalzium-Bildgebung von Drosophila Gehirn Explantaten. Diese Methode ermöglicht die Erkennung von der direkten Signalisierung eines Hormons im Gehirn. Es ist bekannt, dass viele Peptidhormonen durch G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) handeln, dessen Aktivierung eine Erhöhung der intrazellulären Ca2 +Konzentration bewirkt. Neuronalen Aktivierung erhebt auch intrazelluläre Ca2 + Ebenen, von Ca2 + Zustrom und die Freisetzung von Ca2 + in das endoplasmatische Retikulum (ER) gespeichert. Ein Kalzium-Sensor, GCaMP, kann diese Ca2 + Änderungen überwacht werden. Bei dieser Methode wird GCaMP in den Neuronen des Interesses ausgedrückt, und das GCaMP mit dem Ausdruck ihrer Larven Gehirn seziert und kultiviert ex Vivo. Das Test-Peptid ist dann auf das Gehirn Explant angewendet, und die fluoreszierenden Änderungen in GCaMP werden erkannt mit einer drehenden Scheibe confocal Mikroskop mit einer CCD-Kamera ausgestattet. Mit dieser Methode ein wasserlösliches Molekül kann getestet werden, und verschiedene zelluläre Ereignisse im Zusammenhang mit neuronalen Aktivierung können mit Hilfe der entsprechenden fluoreszierenden Indikatoren abgebildet werden. Darüber hinaus kann durch Ändern der bildgebenden Kammer, diese Methode verwendet werden, zum anderen Drosophila Organe oder Organe anderer Tiere Bild.

Unter Verwendung dieses Protokolls, wurde die Aktivierung des Gehirns Insulin-produzierenden Zellen (IPCs) durch das Peptidhormon, CCHa2, untersucht. IPCs des Wildtyp Gehirns wurden mit GCaMP6s beschriftet mit einer Kombination aus dilp2 -GAL412 (ein Geschenk von Dr. Rulifson) und FH-GCaMP6s13 (ein Geschenk von Dr. Kim). Larval Gehirn Explantaten mit einem synthetischen CCHa2 Peptid behandelt wurden, und die Fluoreszenz von...

