Name: Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Lernen Sie die automatisierte Analyse der Keimbahn von Caenorhabditis elegans zur Untersuchung von Kernen, Proteinen und Zytoskelett. Diese Methode reduziert Analysezeit und Fehler.

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Wir danken Monash Microimaging für ihre technische Unterstützung. Einige Stämme lieferte Caenorhabditis Genetik Zentrum, das von NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) gefördert wird. Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine Monash University Biomedizin Entdeckung Fellowship, NHMRC Project Grant (GNT1105374), NHMRC Senior Research Fellowship (GNT1137645) und Veski-Innovation-Stipendium: VIF 23, Roger Pocock.

1. Vorbereitung und Wurm Tierhaltung
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für alle Produktinformationen.
<ol><li>OP50 Escherichia coli Kultur: Kultur OP50 Bakterien in Lysogeny Brühe (LB) (1 % Tryptone, 0,5 % Hefe, 0,5 % NaCl, pH 7,0) über Nacht bei 37 ° C ohne Antibiotika.</li>
	<li>Samen Sie 400 µL OP50 Bakterien, Nematoden Wachstumsfugen Medien (NGM) (1,5 g NaCl, 8,5 g Agar, 1,25 g Pepton, 1 mL 1 M CaCl2, 5 mg/mL Cholesterin in Ethanol, 1 mL 1 M MgSO4 1 mL und 25 mL 1 M KPO4 Puffer) und die Bakterien für 48 h der Luft trocknen lassen.</li>
	<li>Wählen Sie Würmer auf gesetzte NGM Platten und inkubieren Sie bei 15 ° C oder 20 ° C.<ol>
<li>Wählen Sie für die Analyse der Erwachsenen Zwitter Keimbahn wohlgenährt L4-Würmer auf den bakteriellen Rasen und Inkubation über Nacht bei 20 ° C.</li>
		<li>Inkubieren Sie für die Wertung Spermienzahl in Hermaphroditen L4 Würmer bei 20 ° C für 12 h bis die Würmer die L4/Erwachsene Häutung erreichen. Um die Würmer zu L4-Stadium zu synchronisieren, bereiten Sie Eiern durch Abnehmen der erwachsenen Würmer mit einer Menge von Eiern in Bleichmittel-Lösung (1 M NaOH und Bleichmittel im Verhältnis 1:1). Lassen Sie die Eiern schlüpfen und L4 Tiere für das Experiment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Teflon-Objektträger durch 25 µL Poly-L-Lysin-Lösung auf der Folie platzieren und verbreiten die Lösung gut, mit einer PIPETTENSPITZE vor. Nach dem Entfernen der überschüssigen Poly-L-Lysin mit Küchenpapier trockentupfen, ermöglichen Sie die Folien an der Luft trocknen und die Folien bei 65 ° C für 15-20 min inkubieren.</li>
</ol>2. Keimbahn Präparation und Färbung6,13
<ol><li>10 µL 0,01 % Tetramisole (Narkose) auf einem 22 mm × 22 mm deckgläschen vor Ort und wählen Sie 1 - Tage alten Erwachsenen Würmer hinein.</li>
	<li>Den Wurm am Heck zu sezieren, wie es sediert wird mit einer Spritze (5 mL) und einer Nadel (24 "x 1"), und damit die Keimbahn nicht beschädigt wird. Hinweis: Die Zerlegung muss erfolgen, bevor der Wurm vollständig gelähmt wird, so dass der Unterdruck in der Wurm und Wurm-Bewegung unterstützen das Auswerfen der Keimbahn. Zur Bewertung von Spermien, müssen Vorkehrungen getroffen werden, nicht zu beschädigen die samentasche durch die Nadel während der Präparation. Berühren Sie nicht die Keimbahn mit der Nadel mit Ausnahme der Dissektion Punkt nach der samentasche. Wenn es in die Keimbahn-Fach zu brechen oder eine Entlassung aus der Keimbahn beobachtet, sollte die Keimbahn nicht für die Analyse verwendet werden.</li>
	<li>Ort der invertierten Deckglas auf einer Poly-L-Lysin beschichtete Folie, die sezierte Keimbahn auf der Folie.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit unter dem Deckglas, indem man einen Papier-Turm an einer Ecke des Deckglases, dann legen Sie die Folie in flüssigem Stickstoff für 1 min. schnell das Deckglas mit Hilfe einer Nadel mit der Germlines auf der Folie zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Folien in Methanol-20 ° C für 30-60 s in einer Kammer, dann 30 min in frisch zubereitete festlegunglösung (1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,08 M HEPES pH 6,9, 1,6 mM MgSO4, 0,8 mM Ethylenglykol-Bis(beta-aminoethyl inkubieren Äther)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (EGTA) und 3,7 % Paraformaldehyd) bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Die Folien zu waschen, indem man in eine Kammer mit 1 X PBS, pH 7.4 mit 0,1 % Tween-20 für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
