Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Interneuronen-Vorläufer aus verschiedenen Gehirnregionen in postnatalen Mauswelpen zu gewinnen und diese Zellen in gleichaltrige Empfänger zu transplantieren, um zu beurteilen, wie Umweltveränderungen das Schicksal und die Reifung der Interneuronen beeinflussen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsneurowissenschaften zu beantworten, wie intrinsische genetische Programme und Umweltsignale zusammenwirken, um das Schicksal von Nervenzellen zu formen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Veränderungen im Schicksal und in der Reifung von Interneuronenvorläufern nach ihrem adoptiven Transfer in eine neue Gehirnumgebung analysiert werden können.

visuelle Demonstration der Schritte der Zellentnahme und -transplantation ist von entscheidender Bedeutung, da kleine Fehler in der Technik zu ineffizienten und erfolglosen Transplantationsexperimenten führen können. Platzieren Sie zunächst eine Rasierklinge durch den vorderen Frontallappen eines postnatalen Welpengehirns und weitere Rasierklingen in die Schlitze direkt hinter der ersten Rasierklinge, um zwei 0,5-Millimeter-Scheiben zu erzeugen. Übertragen Sie die striatalen Schnitte in eine Petrischale mit blasenblasiger Saccharose, künstlichem Liquor cerebrospinalis (sACSF) und legen Sie das restliche Hirngewebe in eine Petrischale mit sACSF auf Eis.

Legen Sie die Scheiben unter ein Präpariermikroskop und kneifen Sie das Striatum mit einer Pinzette von beiden Hemisphären ab, indem Sie die striatalen Brocken während der Ernte in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sACSF auf Eis legen. Wenn das Gehirn von einer fluoreszierenden Reportermaus entnommen wurde, verwenden Sie die Fluoreszenzmikroskopie, um das striatale td-Tomatensignal vom stärkeren Fluoreszenzsignal des Globus pallidus zu unterscheiden. Um den Hippocampus zu entfernen, verwenden Sie eine Pinzette, um das Gehirn entlang der Mittellinie zu hemisezieren, und platzieren Sie eine Hemisphäre unter einem Präpariermikroskop mit der medialen Oberfläche nach oben.

Verwenden Sie eine Pinzette, um das ventrale Hirngewebe zu entfernen und den wurstförmigen Hippocampus zu identifizieren, der den anteroposterioren Zugang entlang der dorsalen und ventrikulären Seite des Kortex überspannt. Führen Sie die Spitzen der Pinzette vor dem vorderen Hippocampus ein und schieben Sie die Pinzette nach hinten, während Sie entlang der Hippocampus-Kortikalgrenze kneifen, um den Hippocampus sanft vom Kortex zu trennen. Legen Sie das isolierte Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sACSF auf Eis und wiederholen Sie die Hippocampus-Entnahme für die kontralaterale Hemisphäre.

Legen Sie dann die halbezierte Rinde mit der medialen Seite nach unten und verwenden Sie die Pinzette, um die dorsalsten, ventralen, vorderen und hintersten Teile der Rinde zu entfernen. Übertragen Sie das verbleibende Quadrat des medialen Kortex in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sACSF auf Eis. Nachdem Sie das Gehirn entfernt haben, stecken Sie das Gehirn mit der Bauchseite nach unten durch das Kleinhirn und die vordere Rinde oder den Riechkolben.

Trennen Sie mit einer gekrümmten Pinzette vorsichtig den hinteren Kortex vom darunter liegenden Hippocampus und anderem Gewebe in jeder Hemisphäre. Und schälen Sie den dorsalen Kortex nach vorne, um die darunter liegenden Strukturen freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Hippocampus in einer Hemisphäre an der Mittellinie einzuklemmen, und entfernen Sie den Hippocampus, indem Sie ihn seitlich vom Gehirn abziehen.

Legen Sie den Hippocampus in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sACSF auf Eis und ernten Sie den kontralateralen Hippocampus auf die gleiche Weise. Kratzen Sie dann vorsichtig um die Ränder des Striatums herum, um es vom umgebenden Gewebe zu lösen. Kneifen Sie vorsichtig unter das Striatum, um das striatale Gewebe zu entnehmen.

Nach der Entnahme des Kortex aus beiden Hemisphären, wie zuvor gezeigt, wird das Striatum unter ein fluoreszierendes Präparierfernrohr übertragen. Verwenden Sie eine Pinzette, um hellrotes td-tomatenpositives Globus pallidus-Gewebe aus jedem Striatum zu entfernen. Wenn alle Gewebe entnommen wurden, geben Sie das Gewebe in ein fünf Millimeter großes Röhrchen mit rundem Boden und ersetzen Sie das sACSF in jedem Entnahmeröhrchen durch zwei Milliliter frisch zubereitete Pronase-sACSF-Lösung für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schnippen.

