Isolierung, Charakterisierung und hohem Durchsatz extrazelluläre Flux-Analyse der Maus primäre renale tubuläre Epithelzellen

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen des Nierenstoffwechsels zu beantworten, wie z. B. die Fettsäureoxidation, die eng mit der Entwicklung von Nierenfibrose und verschiedenen anderen Nephropathien zusammenhängt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass eine Hochdurchsatzplattform verwendet wird, um nach Verbindungen zu suchen, die die mitochondriale Bioenergetik in tubulären Epithelzellen der Niere regulieren. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Nierenstoffwechselerkrankungen, da sie ein High-Through-Screening von Verbindungen ermöglicht, die den mitochondrialen Stoffwechsel in Nierenepithelzellen regulieren.

Um die mit Kollagen überzogenen 60-Millimeter-Petrischalen zuzubereiten, fügen Sie zwei Milliliter einer vorgefilterten 20-Millimolar-Essigsäure hinzu, gefolgt von 35 Mikrolitern Kollagen-I-Lösung in jede Schale. Inkubieren Sie die Platte dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur, trocknen Sie sie an der Luft und setzen Sie sie der UV-Strahlung aus. Spülen Sie anschließend die Essigsäurereste mit PBS ab. Führen Sie drei Spülgänge durch.

Lagern Sie die Schale dann in einem 37 Grad Celsius heißen kohlendioxidfreien Zellkultur-Inkubator. Nachdem Sie die Maus für die Operation vorbereitet haben, entfernen Sie das Fell von Brust und Bauch mit einer Enthaarungscreme. Desinfizieren Sie dann die Haut mit Jod und wischen Sie die Jodrückstände weg.

Machen Sie als Nächstes einen Schnitt, um die Bauchhöhle zu öffnen, und legen Sie das Herz und die Nieren frei. Richten Sie nun eine Perfusionspumpe mit 32 Millilitern pro Minute ein und entfernen Sie alle Blasen in den Schläuchen, bevor Sie mit der Perfusion beginnen. Verwenden Sie eine 27-Gauge-Nadel am Ende der Linie.

Um fortzufahren, führen Sie eine Nadel durch die Herzspitze in den linken Ventrikel ein. Sobald der Puffer das Herz ausfüllt, stechen Sie ein Loch in den rechten Vorhof, um einen Ausgang für den Perfusionspuffer zu schaffen. Wechseln Sie anschließend zum Aufschlusspuffer und reduzieren Sie die Pumpendrehzahl für den Aufschluss leicht auf 30 Milliliter pro Minute.

Nachdem 20 Milliliter Verdauungspuffer perfundiert wurden, entfernen Sie beide Nieren für die tubuläre Zellisolierung. Um die entnommenen Nieren zu verarbeiten, entfernen Sie zunächst die Nierenkapseln und das Medulla. Dann zerkleinern Sie beide Nieren in winzige Stücke und inkubieren Sie sie in 10 Millilitern eines Verdauungspuffers in einem 37 Grad Celsius heißen Ofen mit sanfter Rotation für fünf Minuten.

Entfernen Sie nach der Verdauung unverdautes Gewebe, indem Sie den Puffer durch einen 70-Mikron-Filter leiten. Nachdem Sie das verdaute Gewebe entnommen haben, fügen Sie 10 Milliliter Nährmedium hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Als nächstes zentrifugieren Sie die gefilterte Gewebesuspension bei 50 g für fünf Minuten, um die röhrenförmigen Zellen zu pelletieren.

Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Röhrchen, fügen Sie fünf Milliliter Nährmedium hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation, um alle verbleibenden röhrenförmigen Zellen zu sammeln. Suspendieren Sie nun das erste Pellet in 20 Millilitern Nährmedium und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 50 g, um die gesammelten Zellen weiter zu reinigen. Entsorgen Sie den Überstand.

Dann resuspendieren Sie beide Pellets in 10 Millilitern Nährmedium. Zählen Sie als Nächstes die lebenden Zellen mit Trypanblau-Färbung. Säen Sie dann bis zu 10 Millionen Zellen auf eine 60-Millimeter-Kollagen-beschichtete Schale und lassen Sie die röhrenförmigen Zellen über Nacht anheften.

Säen Sie zunächst P1-Röhrenzellen mit 40.000 Zellen in Vertiefungen einer frisch vorbereiteten 96-Well-Mikroplatte, die mit Kollagen beschichtet ist. Verwenden Sie 100 Mikroliter Nährmedien pro Vertiefung. Die Optimierung der Zelldichte und der Verbindungskonzentration im extrazellulären Flux-Assay ist der Schlüssel zu einem erfolgreichen Experiment.

Wir empfehlen ein Pilot-Titrationsexperiment, um die optimale Zelldichte und Wirkstoffkonzentration zu ermitteln. Hydratisieren Sie anschließend die Sensorpatrone. Heben Sie zuerst die Sensorpatrone an und füllen Sie jede Vertiefung der Platte mit 200 Mikrolitern Kalibrierlösung.