	<li>Blockieren der Germlines mit 30 µL Lösung zu blockieren (30 % der ziegenserum vorbereitet, indem man 900 µL ziegenserum in 1700 µL destilliertes H2O und 300 µL 10 X PBS) in eine Feuchte Kammer, indem man feuchten Papiertuch in einer Plastikbox bei Zimmertemperatur 30 Minuten vorbereitet.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL der REC-8 Antikörperlösung in 30 % ziegenserum in einem Verhältnis 1: 300, jede Probe vorbereitet. Über Nacht bei 4° c inkubieren</li>
	<li>Waschen Sie die Folien indem man in eine Kammer mit 1 X PBS mit 0,1 % Tween-20 für 10 min. Wiederholen Sie den Schritt einmal und überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, indem Sie ein Papiertuch auf die Ecke der Folie.</li>
	<li>Bereiten Sie Sekundärantikörper Lösung durch Verdünnung grüne Fluorophore (488 nm Emissionswellenlänge) konjugierten Sekundärantikörper (1: 1000), Phalloidin (Aktin Fleck, 1:4000) und DAPI (DNA-Fleck, 1:4000) in 30 % normalem ziegenserum vor.</li>
	<li>50 µL Sekundärantikörper Lösung zur Folie hinzufügen.</li>
	<li>1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Die Objektträger waschen zweimal, indem man in eine Kammer mit 1 X PBS mit 0,1 % Tween-20 für 10 Minuten wischen Sie überschüssige Flüssigkeit.</li>
	<li>Fügen Sie 30 µL Reagenz auf der Folie zu fixieren hinzu und legen Sie ein 12 mm2 x 1,5 µm Deckglas darauf und trocknen Sie die Folien bei 4 ° C über Nacht.</li>
</ol>(3) konfokalen Mikroskopie
<ol><li>Schalten Sie die confocal Mikroskop, Laser, Resonanz-Scanner und confocal Mikroskop Software. Legen Sie die Folien mit gefärbten Germlines auf den Diahalter oben 63 X Objektiv.</li>
	<li>Suchen Sie eine Keimbahn, Fokus auf der Oberseite der Keimbahn und markieren Sie ihn mit confocal Mikroskop-Software. Ebenso konzentrieren Sie sich auf der Unterseite der Keimbahn und markieren Sie ihn um die totale Keimbahn Dicke herzustellen.</li>
	<li>Bild der gesamten Keimbahn definieren die Dicke der einzelnen Segmente bis zu 0.5 µm. Markieren Sie den vollständigen Erwerb der Keimbahn und Start. Jede Scheibe 8 Mal zu scannen und die Durchschnittswerte um die Bildqualität zu verbessern. Die resonante Scanner erlauben schnellen Scannen, um zu vermeiden, während der Bildgebung bleichen. Wenn das Mikroskop keinen resonanten-Scanner haben, reduzieren Sie die Anzahl der Scans auf vier bleichen zu vermeiden.</li>
</ol>4. Post bildgebende Analyse der Kerne Anzahl und Verteilung
Hinweis: Siehe ergänzende Abbildung1 für Screenshots der Software-Tools und Tasten verwendet.
<ol><li>Importieren Sie das Bild Imaris 8.4.1 oder spätere Versionen der Software.</li>
	<li>Definieren Sie mitotische Region, Übergangszone, meiotische Region, Eizelle Region und samentasche der Keimbahn durch die Identifizierung der nuklearen Morphologie in jeder region</li>
	<li>Verwenden Sie die Oberfläche Funktionstaste (ergänzende Abbildung 1A) der Software, wählen Sie die Region von Interesse.</li>
	<li>Brechen Sie automatische DGM-Erstellungsassistenten ab und manuell zeichnen Sie die Region von Interesse auf das erste und letzte Segment des Bildes aus dem dreidimensionalen Stapel.</li>
	<li>Klicken Sie auf Create Oberfläche. Hinweis: Die Software wird automatisch die Stapel zwischen ersten und letzten Stapel entwickeln.</li>
	<li>Maskieren Sie alle Kanäle außer DAPI Maskenkanal Schaltfläche (Ergänzende Abbildung 1 b-C).</li>
	<li>Definieren Sie Kerngröße Parameter mit Hilfe der spot Funktionstaste (ergänzende Abbildung 1A). Definieren Sie für die mitotische Region einen XY-Durchmesser von 2 µm wobei Z Durchmesser nicht definiert. Definieren Sie für die Übergangszone eine XY-Durchmesser von 2 µm und Z als 1,5 µm. (ergänzende Abbildung 1). Hinweis: Beheben Sie die Durchmesser entsprechend der Vergrößerung und Spezifikationen des Mikroskops. Für das aktuelle Protokoll das Ziel verwendet wurde 63 X und Aufpreis 1,70 fache Vergrößerung während der Bildgebung. Ändert sich das Ziel, zum Beispiel 40 X, sollte der Durchmesser entsprechend geändert werden. Fehlerbehebung durchzuführen mit Wildtyp-Germlines, die richtigen Parameter zu etablieren. Die mitotische Region ein Wildtyp Keimbahn Arm hat ca. 250 Kerne. Der Durchmesser sollte geändert werden, um diesen Wert zu erreichen. Verwenden Sie mindestens 15 Germlines, um den optimalen Wert für den Durchmesser zu ermitteln. Ein ähnlicher Ansatz sollte verwendet werden, für die Kalibrierung der Übergangszone (150-170-Kerne) und meiotischen Region (600-700 Kerne).</li>