Am Ende der Inkubation wird das Pronase-sACSF vorsichtig durch ein bis zwei Milliliter Rekonstitutionslösung ersetzt und das Gewebe mechanisch mit feuerpolierten Pasteur-Rohren dissoziiert. Wenn das Gewebe trüb ist und keine Gewebestücke sichtbar sind, seihen Sie die Zelllösung durch einen 50-Mikron-Filter in neue Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden, um vor der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung alle Zellklumpen zu entfernen. Nachdem Sie die Zellen aus der Durchflusszytometrie erhalten haben, überführen Sie die Zellsuspensionen zur Zentrifugation in konische 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Nach der Zentrifugation werden alle bis auf die letzten 20 Mikroliter Überstand aus jedem Röhrchen abgesaugt und die Pellets für die Zählung rekonstituiert. Falls erforderlich, verdünnen Sie die Zelllösung mit sACSF auf eine ein- bis dreimal 10 bis 5. Zellen pro Mikroliter. Befüllen Sie eine Mikropipette mit feiner Spitze mit Mineralöl.

Befestigen Sie die Mikropipette an einem Nanoliter-Injektor und befestigen Sie die Nanoliter-Injektionsvorrichtung an einem Manipulator, der an einer Magnetbasis befestigt ist. Während der erste Welpe auf Eis betäubt wird, pipettieren Sie die Zelllösung mehrmals, um eine homogene Zellverteilung zu gewährleisten. Stoßen Sie das Mineralöl aus und füllen Sie die Pipette vollständig mit der Einzelzellsuspension.

Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, legen Sie den Welpen auf eine Petrischale, wobei der Kopf auf Klebekitt ruht, so dass die Oberseite des Kopfes relativ flach ist. Decken Sie den Kopf mit einem Stück Laborband mit einem Diamantloch ab und ziehen Sie das Klebeband, bis die Haut gedehnt ist, so dass der Kopf fest fixiert ist und Lambda durch das Loch sichtbar ist. Schieben Sie den gesicherten Pup unter den Nanoliter-Injektor und senken Sie die Mikropipette so ab, dass sich die Spitze direkt über Lambda befindet.

Beobachten Sie die X- und Y-Koordinaten am Manipulator und stellen Sie die Manipulatorknöpfe ein, bis die Mikropipette an den entsprechenden Koordinaten entlang der medialen, lateralen und anteroposterioren Achse des Kopfes positioniert ist. Senken Sie die Mikropipette ab, bis die Spitze eine kleine Konkavität auf der Haut bildet, und drehen Sie den Manipulatorknopf der Z-Achse fest, aber vorsichtig, um die Mikropipette durch die Haut und den Schädel in das Gehirn zu treiben. Ziehen Sie die Mikropipette leicht zurück, bis die Spitze von einem Hautkegel umgeben ist, der wie ein Zelt geformt ist.

Und zeigen Sie die Koordinaten entlang der Z-Achse an. Senken Sie dann die Mikropipette auf die entsprechende Versuchstiefe ab und injizieren Sie die Zellen. Warten Sie 15 Sekunden nach der Abgabe der Zellen, bevor Sie die Mikropipette zurückziehen, und wiederholen Sie die Injektion bei Bedarf an einer zweiten Stelle.

Legen Sie den Welpen auf ein Heizkissen und überwachen Sie, bis die vollständige Genesung erreicht ist, bevor Sie ihn wieder in den Heimkäfig bringen. Transplantierte Zellen wandern durch die Zielhirnregionen mit unterschiedlichen Zellüberlebensraten von Dutzenden bis zu mehreren Tausenden. Die transplantierten Zellen lokalisieren sich in den entsprechenden Regionen, wobei viele Zellen Interneuron-Morphologien und gut charakterisierte neurochemische Interneuronenmarker aufweisen.

Die Spenderzellen überleben und reifen auch dann, wenn sie mit heterotopen Transplantationen in neue Umgebungen transplantiert werden. Die elektrophysiologische Analyse der transplantierten Zellen zeigt adulte physiologische Eigenschaften und ausgeprägte Feuermuster, die für gut definierte Interneuronen-Subtypen repräsentativ sind, was darauf hindeutet, dass transplantierte Interneurone in der Lage sind, in der Wirtsumgebung richtig zu reifen. Transplantierte Zellen zeigen auch spontane exzitatorische postsynaptische Ströme.

Die Aufzeichnung von Pyramidenzellen in der Nähe von transplantierten Interneuronen, die Channelrhodopsin-2 exprimieren, zeigt postsynaptische GABAerge Ströme, die durch blaues Licht in diesen endogenen Pyramidenzellen hervorgerufen werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen auf Eis zu halten und die Zellen vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette zu zerreiben, um den Zelltod zu minimieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Einzelzellsequenzierung, an den transplantierten Zellen durchgeführt werden, um genauer zu definieren, wie sich Umweltveränderungen auf das Transkriptom einer Zelle auswirken.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, Interneuronen-Vorläufer aus verschiedenen Gehirnregionen von Neugeborenen zu isolieren und diese Zellen in verschiedene Gehirnregionen von altersgleichen postnatalen Welpen zu transplantieren.