Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters
13. Juli 2018
Hier präsentieren wir eine Protokoll, die JC-1 Farbstoff verwendet, um die Mitochondrien-Membran-Potential der Zellen beurteilen nach Hypoxie/flussbettfilters mit oder ohne einem Schutzmittel ausgesetzt wird.
Diese Methode kann helfen, die Wirkung von Hypoxie/Reoxygenierung auf Zellen im mitochondrialen Membranpotential zu messen, und sie kann verwendet werden, um zu beurteilen, ob ein Wirkstoff vor einer Verletzung schützt. Der Hauptvorteil dieses Assays besteht darin, dass MMP bei Faktoren wie der mitochondrialen Größe nachgewiesen wird. Darüber hinaus hat es einen geringen Bedarf an Materialien und Strahlkraft.
Beginnen Sie mit 70 % konfluenten humanen Herzmyozyten in einer Sechs-Well-Platte. Nachdem Sie die Zellen mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung gewaschen haben, fügen Sie das Medikament oder Vehikel in zwei Milliliter Serum und glukosefreies DMEM hinzu. Inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator mit 5 % CO2 und 95 % Luft bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten vor der Hypoxie.
Nach 30 Minuten die Schale mit den menschlichen Herzmyozyten in ein luftdichtes 2,5-Liter-anhypoxisches Gefäß geben. Ausgestattet mit einem Katalysator zum Abfangen von freiem Sauerstoff und einem anerobischen Indikator zur Messung der Sauerstoffspannung im Medium. Stellen Sie das Glas in den Gewebekultur-Inkubator.
Die Farbe des anerobischen Indikators ändert sich von hellblau in normoxischer Umgebung zu blassweiß unter hypoxischen Bedingungen. Versorgen Sie die menschlichen Herzmyozyten mit Sauerstoff, indem Sie die Sechs-Well-Platte aus dem Glas nehmen und für zwei Stunden auf das Inkubatorregal stellen. Spülen Sie die Zellen nach der Reoxygenierung mit einem Milliliter vorgewärmtem PBS und fügen Sie 0,5 Milliliter vorgewärmtes 25%iges Trypsin entlang der Wand der Vertiefung hinzu.
Bei 37 Grad Celsius etwa eine Minute lang inkubieren, bis sich alle menschlichen Herzmyozyten fast abgelöst haben. Geben Sie dann einen Milliliter DMEM-Komplettmedium in die Vertiefungen, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und pelletieren Sie HCMs, indem Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur bei 500-fachem G zentrifugieren.
Nach der Zentrifugalisierung ist der Überstand vorsichtig anzusaugen, ohne die Pellets zu stören. Geben Sie dann 5 Milliliter humanes kardiales Myozyten-Komplettmedium und 5 Milliliter JC-1-Arbeitslösung in jedes Röhrchen. Resuspendieren Sie die HCMs, indem Sie auf und ab pipettieren.
Decken Sie die Röhrchen mit Alufolie ab, um ein Ausbleichen des Fluoreszenzindikators zu verhindern, und inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang unter normalen Bedingungen. Nach dem Pelletieren der menschlichen Herzmyozyten durch Zentrifugieren bei 500-fachem G für drei Minuten in einer auf vier Grad Celsius vorgekühlten Zentrifuge spülen die Zellen zweimal mit zwei Millilitern eiskaltem JC-1-Färbepuffer. Nach der zweiten Spülung resuspendieren Sie die menschlichen Herzmyozyten in 300 Mikrolitern eiskaltem Färbepuffer
.Und filtern Sie die Proben in die jeweiligen Probenröhrchen. Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie innerhalb von 30 Minuten. Starten Sie das Durchflusszytometer und stellen Sie sicher, dass die Software angeschlossen ist.
Führen Sie den Fluidic-Start durch. Starten Sie den Stream und richten Sie die Pause ein. Öffnen Sie zwei Punktdiagramm-Fenster in der Durchflusszytometrie-Software.
Wählen Sie im ersten Punktdiagramm nach vorne gestreutes Licht auf der X-Achse und seitliches Streulicht auf der Y-Achse aus. Darstellung der Eigenschaften der Zellen in Bezug auf ihre Größe bzw. ihre Granularität. Wählen Sie den PE-Erkennungskanal für die Y-Achse.
Und FITC für die X-Achse, unter Verwendung einer logarithmischen Skala im zweiten Punktdiagramm, das zur Messung der Fluoreszenzintensität des JC-1-Farbstoffs in den Zellen verwendet wird. Klicken Sie auf Entladen, um den Stützarm des Röhrchens herauszulassen, und positionieren Sie das leere Probenröhrchen mit menschlichen Herzmyozyten, die nicht mit JC-1 gefärbt wurden. Klicken Sie auf Laden, um den Stützarm wieder in seine Arbeitsposition zu bringen.
Klicken Sie auf Aufnehmen, um Partikel aus der Suspension im leeren Probenröhrchen zu sammeln. Und passen Sie die Spannungen der Fluoreszenzkanäle im zweiten Punktdiagramm an. Gaten Sie die Zellpopulation für die weitere Analyse im ersten Punktdiagramm.