	<li>Begrenzen Sie die Erkennung von Flecken durch die Festlegung der Untergrenze (ergänzende Abbildung 1E). Verwendung DAPI gefärbt Wildtyp Germlines um minimale Schwelle zu etablieren, durch die Erhöhung der minimalen dreidimensionale Darstellung Schwellenwerts, bis die erste Ort außerhalb der Keimbahn erscheint.</li>
	<li>Speichern Sie das Bild und erhalten Sie die Anzahl der Kerne aus der Tabelle generiert automatisch von der Software. Exportieren Sie die Bilder als TIF-Dateien.</li>
</ol>5. buchen Sie Imaging-Analyse zur Bewertung von Sperma und Chromosomenzahl
<ol><li>Führen Sie dreidimensionale Darstellung durch die Auswahl der samentasche als die Region von Interesse. Jedes Sperma zu erkennen, definieren den spot Durchmesser zwischen 0,75 - 1,0 µm für X und Y-Achse, während Z Durchmesser undefiniert bleibt. Verwenden Sie die Funktionstaste Flecken, wie ergänzende Abbildung1 gezeigt.</li>
	<li>Subtrahieren Sie den Hintergrund durch Ankreuzen Hintergrund subtrahieren Box und mit Hintergrund Korrekturwerten berechnet, indem die Software (ergänzende Abbildung 1). Hinweis: Imaris Software wählt hoher Intensität Punkte zuerst, also die Wirkung der Herkunft ist minimal, solange gibt es wesentliche Unterschiede zwischen der Region von Interesse und den Hintergrund. Eine zweite Methode ist die Hintergrundkorrektur manuell definieren, wo geeignete Werte für den Hintergrund gegeben werden kann. Manuelle Untergrundkorrektur werden angebracht, wenn die Intensität der unabhängige Stichproben Vergleich braucht.</li>
	<li>Passen Sie die dreidimensionale Darstellung Schwellenwert um alle DAPI gefärbt Spermien in der samentasche (ergänzende Abbildung 1E) zu erkennen.</li>
	<li>Zum zählen von Chromosom definieren die Spotdurchmesser < 0,75 µm für X und Y-Achse vor der Entwicklung von dreidimensionaler Models.</li>
	<li>Das Bild speichern und als TIF-Datei exportieren.</li>
</ol>6. post Imaging-Analyse für Zellskelett Rekonstruktion der Keimbahn
<ol><li>Identifizieren des Interessenbereichs in die Keimbahn und Maske alle Kanäle außer Phalloidin Schaltfläche Kanäle zu maskieren .</li>
	<li>Definieren Sie eine Oberflächendetails von 0,25 µm mithilfe der Oberfläche Funktionstaste (ergänzende Abbildung1). Hinweis: Dies bedeutet, dass jede 0,25 µm in dreidimensionale Modelle dargestellt werden soll. Oberflächendetails kann für jede Region der Keimbahn konstant sein, wo ein dreidimensionales Oberflächenmodell für jeden 0,25 µm erstellt wird. Jedoch für die Eizelle Region Oberflächendetails auf 0,35 - erhöht werden kann 0,5 µm durch das Vorhandensein von genau definierten Aktin Fasern in dieser Region.</li>
	<li>Subtrahieren Sie den Hintergrund durch Ankreuzen Hintergrund subtrahieren Box und mit Hintergrund Korrekturwerten berechnet, indem die Software (ergänzende Abbildung 1).</li>
	<li>Stellen Sie dreidimensionale Darstellung Schwelle je nach Struktur Analyse (ergänzende Abbildung 1E) erfordern.</li>
	<li>Das entwickelte dreidimensionale Bild speichern und als TIF-Datei exportieren.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, verbessern die Genauigkeit und reduzieren den Zeitaufwand für die Keimbahn-Analyse. Nach standard Vorbereitung der seziert Germlines ist ein dreidimensionales Modell der Keimbahn Kerne durch rechnerische Rendering vorbereitet. Und ermöglicht die Beobachtung der Keimbahn Kerne Verteilung im Raum, berechnet dreidimensionale Darstellung die Anzahl der Kerne auf bestimmte Regionen der Keimbahn. Der kritische Aspekt unserer Methode ist präzise Definition der Größe und Form der Zellkerne. Die...