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die ex-Vivo Calcium Bildgebung des Gehirns Drosophila . Bei dieser Methode können der Puffer, testen Sie ihre Fähigkeit, bestimmte Nervenzellen im Gehirn zu aktivieren natürliche oder synthetische Verbindungen zugewiesen werden.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Endokrinologie sowie der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. unsere Forschung zur Überprüfung der Reaktionen des Gehirns auf endokrine Signale. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die direkten Auswirkungen endokriner Signale auf das Gehirn getrennt von anderen Geweben untersuchen können. Um dieses Verfahren zu beginnen, kratzen Sie mit einer Pinzette die untere Mitte einer Plastikkulturschale, um eine Delle zu erzeugen, um das Ventralganglion des Larvengehirns nach der Dissektion leichter zu befestigen.Gib mit einem Zahnstocher einen kleinen Tropfen Sekundenkleber auf jede Seite der Delle und befestige einen Wolframstab an dem Kleber. Machen Sie dann mit einem kleinen Stück kittähnlichem, wiederverwendbarem Klebstoff eine kreisförmige Wand, die die Delle umgibt. Um das Larvengehirn zu sezieren, sammeln Sie 90 bis 120 Stunden nach der Eiablage die Larven und waschen Sie sie mindestens dreimal mit destilliertem Wasser, um anhaftende Speisereste zu entfernen.Legen Sie als Nächstes eine Larve auf ein quadratisches, eineinhalb Zoll großes Uhrenglas, das mit eiskaltem PBS gefüllt ist. Greife mit einer Pinzette vorsichtig nach dem mittleren Teil der Larve. Verwenden Sie eine weitere Pinzette, um die Mundhaken zu greifen und vorsichtig daran zu ziehen, um den vorderen Teil der Larve, der das Gehirn enthält, vom Rest des Körpers zu trennen.Halten Sie dann die vordere Spitze mit der Pinzette fest und drehen Sie die Larve auf links. Entfernen Sie das Fremdgewebe, das am Gehirn befestigt ist, wie z. B. Imaginalscheiben, Fettkörper und Ringdrüse. Trennen Sie vorsichtig das Gehirn von den Mundwerkzeugen.Tragen Sie anschließend 200 Mikroliter PBS auf die Innenseite des zuvor in der Bildgebungskammer vorbereiteten Kleberings auf. Saugen Sie das präparierte Gehirn vorsichtig mit PBS in eine Pasteur-Pipette und übertragen Sie es in die Bildgebungskammer. Fassen Sie in der Bildgebungskammer die Muskelfasern, die sich von den ventralen Ganglien erstrecken, und führen Sie das Gehirn vorsichtig in die Delle unter dem Wolframdraht ein.Ziehen Sie dann den Wolframdraht leicht nach oben, um das Gehirn in die richtige Position für die Bildgebung zu bringen. Um Kalziumfluoreszenzbilder zu erhalten, legen Sie die Bildgebungskammer mit dem Gehirnexplantat unter das Mikroskop. Senken Sie die Objektivlinse, bis sie das PBS berührt, und positionieren Sie das Gehirn unter Hellfeldbeleuchtung und stellen Sie es in den Fokus.Schalten Sie auf Fluoreszenzlicht um und stellen Sie den Fokus auf die mit GCaMP success markierten Zellen ein. Starten Sie die Aufnahme bei 250 ms/Frame bei einer Auflösung von 512 x 512 Pixeln im wassergekühlten Modus. Passen Sie dann die Belichtungszeit an, um die Fluoreszenzwerte innerhalb des Dynamikbereichs der CCD-Kamera zu erhalten, jedoch nicht niedriger als 1000 beliebige Einheiten mit 16-Bit-Bildern.Sobald die Bildgebungsparameter bestimmt sind, nehmen Sie die Bilder eine Minute lang auf, bevor Sie das Peptid verabreichen, um die Signalintensität zu Beginn zu ermitteln. Anschließend wird das Testpeptid direkt angewendet, indem 100 Mikroliter der vorbereiteten Peptidlösung in das Larvenbad pipettiert werden. Zeichnen Sie die erfolgreiche GCaMP-Emission einige Minuten lang auf.Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie die Analysesoftware und verwenden Sie das erste Frame, das vor der Peptidapplikation war, als Referenzbild. Wählen Sie dann Plugins, TurboReg aus. Wählen Sie die Serienabbilddatei als Quelle und das Referenzabbild als Ziel aus.Aktivieren Sie als Nächstes Steifer Körper und Präzise für die Verarbeitungsmethode bzw. Qualität. Klicken Sie anschließend auf Stapel, um die Bildverarbeitung zu starten. Wählen Sie mehrere interessante Bereiche aus, indem Sie Analysieren, Tools, ROI-Manager in der Bildleiste verwenden.Messen Sie dann die Pixelintensität, indem Sie im Fenster ROI-Manager auf Mehr, Mehrfachmessung, OK klicken. In diesem Experiment wurde das Wildtyp-Gehirn CCHa2, Ghrelin und Nociceptin ausgesetzt, während das CCHa2-Rezeptor-mutierte Gehirn CCHa2 ausgesetzt wurde. GCaMP6-Signale in insulinproduzierenden Zellen wurden durch konfokale Mikroskopie bei 250 ms/Bild detektiert, und hier sind die Standbilder ausgewählter Zeitpunkte.Das Verhältnis der Änderung der ROI-Intensität zur Signalintensität zu jedem Zeitpunkt wurde grafisch dargestellt. ROIs wurden auf Zellkörper gesetzt, die in der gleichen Fokusebene detektiert wurden. Die durchgezogenen Linien geben den Mittelwert von fünf bis 10 Stichproben an, und die gestrichelten Linien markieren die oberen und unteren Grenzen des Standardfehlers des Mittelwerts.Die schattierten Bereiche zeigen die Variation der Signale in den Experimenten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig vorgeformt ist. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Gehirnprobe schnell vorzubereiten, um Schäden zu vermeiden.Dieses Verfahren kann mit der Genetik kombiniert werden, um zusätzliche Fragen wie z.B. zur Rezeptorspezifität zu beantworten. Das in diesem Protokoll verwendete System ist einfach vorzubereiten und wiederverwendbar. Daher wird dieses Protokoll nützlich sein, z. B. beim Screening.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Endokrinologie und Neurowissenschaften, um hormonelle Netzwerke zu erforschen, die die Gehirnfunktion in Drosophila steuern.

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Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir beschreiben eine etablierte Technik zur Messung und Analyse Gerüche hervorgerufene Kalzium-Reaktionen im Antennallobus...

