Name: Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Lernen Sie die homochrone Transplantation von Interneuron-Vorstufen in postnatale Mäusegehirne. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Entwicklung und Reifung in neuen Umgebungen.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch die National Institutes of Health (K99MH104595) und das NICHD intramural Research Program, T.J.P. Wir danken Gord Fishell, in dessen Labor dieser Ansatz ursprünglich gegründet wurde.

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<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+diversification+of+cortical+inhibitory+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons.</a> Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).</li>
<li>Mi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+emergence+of+cortical+interneuron+diversity+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo.</a> Science. 360 (6384), 81-85 (2018).</li>
<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>De la Cruz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+progenitors+attenuate+the+power+of+acute+focal+ictal+discharges%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges.</a> Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).</li>
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<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist die Überlebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Um sicherzustellen, dass das Gewebe und die Zellen immer im eiskalten Carboxygenated sACSF sind ist notwendig zum Überleben der Zellen zu fördern. Dies erfordert eine effiziente Dissektion und Dissoziation Strategie die Länge der Zeit zu minimieren, die die Zellen in verschiedene Lösung und außerhalb der Gehirn-Umgebung zu verbringen. Abhängig von der Anzahl von Hirnregionen seziert und transplantiert wird kann es vorteilhaft, ei...

Kortikale Funktion erfordert ein Gleichgewicht zwischen erregenden Projektion Neuronen und inhibitorischen Gabaergen Interneuronen, einer extrem heterogenen Bevölkerung mit verschiedenen Morphologien, elektrophysiologischen Eigenschaften, Konnektivität und neurochemischen Marker. Abnorme Entwicklung und Funktion von Interneuronen (und spezifische Interneuron Untergruppen) hat in Verbindung gebracht worden, der Pathobiologie der psychiatrischen Erkrankungen wie Schizophrenie, Autismus und Epilepsie1,2,3. Darüber hinaus sind viele Gene, die an diesen Erkrankungen des Gehirns beteiligt in jungen Interneurone4stark angereichert. Daher ist ein größeres Verständnis für die Mechanismen, die Interneuron Schicksal Entschlossenheit und Reifung regulieren erforderlich, um die normale Entwicklung und mögliche Ursachen von zahlreichen Erkrankungen des Gehirns zu verstehen.
Vorderhirn Interneuronen entstehen in erster Linie aus zwei transient embryonale Strukturen, die medialen und kaudalen ganglionic Eminenzen (MGE und CGE, beziehungsweise). Diese postmitotischen Zellen (Interneuron Vorstufen) dann durchlaufen einen langwierigen tangential Migrationsphase während das Telencephalon zu zerstreuen, wo sie in einer Vielzahl von Schaltungen zu integrieren. MGE-abgeleitete Interneuronen bestehen aus drei weitgehend nicht überlappende, neurochemisch definierten Untergruppen: schnell Spick Parvalbumin (PV+) Interneurone, Spick Somatostatin (SST+) Interneurone, schnelle und spät Spick neuronale Stickstoffmonoxid Stickoxid-Synthase (Nngoo+) Interneuronen, die hippocampale Neurogliaform und Efeu Zellen darstellen. Zahlreiche Labors haben mehrere Mechanismen innerhalb der MGE identifiziert, die erste Schicksal Entscheidungen in PV+ oder SST + Interneuronen, einschließlich räumlichen Gradienten Morphogens, Geburtsdatum Interneuron Grundstoffe und den Modus der neurogenen Division zu regulieren 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. es wurde vorgeschlagen, dass Interneuronen zunächst in "Kardinal Klassen" zu unterscheiden und dann schrittweise in "endgültigen Klassen", Reifen wie sie mit ihrer Umwelt11 interagieren. Den letzten deutet darauf hin, dass einige Reife Interneuron Subtypen genetisch veranlagt sein können, wie diese Zellen werden in die ganglionic Eminenzen postmitotischen darauf hinweist, dass frühe definierten intrinsischen genetische Programme eine größere Rolle als bisher spielen kann Geschätzte12,13. Die entscheidende Frage der Interaktion der intrinsischen genetische Programme mit Umwelt-Signale zu Laufwerk Differenzierung in unterschiedliche Interneuron Subtypen bleibt jedoch weitgehend unerforscht.
Zahlreiche Studien haben MGE Embryonalzellen direkt in eine Vielzahl von Hirnregionen, mit den Ergebnissen der Konsens verpflanzt, die verpflanzten Zellen Reifen und GABA um in der Regel die lokale endogene Schaltung14,15hemmen, 16,17,18,19. Diese vielversprechenden Beobachtungen haben großes Interesse im Umgang mit menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hIPSC) erzeugt-Interneurone zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen des Gehirns abgeleitet. Hält jedoch sehr wenige von diesen Studien beurteilen, ob diese transplantierten Zellen zu der erwarteten Typen von Reifen Interneuronen heranreifen, eine kritische Komponente, wenn man über translationale Ansätze.
Um zu beheben wie Umwelt Interneuron Differenzierung und Reifung beeinflusst, wurde eine Strategie entwickelt, um verpflanzen Interneuron unreife Vorstufen in neue Gehirn Umgebungen um zu prüfen, ob veredelte Interneuronen Funktionen des Hosts übernehmen Umwelt oder Funktionen aus dem Spender Umwelt20zu behalten. MGE-Transplantationen sind nicht geeignet, diese Frage ansprechen, denn die MGE enthält eine Mischpopulation Interneuron und Gabaergen Projektion Zellen, die in zahlreichen Gehirn Regionen21zu zerstreuen. Ohne zu wissen, wo diese Zellen MGE migriert haben würde, kann man nicht umfassend beurteilen, wie diese Transplantationen von Gehirn Umwelt betroffen sind. Durch das Ernten von Interneuron Vorläufer an frühen postnatalen Zeitpunkten, wird dieses Problem umgangen, indem unreifen Zellen, die ihre Migration abgeschlossen und ihr Ziel erreicht haben erhalten Region des Gehirns, sondern haben nur minimale Interaktion mit der Umwelt. Durch die Fokussierung auf Besonderheiten der Interneurone, die zwischen den unterschiedlichen Gehirnregionen differentiell exprimiert werden, kann man dann feststellen, wie die Host-Umgebung Interneuron Eigenschaften ändert. Der allgemeine Ansatz in diesem Protokoll sollten auf jeder Ermittler anwendbar sein, dass will untersuchen, wie die jungen Neuronen wann Verhalten in einer neuen Umgebung in Frage gestellt.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat einbasisch</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Gehirnmatrizen</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>Nur bei der Entnahme von Striatum erforderlich</td></tr><tr><td>Feine Spitze Dumont Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodisparierschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Manueller Manipulator mit Ständer</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Kunststoffröhrchen mit rundem Boden</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petrischalen</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischalen</td><td>ThermoFisher</td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um Filter</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

