Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren
19. April 2018
Wir präsentieren Ihnen eine automatisierte Methode zur dreidimensionalen Rekonstruktion der Keimbahn Caenorhabditis Elegans . Unsere Methode bestimmt die Anzahl und Position der jeder Kern in die Keimbahn und Analysen Keimbahn PROTEINVERTEILUNG und Zytoskeletts Struktur.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Analyse einer Caenorhabditis elegans-Keimbahn zu automatisieren, um ihre Zellkern-, Protein- und Zytoskelettverteilung zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen auf dem Gebiet der C.Elegans über die Anzahl der Zellkerne und Spermien, die Kernverteilung und die Zytoskelettstruktur der Keimbahn zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die Analysezeit verkürzt, die Stichprobengröße erhöht und den menschlichen Fehler eliminiert, der mit der manuellen Analyse verbunden ist.
Um die Proben abzubilden, legen Sie Objektträger mit gefärbten Keimbahnen in den Objektträgerhalter über dem 63X-Objektiv eines konfokalen Mikroskops und suchen Sie eine Keimbahn. Fokussieren Sie auf die Oberseite der Keimbahn und markieren Sie sie mit der Konfokalmikroskop-Software. Wenn die Gesamtdicke der Keimbahn bestimmt wurde, definieren Sie die Dicke jeder Scheibe bis zu 0,5 Mikrometer und markieren Sie die gesamte Keimbahn.
Starten Sie dann die Erfassung, scannen Sie jedes Slice achtmal und mitteln Sie die Werte, um die Bildqualität zu verbessern. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, importieren Sie die Bilder in ein geeignetes Bildanalysesoftwareprogramm und verwenden Sie das Oberflächenfunktionswerkzeug, um den mitotischen Bereich auszuwählen. Es erscheint ein Bild des distalen Endes der Keimbahn.
Brechen Sie den Assistenten für die automatische Oberflächenerstellung ab und zeichnen Sie manuell einen Interessenbereich um den mitotischen Bereich in der ersten und letzten Schicht des Bildes aus dem dreidimensionalen Stapel. Klicken Sie auf Oberfläche erstellen und dann auf Kanal maskieren, um alle Kanäle mit Ausnahme des DAPI-Kanals zu maskieren. Definieren Sie mit dem Spot-Funktionswerkzeug die Größenparameter des mitotischen Bereichs mit einem XY-Durchmesser von zwei Mikrometern und einem undefinierten Z-Durchmesser.
Klicken Sie auf Hintergrund subtrahieren, um den Hintergrund zu subtrahieren. Um den minimalen Schwellenwert zu definieren, erhöhen Sie den minimalen 3D-Rendering-Schwellenwert für eine DAPI-gefärbte Wildtyp-Keimbahn, bis der erste Punkt außerhalb der Keimbahn angezeigt wird, und generieren Sie ein 3D-Modell für jede Region. Klicken Sie nach dem Speichern der Bilder auf Tabelle, um die Anzahl der Kerne anzuzeigen, die von der Software automatisch generiert wird, und exportieren Sie die Bilder als TIFF-Dateien.
Erstellen Sie für die Übergangszone eine Oberfläche, wie zuvor beschrieben. Klicken Sie dann auf Kanal maskieren, um alle Kanäle mit Ausnahme des DAPI-Kanals zu maskieren. Definieren Sie mit der Spot-Funktion einen XY-Durchmesser von zwei Mikrometern und einen Z-Durchmesser von 1,5 Mikrometern und klicken Sie auf Hintergrund subtrahieren, um den Hintergrund zu subtrahieren.
Um den minimalen Schwellenwert zu definieren, erhöhen Sie den minimalen 3D-Rendering-Schwellenwert für eine DAPI-gefärbte Wildtyp-Keimbahn, bis der erste Punkt außerhalb der Keimbahn angezeigt wird, und generieren Sie ein 3D-Modell für jede Region. Klicken Sie nach dem Speichern der Bilder auf Tabelle, um die Anzahl der Kerne anzuzeigen, die von der Software automatisch generiert wird, und exportieren Sie die Bilder als TIFF-Dateien. Um die Spermienzahl zu bewerten, wählen Sie die Spermatheca als interessierende Region aus, wie für die Zellkernregionen gezeigt, und verwenden Sie das Spot-Funktionswerkzeug, um den XY-Durchmesser zwischen 0,75 und einem Mikrometer mit einem undefinierten Z-Durchmesser zu definieren, um jedes Spermium zu erkennen.
Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Hintergrundsubtrahierung und verwenden Sie die von der Software berechneten Hintergrundkorrekturwerte, um den Hintergrund zu subtrahieren. Passen Sie dann den 3D-Rendering-Schwellenwert an, um alle DAPI-gefärbten Spermien in der Spermatheca zu erkennen. Für die Chromosomenzählung in den Eizellen wählen Sie die Eizellen aus und definieren den XY-Durchmesser auf weniger als 0,75 Mikrometer und definieren den Schwellenwert, bevor Sie die 3D-Modelle entwickeln.
Speichern Sie dann die Bilder für den Export als TIFF-Dateien. Identifizieren Sie für die Rekonstruktion der Keimbahn des Zytoskeletts die mitotische Region von Interesse in der Keimbahn und erstellen Sie eine Oberflächenmaske, wie zuvor gezeigt. Klicken Sie auf Kanäle maskieren, um alle Kanäle mit Ausnahme des Phalloidinkanals zu maskieren, und verwenden Sie das Oberflächenfunktionswerkzeug, um einen Oberflächendetail von 0,25 Mikrometern zu definieren.
Nachdem Sie den Hintergrund subtrahiert haben, passen Sie den 3D-Rendering-Schwellenwert an, um das entwickelte 3D-Bild für den Export als TIFF-Datei zu speichern. Die Verteilung der Kerne ist abhängig von der Stufe der Differenzierung. In der mitotischen Region erscheint beispielsweise das innere Aktin als feste Masse, auf der die Kerne organisiert sind.
In einer Wildtyp-Keimbahn enthält die mitotische Region etwa 250 Zellkerne und ist im Vergleich zum Rest der Keimbahn dicht mit Zellkernen gefüllt. Wenn sich die Kerne jedoch vom distalen Ende entfernen, erscheinen sie näher am Umfang der Keimbahn, wobei die Verteilungsänderung in der Übergangszone beginnt und endet, wenn die Kerne in die dritte Phase der Prophase der Meiose eintreten. In der Übergangszone nimmt das innere Aktin der Keimbahn eine zylindrische Struktur an und wird beim Erreichen des Pachytens zu einem Hohlzylinder.
Die zweite Schicht aus Aktin bedeckt die innere Schicht und gibt der Keimbahn Form. Dieser Zylinder innerhalb einer Zylinder-Aktinstruktur verschwindet in Richtung der Eizellregion, woraufhin das Aktin als dicke Fasern erscheint, die die Eizellen bedecken. In der Spermatheca formt sich das Aktin ebenfalls zu dicken Faserbündeln, obwohl diese Fasern dichter beieinander zu liegen scheinen als in der Eizellregion.
Die dreidimensionale Darstellung des proximalen Endes der Keimbahn, wie gezeigt, zeigt durchschnittlich 151 Spermien in jeder Spermatheca. Einmal gemeistert, kann diese Analyse in 10 Minuten pro Keimbahn abgeschlossen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Analyseparameter entsprechend der Vergrößerung des Objektivs zu definieren, das zur Visualisierung der Keimbahn in Ihrem Experiment verwendet wird.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine automatische Analyse einer Keimbahn durchführt, die Struktur des Zytoskeletts untersucht und die Anzahl der Zellkerne in der Keimbahn bewertet.
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Überblick
Dieser Artikel stellt eine automatisierte Methode für die dreidimensionale Rekonstruktion der Keimbahn von Caenorhabditis elegans vor und konzentriert sich dabei auf die Analyse von Zellkernen, Proteinverteilung und Zytoskelettstruktur. Die Methode zielt darauf ab, die Effizienz und Genauigkeit der Keimbahnanalyse zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Entwicklungsbiologie
Hintergrund
- Das Verständnis der Keimbahnstruktur von C. elegans ist entscheidend für Entwicklungsstudien.