Calcium Imaging von geruchs-evozierte Potentiale in der Drosophila Antennallobus

Dieses Video beschreibt die In-vivo-Calcium-Bildgebung in Drosophila-Neuronen mit GCaMP. Der vorgestellte Protokollclip zeigt, wie Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz von Pilzkörperneuronen während eines olfaktorischen Konditionierungsexperiments aufgezeichnet werden können.

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: Eine Methode zur funktionellen Bildgebung neuronaler Aktivität

Dieses Video demonstriert eine Methode zur in vivo Kalziumbildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren in Fliegen. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Fliegen für die Mikroskopie, zur Durchführung der olfaktorischen Konditionierung und zur Visualisierung des geruchsinduzierten Kalziumeinstroms.

im lebenden Organismus Calcium-Imaging mit synaptisch lokalisierten Calciumsensoren in Drosophila melanogaster

Quelle: Ishimoto, H. et. al., Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Visualisierung der Gehirnreaktionen auf endokrine Signalwege bei Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) Dieses Video zeigt die Kalziumbildgebung zur UntersuchungDrosophila Gehirnreaktionen auf Neuropeptide. Neuronen, die einen fluoreszierenden Kalziumindikator exprimieren, zeigen die intrazelluläre Kalziumdynamik und funktionelle Reaktionen auf Signalmoleküle.

Ex-vivo-Calcium-Bildgebung zur Untersuchung der Reaktionen des Drosophila-Gehirns auf Neuropeptide

Quelle: Lark, A. R., et. al., In-vivo-Ansatz zur funktionellen Bildgebung des Gehirns basierend auf dem biolumineszierenden Calciumindikator GFP-Aequorin. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt die Echtzeit-Bildgebung der Kalziumdynamik mit Green fluoreszierende Protein-Aequorin-Biolumineszenz in den tiefen Hirnstrukturen von Drosophila.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Untersuchung von Kalziumtransienten in Drosophila-Gehirnstrukturen

Die Vorderbeine und der Rüssel von Drosophila enthalten ein reiches Repertoire an geschmacklichen sensorischen Neuronen. Hier stellen wir eine Methode vor, die Calcium-Imaging verwendet, um physiologische Reaktionen von sensorischen Neuronen im Vorderbein und Rüssel lebender Fliegen nach exogener Applikation eines gustatorischen Pheromons zu messen.

Mess physiologischen Reaktionen von<em&gt; Drosophila</emNeurone&gt; Sensory zu Lipid Pheromone Verwendung von Live-Calcium Imaging

Hier präsentieren wir eine neuartige Ca 2+ -Imaging Ansatz unter Verwendung eines Biolumineszenz Reporter. Dieser Ansatz verwendet einen fusionierten Konstrukts GFP-Aequorin, das Ca 2+ bindet und emittiert Licht, wodurch die Notwendigkeit für Lichtanregung. Deutlich Dieses Verfahren ermöglicht lange kontinuierliche Bildgebung, Zugang zu tiefen Hirnstrukturen und hoher zeitlicher Auflösung.

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Dieser Artikel beschreibt ein anpassungs ex vivo - Protokoll zur Visualisierung von Ca 2+ während Eiaktivierung in Drosophila.

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.

In Vivo Optische Calcium-Bildgebung der lerninduzierten synaptischen Plastizität bei Drosophila melanogaster

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die ex vivo Kalziumbildgebung in GCaMP6-exprimierenden adulten Drosophila vor, um epileptiforme Aktivitäten zu überwachen. Das Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung von iktalen Ereignissen in adulten Drosophila durch ex vivo Kalzium-Bildgebung und ermöglicht die Erforschung der potenziellen Mechanismen der Epilepsie auf zellulärer Ebene.

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Wir stellen Calcium-Bildgebungsprotokolle  für ein Drosophila-Larven-Geruchsneuron vor, bei denen ein topischer Gewebekleber zur Immobilisierung verwendet wird. Diese Methode erhöht die Stabilität und ermöglicht zuverlässige in-vivo- und ex-vivo-Experimente. Benutzerdefinierte R-Skripte analysieren Kalziumsignale und bieten eine effiziente Plattform für detaillierte neurophysiologische Forschung.

In-vivo- und ex-vivo-Calcium-Bildgebung eines Neurons des olfaktorischen Schaltkreises in der dritten Larve von Drosophila melanogaster im dritten Stadium

Lernen Sie das Ex-Vivo-Calcium-Imaging zur Untersuchung neuronaler Reaktionen auf endokrine Signale im Drosophila-Gehirn. Diese Methode ermöglicht die direkte Analyse hormoneller Einflüsse auf das Nervensystem.

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

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