homochronic transplantation von interneuron vorstufen in frühen postnatalen mäusegehirnen

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronale Schicksal Entschlossenheit und Reifung erfordert ein kompliziertes Zusammenspiel zwischen genetischen Programme und Umweltsignale. Entwirrt die Rollen der intrinsische vs. extrinsische Mechanismen, die Regeln dieser Differenzierungsprozess ist jedoch ein Rätsel für alle Entwicklungsstörungen Neurobiologen. Dieses Problem wird für Gabaergen Interneuronen, ein unglaublich heterogene Zellpopulation vergrößert, die entsteht aus Transienten embryonale Strukturen und unterziehen eine langwierige wandernde Phase, während das Telencephalon zu zerstreuen. Wie verschiedene Gehirn Umgebungen beeinflussen Interneuron Schicksal und Reifung zu erkunden, haben wir ein Protokoll für die Ernte eindringmittel beschrifteten unreifen Interneuron Vorstufen von bestimmten Gehirnregionen bei Neugeborenen Mäusen (P0-P2) entwickelt. In diesem Alter konnte die Migration ist fast abgeschlossen und diese Zellen sind mit Wohnsitz in ihre letzte Ruhestätte Umgebungen mit relativ wenig synaptische Integration. Nach Sammlung von einzelligen Lösungen via Durchflusszytometrie sind diese Interneuron Vorstufen in P0-P2 Wildtyp postnatale Welpen transplantiert. Indem Sie beide Orbit durchführen (z. B. Cortex-Rinde) oder heterotopisch (z. B. Kortex, Hippocampus) Transplantationen, kann man beurteilen, wie unreife Interneuronen in neue Gehirn Umgebungen eine Herausforderung ihr Schicksal, Reifung und Schaltung Integration betrifft. Gehirn können bei Erwachsenen Mäusen geerntet und mit einer Vielzahl von Posthoc Analyse der transplantierten Zellen, einschließlich immunhistochemische, untersucht elektrophysiologische und transkriptionelle Profilierung. Dieses allgemeine Konzept bietet Ermittler mit einer Strategie, wie verschiedene Gehirn Umgebungen assay können zahlreiche Aspekte der Neuron Entwicklung zu beeinflussen und zu identifizieren, wenn neuronale Besonderheiten im Wesentlichen auf Hardwired genetische Programme zurückzuführen sind oder ökologische Hinweise.