Die Erhaltung der Signalwege bei Säugetieren macht C. Elegans ein hervorragendes Modell mehrere biologische Prozesse1,2zu studieren. In unserem Labor verwenden wir die Keimbahn C. Elegans Stammzellen Entwicklung, Apoptose und Genexpression zu studieren. Während die Keimbahn eine dreidimensionale Struktur ist, sind viele Studien zweidimensional aufgrund der Zeit- und arbeitsintensiven dreidimensionale Analyse. Es ist sehr wahrscheinlich, dass zweidimensionale Analyse in Vivo -Events in die Keimbahn verfälschen kann. Das C. Elegans adult Zwitter hat zwei Keimbahn Arme, von die jeder eine somatische distale Spitze Zelle (DTC) beherbergt, die distale Keimzellen in einem undifferenzierten Zustand3,4unterhält. Diese Keimzellen beginnen zu unterscheiden, wie sie bewegen sich weg von der DTC, seinen Einfluss zu entkommen und werden Eizellen und Spermien, wie sie das proximale Ende der Keimbahn erreichen. Während dieses Prozesses durchlaufen Keim Zellkerne Mitose, vor dem Übergang zur Meiose5,6. Larvenstadium 4 (L4) von der Entwicklung nach dem Eizellen, während das Erwachsenenalter produziert werden Spermienproduktion komplettiert. Die Spermien werden in der samentasche gespeichert wo sie, Eizellen befruchten, Embryonen zu erzeugen.
Es gibt mehrere genetische Faktoren und Umweltfaktoren, die Keimbahn Entwicklung in C. Elegans , was zu Veränderungen in der Anzahl der Kerne, Anzahl der Apoptotic Veranstaltungen, Chromosom Dynamik und Protein-Expression bzw. Lokalisierung7 beeinflussen können ,8,9,10,11. Die Analyse dieser Ereignisse erfordert die Ermittlung der einzelnen Phasen der Differenzierung, die anhand der nuklearen Morphologie und Verteilung. Um diese Parameter manuell mit einer großen Stichprobe-Größe genau zu analysieren ist arbeitsintensiv und zeitaufwändig. Um diese Nachteile zu umgehen und die Konsistenz der Analyse zu ermöglichen, entwickelten wir eine automatisierte Methode zur dreidimensionalen Prüfung von C. Elegans Keimbahn für Kerne zählen, Kerne Verteilung, Protein-Expression und Zytoskeletts Struktur. Durch die Kombination von konfokalen Mikroskopie mit dreidimensionale Darstellung, erzielten wir Größe und Form Parameter für die Identifizierung der einzelnen Phasen der Keimzelle Differenzierung. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode zählen der Keim Zellkerne und Sperma plus scoring der Chromosomenzahl in jeder Eizelle.
Eine wichtige Struktur in die Keimbahn ist das Zellskelett, das Stabilität in der Keimbahn Fach, Aids zytoplasmatischen streaming und Schutz für Keimbahn Kerne12bietet. Rechnerische Darstellung verwenden, wir Dreidimensionale Rekonstruktion des Zytoskeletts Keimbahn durchgeführt und identifiziert verschiedene Zellskelett Features in die Keimbahn. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll zur Veranschaulichung wie computergestützte Analyse kombiniert konfokale Bildgebung ermöglicht umfassende Analyse der Keimbahn C. Elegans .
Wir schlagen eine schnelle Methode für die dreidimensionale Analyse von C. Elegans Keimbahn (Abbildung 1). Dreidimensionale Analyse verwenden, ist es möglich, die dreidimensionale Verteilung der Keimbahn Kerne (Abbildung 2 und Abbildung 3), automatische Zählung der Zellen (Abbildung 2), Rekonstruktion des Zytoskeletts Keimbahn ( zu studieren Abbildung 3), Verteilung von Proteinen (Abbildung 4), und zählen die Anzahl der Spermien in die samentasche und Chromosomen in Eizellen (Abbildung 5). Die Methode ermöglicht einfache und genaue Quantifizierung der Keimbahn nicht nur, sondern physiologisch relevante Phänotypen identifiziert.