Positionieren Sie dann die Patrone neu, um die Sensoren einzutauchen, und inkubieren Sie die Baugruppe über Nacht bei 37 Grad Celsius. Aspirieren Sie am nächsten Tag das alte Medium und ersetzen Sie es durch 175 Mikroliter Glukose- oder Fettsäure-Assay-Medien. Setzen Sie dann die Inkubation eine Stunde lang ohne Kohlendioxid fort.

Während der Zellinkubation wird Port A der Patrone mit 25 Mikrolitern Oligomycin geladen, Port B mit FCCP, Port C mit Rotenon/Antimycin A und Port D und alle anderen Ports mit Wasser geladen. Lagern Sie nun die Kartusche im kohlendioxidfreien Inkubator, bis das Setup für die Kalibrierung bereit ist. Fahren Sie fort, indem Sie den extrazellulären Flussanalysator und den Controller einschalten.

Öffnen Sie als Nächstes die Analyzer-Software, wählen Sie einen Standard-Assay aus und klicken Sie auf die Option Assay-Assistent. Weisen Sie dann auf der Registerkarte Verbindungen die Verbindungen den entsprechenden Ports zu. Wählen Sie auf der Registerkarte Hintergrundkorrektur die Felder aus, die keine Zellen enthalten.

Verwenden Sie als Nächstes die Registerkarte Gruppen und Beschriftungen, um die experimentellen Gruppen zu beschriften. Legen Sie dann auf der Registerkarte Protokoll die entsprechenden Mix- und Measure-Zyklen mit den verfügbaren Befehlen fest. Diese Einstellungen werden im Textprotokoll angezeigt, und sobald sie eingegeben wurden, speichern Sie die Vorlage für die zukünftige Verwendung.

Drücken Sie nun auf Assistent beenden, um fortzufahren. Drücken Sie nun Start, um die Kalibrierung zu starten. Der Analysator wirft dann den Plattenhalter aus und fordert Sie auf, die Kartuschenplatte einzusetzen.

Dieser Kalibrierungsprozess dauert 20 bis 25 Minuten. Sobald das System kalibriert ist, drücken Sie den Eingabeaufforderungsbefehl, um die Kalibrierplatte gegen die Zellplatte auszutauschen und den Lauf fortzusetzen. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, speichern Sie die OCR-Daten, und entfernen Sie die Platte aus dem Analysegerät.

Geben Sie nun Hoechst in jede der Assay-Vertiefungen und inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie dann die Zellen mit einer 355-Nanometer-Anregung und einer 460-Nanometer-Emission und normalisieren Sie die OCR-Daten auf die Zellzahl. In diesem Protokoll wurde eine heterogene Population von Nierenzellen, unvollständig verdauten Tubuli und anderen Gewebetrümmern auf kollagenbeschichteten Platten kultiviert.

Am Tag nach der Isolierung wurde das Nährmedium zentrifugiert, um Trümmer zu entfernen, und die röhrenförmigen Zellen wurden neu plattiert. In der Folge hefteten sich die Zellen leichter an und am fünften Tag in Kultur hatten sie eine Konfluenz von 80 bis 90 %. Die renalen TECs wurden dann subkultiviert und wuchsen innerhalb einer Woche zur Konfluenz.

Ein ähnliches Wachstum war in den nächsten beiden Passagen zu verzeichnen. Die Monoschicht der Zellen nahm eine Kuppelbildung an, hob sich von der Platte ab und blieb durch enge Verbindungen verbunden. Die mitochondriale Atmung isolierter primärer TECs wurde mit Hilfe der beschriebenen extrazellulären Flussanalyse der OCR bei verschiedenen Plattierungsdichten wie beschrieben gemessen.

Zellen, die mit höheren Dichten plattiert wurden, wiesen einen proportionalen Anstieg der OCR auf. 40.000 Zellen pro Vertiefung bedeckten die Oberfläche der Platte besser als alle anderen Beschichtungsdichten, was sie zur optimalen Konzentration machte, um Wechselwirkungen zwischen Zellen und Verbindungen zu testen. Zum Beispiel wurden Medien, die Fettsäuresubstrat enthielten, zusammen mit 2DG, einem Inhibitor der Glykolyse, auf TECs angewendet, um die Fettsäureoxidation in TECs an den Passagen eins und zwei direkt zu bewerten.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, immer die genauen Volumina und Konzentrationen in jeder Vertiefung zu protokollieren. Änderungen der Endkonzentrationen der Komponenten können dazu führen, dass das gesamte Experiment fehlschlägt. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Nephrologie den Weg ebnen, um die Rolle des tubulären Fettsäurestoffwechsels bei der Pathogenese verschiedener Nephropathien zu erforschen.