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie bestimmte Gehirnregionen aus frühen postnatalen Gehirn (Abbildung 1-2) zu ernten, sammeln Einzelzelle Dissoziationen Interneuron Grundstoffe und Transplantation dieser Zellen in verschiedenen Hirnregionen in naiven WT postnatale Welpen (Abbildung 3). Analysezwecken Posthoc geerntet wurden Gehirne, die Interneuron Vorläufer Transplantate erhalten zwischen P30-35 Zellmorph...

Anspruchsvolle junge Neuronen im neuen Hirnregionen kann wichtige Erkenntnisse, wie die Umwelt neuronalen Schicksal und Reifung formt zu offenbaren. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Ernte Interneuron Vorstufen von bestimmten Gehirnregionen und verpflanzen sie entweder Homotopically oder heterotopically in das Gehirn des postnatalen Welpen.

Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Interneuronen-Vorläufer aus verschiedenen Gehirnregionen in postnatalen Mauswelpen zu gewinnen und diese Zellen in gleichaltrige Empfänger zu transplantieren, um zu beurteilen, wie Umweltveränderungen das Schicksal und die Reifung der Interneuronen beeinflussen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsneurowissenschaften zu beantworten, wie intrinsische genetische Programme und Umweltsignale zusammenwirken, um das Schicksal von Nervenzellen zu formen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Veränderungen im Schicksal und in der Reifung von Interneuronenvorläufern nach ihrem adoptiven Transfer in eine neue Gehirnumgebung analysiert werden können.Die visuelle Demonstration der Schritte der Zellentnahme und -transplantation ist von entscheidender Bedeutung, da kleine Fehler in der Technik zu ineffizienten und erfolglosen Transplantationsexperimenten führen können. Platzieren Sie zunächst eine Rasierklinge durch den vorderen Frontallappen eines postnatalen Welpengehirns und weitere Rasierklingen in die Schlitze direkt hinter der ersten Rasierklinge, um zwei 0,5-Millimeter-Scheiben zu erzeugen. Übertragen Sie die striatalen Schnitte in eine Petrischale mit blasenblasiger Saccharose, künstlichem Liquor cerebrospinalis (sACSF) und legen Sie das restliche Hirngewebe in eine Petrischale mit sACSF auf Eis.Legen Sie die Scheiben unter ein Präpariermikroskop und kneifen Sie das Striatum mit einer Pinzette von beiden Hemisphären ab, indem Sie die striatalen Brocken während der Ernte in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sACSF auf Eis legen. Wenn das Gehirn von einer fluoreszierenden Reportermaus entnommen wurde, verwenden Sie die Fluoreszenzmikroskopie, um das striatale td-Tomatensignal vom stärkeren Fluoreszenzsignal des Globus pallidus zu unterscheiden. Um den Hippocampus zu entfernen, verwenden Sie eine Pinzette, um das Gehirn entlang der Mittellinie zu hemisezieren, und platzieren Sie eine Hemisphäre unter einem Präpariermikroskop mit der medialen Oberfläche nach oben.Verwenden Sie eine Pinzette, um das ventrale Hirngewebe zu entfernen und den wurstförmigen Hippocampus zu identifizieren, der den anteroposterioren Zugang entlang der dorsalen und ventrikulären Seite des Kortex überspannt. Führen Sie die Spitzen der Pinzette vor dem vorderen Hippocampus ein und schieben Sie die Pinzette nach hinten, während Sie entlang der Hippocampus-Kortikalgrenze kneifen, um den Hippocampus sanft vom Kortex zu trennen. Legen Sie das isolierte Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sACSF auf Eis und wiederholen Sie die Hippocampus-Entnahme für die kontralaterale Hemisphäre.Legen Sie dann die halbezierte Rinde mit der medialen