<table><tbody><tr><td>C. elegans Stämme: Wildtyp (N2, Bristol), rnp-8(tm2435) I/hT2[bli-4(e937) let-?( q782) qIs48] (I;III), cpb-3(bt17) I, glp-1 (e2141) III&nbsp; </td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli Bakterien</td><td>Hausgemachte</td> Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) Platten Hausgemachtes <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyklonales Kaninchen Anti-REC-8&nbsp;</td><td>SDIX</td><td>29470002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 konjugierter Antikörper, gezüchtet in Ziege</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>Zytoskelett-Farbstoff Phalloidin&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-12380</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermofisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Tetramisol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES-Puffer, pH 7,4&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0887</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS pH 7,4&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>Scientific AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1389</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% Paraformaldehyd-Lösung</td><td>Merck Millipore</td><td>1040031000</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Fixierreagenz&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td>1009832511</tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>20&deg; C & 25°; CInbspator&nbsp;</td>Lichtmikroskop <td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Konfokalmikroskop <td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td> &nbsp;</td><td>Jede Marke (Leica, Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer mit Imaris Anzug 8.4.1 oder später, volle Lizenz zur Nutzung der Software und der Matlab-Software.</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phospho gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4</td><td>Selbstgemachte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflon-Objektträger&nbsp;</td><td>Tekdon&nbsp;</td><td>&nbsp; Tel.: 941-322-8288</td><td></td></tr></tbody></table>