- Die manuelle Analyse von Keimbahnproben ist zeitaufwendig und fehleranfällig.
- Automatisierte Methoden können diesen Prozess optimieren.
- Frühere Techniken waren bei der Analyse großer Probenmengen nicht effizient.
Zweck der Studie
- Die Automatisierung der Analyse der C. elegans-Keimbahn.
- Genaue Bestimmung der Anzahl und Position von Zellkernen.
- Analyse der Proteinverteilung und Zytoskelettstruktur.
Verwendete Methoden
- Proben werden gefärbt und zum Bebildern auf Objektträger gelegt.
- Die Objektträger werden über einem 63x-Objektiv eines Konfokalmikroskops positioniert.
- Die Keimbahn wird lokalisiert und mithilfe der Konfokalsoftware markiert.
- Die Dicke der Keimbahn wird definiert und in 0,5 Mikrometer dicke Abschnitte geschnitten.
Hauptergebnisse
- Die Methode reduziert die Analysezeit erheblich.
- Sie erhöht die Probengröße, die analysiert werden kann.
- Der mit manueller Analyse verbundene menschliche Fehler wird minimiert.
- Eine genaue Abbildung von Zellkernen und Proteinverteilung wird erreicht.
Schlussfolgerungen
- Diese automatisierte Methode verbessert die Untersuchung der Keimbahn von C. elegans.
- Sie bietet einen zuverlässigen Ansatz zur Analyse komplexer biologischer Strukturen.
- Die Technik kann zukünftige Forschungen in der Entwicklungsbiologie erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Automated three-dimensional analysis of the C. elegans germline enables high-throughput phenotypic screening for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By quantifying nuclei distribution, protein localization, and cytoskeletal architecture, the method supports predictive confidence in genetic and pharmacological interventions. This approach reduces manual variability and increases reproducibility, facilitating scalable assay development for disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative mapping of nuclear positioning and protein expression patterns.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible readouts of germline architecture across genetic backgrounds.
- Predictive Value: Enhances target validation by correlating cytoskeletal changes with developmental phenotypes, aiding in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs for nuclei count, sperm number, and cytoskeletal structure to enable reliable compound screening.
- Operational Value: Increases assay throughput and reproducibility through automated image acquisition and analysis, reducing manual bias.
- Scalability: Facilitates preparation of validated germline models for downstream workflows in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables disease-relevant system modeling by linking germline structural changes to functional outcomes in stem cell development and apoptosis.
- Mechanistic De-risking: Provides insight into spatial developmental requirements through cytoskeletal architecture analysis, supporting preclinical model refinement.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by delivering consistent, threshold-based phenotypic readouts across experimental conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment by delivering standardized, quantifiable germline phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling 3D visualization of nuclear and protein distribution in distinct germline regions.
- Screening: Delivers assay readiness through automated, reproducible quantification of nuclei and sperm, enabling reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates statistical outputs such as nuclear density and cytoskeletal architecture metrics that allow cross-condition comparison and hit selection.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by linking germline structural phenotypes to stem cell dynamics and meiotic progression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform applicable across multiple genetic backgrounds and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through objective, 3D-based quantification of germline architecture, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability by minimizing human error and enabling rapid analysis (10 minutes per germline).
- Strategic Value: Improves capital efficiency by increasing sample size and accelerating go/no-go decisions in target validation pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing reproducible phenotypic data for lead compound evaluation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and 3D image analysis software for accurate germline segmentation and threshold setting.
- Dependent on access to a confocal microscope with 63X objective and fluorescent staining capabilities for DAPI, phalloidin, and protein targets.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters (slice thickness, averaging, background subtraction) to ensure reproducibility.
- Requires adaptation of region-of-interest definitions and spot function parameters when applied to different genetic backgrounds or staining protocols.
- Practical limitations include the need for optimized staining and mounting protocols to preserve germline structure for accurate 3D reconstruction.