Seite nach unten und verwenden Sie die Pinzette, um die dorsalsten, ventralen, vorderen und hintersten Teile der Rinde zu entfernen. Übertragen Sie das verbleibende Quadrat des medialen Kortex in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sACSF auf Eis. Nachdem Sie das Gehirn entfernt haben, stecken Sie das Gehirn mit der Bauchseite nach unten durch das Kleinhirn und die vordere Rinde oder den Riechkolben.Trennen Sie mit einer gekrümmten Pinzette vorsichtig den hinteren Kortex vom darunter liegenden Hippocampus und anderem Gewebe in jeder Hemisphäre. Und schälen Sie den dorsalen Kortex nach vorne, um die darunter liegenden Strukturen freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Hippocampus in einer Hemisphäre an der Mittellinie einzuklemmen, und entfernen Sie den Hippocampus, indem Sie ihn seitlich vom Gehirn abziehen.Legen Sie den Hippocampus in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit sACSF auf Eis und ernten Sie den kontralateralen Hippocampus auf die gleiche Weise. Kratzen Sie dann vorsichtig um die Ränder des Striatums herum, um es vom umgebenden Gewebe zu lösen. Kneifen Sie vorsichtig unter das Striatum, um das striatale Gewebe zu entnehmen.Nach der Entnahme des Kortex aus beiden Hemisphären, wie zuvor gezeigt, wird das Striatum unter ein fluoreszierendes Präparierfernrohr übertragen. Verwenden Sie eine Pinzette, um hellrotes td-tomatenpositives Globus pallidus-Gewebe aus jedem Striatum zu entfernen. Wenn alle Gewebe entnommen wurden, geben Sie das Gewebe in ein fünf Millimeter großes Röhrchen mit rundem Boden und ersetzen Sie das sACSF in jedem Entnahmeröhrchen durch zwei Milliliter frisch zubereitete Pronase-sACSF-Lösung für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schnippen.Am Ende der Inkubation wird das Pronase-sACSF vorsichtig durch ein bis zwei Milliliter Rekonstitutionslösung ersetzt und das Gewebe mechanisch mit feuerpolierten Pasteur-Rohren dissoziiert. Wenn das Gewebe trüb ist und keine Gewebestücke sichtbar sind, seihen Sie die Zelllösung durch einen 50-Mikron-Filter in neue Fünf-Milliliter-Röhrchen mit rundem Boden, um vor der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung alle Zellklumpen zu entfernen. Nachdem Sie die Zellen aus der Durchflusszytometrie erhalten haben, überführen Sie die Zellsuspensionen zur Zentrifugation in konische 1,5-Milliliter-Röhrchen.Nach der Zentrifugation werden alle bis auf die letzten 20 Mikroliter Überstand aus jedem Röhrchen abgesaugt und die Pellets für die Zählung rekonstituiert. Falls erforderlich, verdünnen Sie die Zelllösung mit sACSF auf eine ein- bis dreimal 10 bis 5. Zellen pro Mikroliter. Befüllen Sie eine Mikropipette mit feiner Spitze mit Mineralöl.Befestigen Sie die Mikropipette an einem Nanoliter-Injektor und befestigen Sie die Nanoliter-Injektionsvorrichtung an einem Manipulator, der an einer Magnetbasis befestigt ist. Während der erste Welpe auf Eis betäubt wird, pipettieren Sie die Zelllösung mehrmals, um eine homogene Zellverteilung zu gewährleisten. Stoßen Sie das Mineralöl aus und füllen Sie die Pipette vollständig mit der Einzelzellsuspension.Nachdem Sie bestätigt haben, dass Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, legen Sie den Welpen auf eine Petrischale, wobei der Kopf auf Klebekitt ruht, so dass die Oberseite des Kopfes relativ flach ist. Decken Sie den Kopf mit einem Stück Laborband mit einem Diamantloch ab und ziehen Sie das Klebeband, bis die Haut gedehnt ist, so dass der Kopf fest fixiert ist und Lambda durch das Loch sichtbar ist. Schieben