computergestützte analyse der keimbahn caenorhabditis elegans , die verteilung der kerne, proteine und das zytoskelett zu studieren

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Die Keimbahn Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) wird verwendet, um mehrere biologisch wichtigen Prozesse einschließlich Stammzell-Entwicklung, Apoptose und Chromosom Dynamik zu studieren. Während die Keimbahn ein ausgezeichnetes Modell ist, ist die Analyse oft zweidimensional aufgrund der Zeit- und Arbeitsaufwand für die dreidimensionale Analyse. Wichtige Messwerte in solchen Studien werden die Anzahl/Position der Kerne und PROTEINVERTEILUNG in die Keimbahn. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur automatisierten Analyse der Keimbahn mit konfokalen Mikroskopie und rechnerische Ansätze um zu bestimmen, die Anzahl und Position der Kerne in den einzelnen Regionen der Keimbahn durchführen. Unsere Methode analysiert auch die Keimbahn PROTEINVERTEILUNG, die es die dreidimensionale Untersuchung von Protein-Expression in verschiedene genetische Hintergründe ermöglicht. Unsere Studie zeigt weiter, Variationen im Zellskelett Architektur in unterschiedlichen Regionen der Keimbahn, die räumliche Entwicklung Anforderungen aufnehmen kann. Unsere Methode ermöglicht schließlich automatisierte Zählung der Spermien in die samentasche des einzelnen Keimbahn. Zusammen genommen, ermöglicht unsere Methode schnelle und reproduzierbare phänotypische Analyse von C. Elegans Keimbahn.

Abbildung 1 zeigt den Zeitaufwand für die dreidimensionale Keimbahn-Analyse. L4 Hermaphroditen bei 20 ° C inkubiert wurden seziert, um Germlines zu isolieren und mit DAPI, Phalloidin und Antikörper gegen Proteine der Keimbahn befleckt. Germlines sind abgebildet mit der konfokalen Mikroskopie. Färbung und konfokalen Mikroskopie erfordert ca. 24 Std. computergestützte Analyse für die komplette Keimbahn 10-15 min erfordert, zählen Sie die Anzahl und Position der...

Wir präsentieren Ihnen eine automatisierte Methode zur dreidimensionalen Rekonstruktion der Keimbahn Caenorhabditis Elegans . Unsere Methode bestimmt die Anzahl und Position der jeder Kern in die Keimbahn und Analysen Keimbahn PROTEINVERTEILUNG und Zytoskeletts Struktur.

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Analyse einer Caenorhabditis elegans-Keimbahn zu automatisieren, um ihre Zellkern-, Protein- und Zytoskelettverteilung zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, die Schlüsselfragen auf dem Gebiet der C.Elegans über die Anzahl der Zellkerne und Spermien, die Kernverteilung und die Zytoskelettstruktur der Keimbahn zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die Analysezeit verkürzt, die Stichprobengröße erhöht und den menschlichen Fehler eliminiert, der mit der manuellen Analyse verbunden ist.Um die Proben abzubilden, legen Sie Objektträger mit gefärbten Keimbahnen in den Objektträgerhalter über dem 63X-Objektiv eines konfokalen Mikroskops und suchen Sie eine Keimbahn. Fokussieren Sie auf die Oberseite der Keimbahn und markieren Sie sie mit der Konfokalmikroskop-Software. Wenn die Gesamtdicke der Keimbahn bestimmt wurde, definieren Sie die Dicke jeder Scheibe bis zu 0,5 Mikrometer und markieren Sie die gesamte Keimbahn.Starten Sie dann die Erfassung, scannen Sie jedes Slice achtmal und mitteln Sie die Werte, um die Bildqualität zu verbessern. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, importieren Sie die Bilder in ein geeignetes Bildanalysesoftwareprogramm und verwenden Sie das Oberflächenfunktionswerkzeug, um den mitotischen Bereich auszuwählen. Es erscheint ein Bild des distalen Endes der Keimbahn.Brechen Sie den Assistenten für die automatische Oberflächenerstellung ab und zeichnen Sie manuell einen Interessenbereich um den mitotischen Bereich in der ersten und letzten Schicht des Bildes aus dem dreidimensionalen Stapel. Klicken Sie auf Oberfläche erstellen und dann auf Kanal maskieren, um alle Kanäle mit Ausnahme des DAPI-Kanals zu maskieren. Definieren Sie mit dem Spot-Funktionswerkzeug die Größenparameter des mitotischen Bereichs mit einem XY-Durchmesser von zwei Mikrometern und einem undefinierten Z-Durchmesser.Klicken Sie auf Hintergrund subtrahieren, um den Hintergrund zu subtrahieren. Um den minimalen Schwellenwert zu definieren, erhöhen Sie den minimalen 3D-Rendering-Schwellenwert für eine DAPI-gefärbte Wildtyp-Keimbahn, bis der erste Punkt außerhalb der Keimbahn angezeigt wird, und generieren Sie ein 3D-Modell für jede Region. Klicken Sie nach dem Speichern der Bilder auf Tabelle, um die Anzahl der Kerne anzuzeigen, die von der Software automatisch generiert wird, und exportieren Sie die Bilder als TIFF-Dateien.Erstellen Sie für die Übergangszone eine Oberfläche, wie zuvor beschrieben. Klicken Sie dann auf Kanal maskieren, um alle Kanäle mit Ausnahme des DAPI-Kanals zu maskieren. Definieren Sie mit der Spot-Funktion einen XY-Durchmesser von zwei Mikrometern und einen Z-Durchmesser von 1,5 Mikrometern und klicken Sie auf Hintergrund subtrahieren, um den Hintergrund zu subtrahieren.Um den minimalen Schwellenwert zu definieren, erhöhen Sie den minimalen 3D-Rendering-Schwellenwert für eine DAPI-gefärbte Wildtyp-Keimbahn, bis der erste Punkt außerhalb der Keimbahn angezeigt wird, und generieren Sie ein 3D-Modell für jede Region. Klicken Sie nach dem Speichern der Bilder auf Tabelle, um die Anzahl der Kerne anzuzeigen, die von der Software automatisch generiert wird, und exportieren Sie die Bilder als TIFF-Dateien. Um die Spermienzahl zu bewerten, wählen Sie die Spermatheca als interessierende Region aus, wie für die Zellkernregionen gezeigt, und verwenden Sie das Spot-Funktionswerkzeug, um den XY-Durchmesser zwischen 0,75 und einem Mikrometer mit einem undefinierten Z-Durchmesser zu definieren, um jedes Spermium zu erkennen.Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Hintergrundsubtrahierung und verwenden Sie die von der Software berechneten Hintergrundkorrekturwerte, um den Hintergrund zu subtrahieren. Passen Sie dann den 3D-Rendering-Schwellenwert an, um alle DAPI-gefärbten Spermien in der Spermatheca zu erkennen. Für die Chromosomenzählung in den Eizellen wählen Sie die Eizellen aus und definieren den XY-Durchmesser auf weniger als 0,75 Mikrometer und definieren den Schwellenwert, bevor Sie die 3D-Modelle entwickeln.Speichern Sie dann die Bilder für den Export als TIFF-Dateien. Identifizieren Sie für die Rekonstruktion der Keimbahn des Zytoskeletts die mitotische Region von Interesse in der Keimbahn und erstellen Sie eine Oberflächenmaske, wie zuvor gezeigt. Klicken Sie auf Kanäle maskieren, um alle Kanäle mit Ausnahme des Phalloidinkanals zu maskieren, und verwenden Sie das Oberflächenfunktionswerkzeug, um einen Oberflächendetail von 0,25 Mikrometern zu definieren.Nachdem Sie den Hintergrund subtrahiert haben, passen Sie den 3D-Rendering-Schwellenwert an, um das entwickelte 3D-Bild für den Export als TIFF-Datei zu speichern. Die Verteilung der Kerne ist abhängig von der Stufe der Differenzierung. In der mitotischen Region erscheint beispielsweise das innere Aktin als feste Masse, auf der die Kerne organisiert sind.In einer Wildtyp-Keimbahn enthält die mitotische Region etwa 250 Zellkerne und ist im Vergleich zum Rest der Keimbahn dicht mit Zellkernen gefüllt. Wenn sich die Kerne jedoch vom distalen Ende entfernen, erscheinen sie näher am Umfang der Keimbahn, wobei die Verteilungsänderung in der Übergangszone beginnt und endet, wenn die Kerne in die dritte Phase der Prophase der Meiose eintreten. In der Übergangszone nimmt das innere Aktin der Keimbahn eine zylindrische Struktur an und wird beim Erreichen des Pachytens zu einem Hohlzylinder.Die zweite Schicht aus Aktin bedeckt die innere Schicht und gibt der Keimbahn Form. Dieser Zylinder innerhalb einer Zylinder-Aktinstruktur verschwindet in Richtung der Eizellregion, woraufhin das Aktin als dicke Fasern erscheint, die die Eizellen bedecken. In der Spermatheca formt sich das Aktin ebenfalls zu dicken Faserbündeln, obwohl diese Fasern dichter beieinander zu liegen scheinen als in der Eizellregion.Die dreidimensionale Darstellung des proximalen Endes der Keimbahn, wie gezeigt, zeigt durchschnittlich 151 Spermien in jeder Spermatheca. Einmal gemeistert, kann diese Analyse in 10 Minuten pro Keimbahn abgeschlossen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Analyseparameter entsprechend der Vergrößerung des Objektivs zu definieren, das zur Visualisierung der Keimbahn in Ihrem Experiment verwendet wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine automatische Analyse einer Keimbahn durchführt, die Struktur des Zytoskeletts untersucht und die Anzahl der Zellkerne in der Keimbahn bewertet.

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Research

Forschung

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Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren (Video) | JoVE Journal

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

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