Sie den gesicherten Pup unter den Nanoliter-Injektor und senken Sie die Mikropipette so ab, dass sich die Spitze direkt über Lambda befindet.Beobachten Sie die X- und Y-Koordinaten am Manipulator und stellen Sie die Manipulatorknöpfe ein, bis die Mikropipette an den entsprechenden Koordinaten entlang der medialen, lateralen und anteroposterioren Achse des Kopfes positioniert ist. Senken Sie die Mikropipette ab, bis die Spitze eine kleine Konkavität auf der Haut bildet, und drehen Sie den Manipulatorknopf der Z-Achse fest, aber vorsichtig, um die Mikropipette durch die Haut und den Schädel in das Gehirn zu treiben. Ziehen Sie die Mikropipette leicht zurück, bis die Spitze von einem Hautkegel umgeben ist, der wie ein Zelt geformt ist.Und zeigen Sie die Koordinaten entlang der Z-Achse an. Senken Sie dann die Mikropipette auf die entsprechende Versuchstiefe ab und injizieren Sie die Zellen. Warten Sie 15 Sekunden nach der Abgabe der Zellen, bevor Sie die Mikropipette zurückziehen, und wiederholen Sie die Injektion bei Bedarf an einer zweiten Stelle.Legen Sie den Welpen auf ein Heizkissen und überwachen Sie, bis die vollständige Genesung erreicht ist, bevor Sie ihn wieder in den Heimkäfig bringen. Transplantierte Zellen wandern durch die Zielhirnregionen mit unterschiedlichen Zellüberlebensraten von Dutzenden bis zu mehreren Tausenden. Die transplantierten Zellen lokalisieren sich in den entsprechenden Regionen, wobei viele Zellen Interneuron-Morphologien und gut charakterisierte neurochemische Interneuronenmarker aufweisen.Die Spenderzellen überleben und reifen auch dann, wenn sie mit heterotopen Transplantationen in neue Umgebungen transplantiert werden. Die elektrophysiologische Analyse der transplantierten Zellen zeigt adulte physiologische Eigenschaften und ausgeprägte Feuermuster, die für gut definierte Interneuronen-Subtypen repräsentativ sind, was darauf hindeutet, dass transplantierte Interneurone in der Lage sind, in der Wirtsumgebung richtig zu reifen. Transplantierte Zellen zeigen auch spontane exzitatorische postsynaptische Ströme.Die Aufzeichnung von Pyramidenzellen in der Nähe von transplantierten Interneuronen, die Channelrhodopsin-2 exprimieren, zeigt postsynaptische GABAerge Ströme, die durch blaues Licht in diesen endogenen Pyramidenzellen hervorgerufen werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen auf Eis zu halten und die Zellen vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette zu zerreiben, um den Zelltod zu minimieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. die Einzelzellsequenzierung, an den transplantierten Zellen durchgeführt werden, um genauer zu definieren, wie sich Umweltveränderungen auf das Transkriptom einer Zelle auswirken.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, Interneuronen-Vorläufer aus verschiedenen Gehirnregionen von Neugeborenen zu isolieren und diese Zellen in verschiedene Gehirnregionen von altersgleichen postnatalen Welpen zu transplantieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Quelle: Weber, R. Z., et al. Intrazerebrale Transplantation und In-vivo-Biolumineszenzverfolgung von humanen neuralen Vorläuferzellen im Gehirn der Maus. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die stereotaktische Transplantation von genetisch veränderten humanen neuralen Vorläuferzellen (NPCs) in das Gehirn von Mäusen. Die Forscher injizieren NPCs, die Luziferase und fluoreszierende Proteine exprimieren, und ermöglichen so in vivo Biolumineszenz-Bildgebung und postmortale Fluoreszenzmikroskopie,...

Transplantation von humanen neuralen Vorläuferzellen in das Gehirn von Mäusen

Dieses Video stellt eine Methode zur Generierung von kortikalen Interneuronen-Vorläufern aus embryonalen Stammzellen der Maus vor. Das Protokoll beinhaltet die Kultivierung der Stammzellen in Medien, die spezifische niedermolekulare Inhibitoren enthalten, die die Proliferation und Aggregation von Stammzellen zu embryoiden Körpern (EBs) erleichtern. Anschließend werden die EBs mit Enzymen dissoziiert und auf Kulturplattenvertiefungen plattiert, die mit Adhäsionsproteinen beschichtet sind, um...

Generierung kortikaler Interneuronen-Vorläufer aus embryonalen Stammzellen der Maus

Quelle: Quattrocolo, G., et al. Homochrone Transplantation von Interneuronen-Vorläufern in frühe postnatale Mäusegehirne. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt die Transplantation von Interneuronen-Vorläuferzellen in das neonatale Mausgehirn unter Verwendung eines homotopen oder heterotopen Ansatzes. Das Verfahren umfasst die Sicherung eines anästhesierten Empfänger-Welpen, die Identifizierung der Zielhirnregion und die Injektion einer Suspension von Vorläuferzellen, die von einem...

Transplantation von Interneuronen-Vorläuferzellen in das Gehirn eines Mäusewelpen

Quelle: Gonzalez-Ramos, A., et. al., Transplantation of Human Stem Cell-Derived GABAergic Neurons into the early postnatal Mouse Hippocampus to mildage neurodevelopmental disorders. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die stereotaktische Injektion von humanen Interneuronen-Vorläuferzellen in den Hippocampus eines genetisch veränderten Maus-Welpen mit reduzierten inhibitorischen Interneuronen, mit dem Ziel, das exzitatorisch-inhibitorische Gleichgewicht wiederherzustellen.

Transplantation von humanen Interneuronen-Vorläuferzellen in den Hippocampus des Maus-Welpen

Quelle: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion eines Plasmidvektors, der das interessierende Gen trägt, in Interneuron-Vorläuferzellen in einem embryonalen Hirnschnitt, gefolgt von einer Elektroporation für den Plasmideintritt und die Genexpression. Diese modifizierten Vorläuferzellen können später zur Behandlung von Hirnerkrankungen...

Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen

Basierend auf der in vitro lentiviralen Entwicklung neuronaler Vorläufer, ihrer Co-Transplantation in Wilde-Gehirne und der gepaarten morphometrischen Auswertung von "Test"- und "Kontrollderivaten" ermöglicht diese Methode eine genaue Modellierung der In-vivo-Genkontrolle neokortikaler Neuronenmorphologie auf einfache und erschwingliche Weise.

Intraventrikuläre Transplantation von engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das entwickelt wurde, um die Aktivität kortikaler Interneureuritoren zu manipulieren, die in den Kortex von frühen postnatalen Mäusen transplantiert wurden.

Transplantation von chemogenetisch hergestellten kortikalen Interneureuren in frühpostnatale Maushirne

Die Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten GABAergen Neuronen, die durch neuronale Programmierung erzeugt werden, könnte ein möglicher Behandlungsansatz für neurologische Entwicklungsstörungen sein. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung und Transplantation von GABAergen neuronalen Vorläufern aus menschlichen Stammzellen in das Gehirn von neonatalen Mäusen, was eine Langzeituntersuchung transplantierter Neuronen und die Bewertung ihres therapeutischen Potenzials...

Transplantation von GABAergen Neuronen aus humanen Stammzellen in den frühen postnatalen Maushippocampus zur Linderung neurologischer Entwicklungsstörungen

Mosaic Analyse der Genfunktion in Postnatale Mäusehirnen mithilfe von Virus-basierten Cre Rekombination

Lernen Sie die homochrone Transplantation von Interneuron-Vorstufen in postnatale Mäusegehirne. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Entwicklung und Reifung in neuen Umgebungen.

Homochronic Transplantation von Interneuron Vorstufen in frühen postnatalen Mäusegehirnen

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