Analysieren Sie als Nächstes die menschlichen Herzmyozyten. Zeigen Sie die Statistiken jedes Probenröhrchens an und berechnen Sie die MMPs jeder Probe, indem Sie das Verhältnis der roten Fluoreszenzintensität durch das der grünen Fluoreszenzintensität dividieren. Hypoxie und Reoxygenierung induzieren signifikant die Apoptose von humanen Herzmyozyten im Vergleich zu normalen Zellen, gemessen anhand des Annexin-PI-Verhältnisses.
ein traditionelles chinesisches Arzneimittel mit kardioprotektiver Wirkung, verhinderte die Apoptose von HCMs nach Hypoxie/Reoxygenierung. Wie hier gezeigt, lag das JC-1-Rot/Grün-Verhältnis nach Behandlung mit dem mitochondrialen CCP bei nahezu Null. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen des Apoptose-Assays.
Die H/R-behandelte Gruppe wies im Vergleich zur Normalgruppe ein signifikant niedrigeres Rot/Grün-Verhältnis auf. Und eine solche Verhältnisänderung rückgängig gemacht. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die mit JC-1 beladenen Zellen in eiskaltem, stehendem Puffer zu starten, da die Temperatur einen erheblichen Einfluss auf die Stabilität des mitochondrialen Membranpotentials hat.
Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie genetische Manipulation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob die Abnahme des MMP auf die Eröffnung von MPTP zurückzuführen ist.
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Überblick
Dieses Protokoll verwendet JC-1-Farbstoff, um das mitochondriale Membranpotenzial (MMP) von Zellen zu bewerten, die Hypoxie/Reoxygenierung ausgesetzt sind. Es bewertet auch die Schutzeffekte von Wirkstoffen gegen Zellschäden.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zelluläre Biologie
- Mitochondriale Funktion
- Hypoxie-Forschung
Hintergrund
- Das mitochondriale Membranpotenzial ist entscheidend für das Überleben der Zellen.
- Hypoxie/Reoxygenierung kann zu Zellschäden führen.
- Schutzstoffe können diese Effekte mildern.
- JC-1-Farbstoff ist ein zuverlässiger Indikator für MMP-Veränderungen.
Ziel der Studie
- Um die Auswirkungen von Hypoxie/Reoxygenierung auf MMP zu messen.
- Um die Schutzeffekte bestimmter Wirkstoffe zu bewerten.
- Um einen materialarmen Assay für die MMP-Bewertung bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Züchten Sie humane kardiale Myozyten bis zu 70% Konfluenz.
- Waschen Sie die Zellen mit Phosphatpuffer-Salin.
- Inkubation mit Medikament oder Träger in serumfreiem DMEM.
- Exposition der Zellen unter Hypoxie-Bedingungen zur Bewertung.
Hauptergebnisse
- Demonstrierte Veränderungen des MMP aufgrund von Hypoxie/Reoxygenierung.
- Identifizierte Schutzeffekte von Wirkstoffen auf MMP.
- Zeigte niedrige Materialanforderungen für den Assay.
- Hervorgehoben wurde der Einfluss der mitochondrialen Größe auf die MMP-Erkennung.
Schlussfolgerungen
- Der JC-1-Assay ist effektiv zur Bewertung von MMP-Veränderungen.
- Schutzstoffe können MMP-Ergebnisse signifikant beeinflussen.
- Diese Methode ist zugänglich und effizient für zelluläre Studien.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial membrane potential (MMP) is critical for evaluating cardioprotective strategies in ischemia-reperfusion injury models. This flow cytometry-based JC-1 assay provides a quantitative, high-throughput readout of mitochondrial depolarization in human cardiac myocytes, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting reperfusion injury. The method supports target validation by linking MMP changes to mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, a key event in cardiomyocyte death.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures MMP as a functional readout of mitochondrial health and mPTP opening in disease-relevant human cardiac myocytes.
- Operational Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding cytoprotective agents under hypoxia/reoxygenation stress.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating MMP preservation with reduced apoptosis, as demonstrated by Annexin PI ratio.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: JC-1’s red/green fluorescence ratio provides a ratiometric, mitochondria-specific readout independent of cell size or granularity.
- Operational Value: Low material requirements and compatibility with standard flow cytometry platforms support assay scalability and reproducibility.
- Screening Readiness: Enables rapid evaluation of compound libraries for effects on MMP in a physiologically relevant human cell model.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses human cardiac myocytes to enhance translational relevance over rodent models in ischemia-reperfusion studies.
- Operational Value: Standardized hypoxia/reoxygenation protocol allows consistent induction of mitochondrial depolarization for compound testing.
- Predictive Value: Facilitates go/no-go decisions by linking MMP protection to functional outcomes like reduced apoptosis.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insights into mitochondrial dysfunction in cardiovascular disease models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of MMP as a biomarker of mPTP activation and reperfusion injury severity.
- Screening: Delivers quantitative, normalized fluorescence ratio data suitable for hit selection and dose-response profiling.
- Analytics: Generates red/green intensity ratio metrics that allow statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Uses human-derived cells to improve predictive confidence for preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted across cardiotoxicity and cardioprotection screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mitochondrial depolarization as a convergent point of reperfusion injury pathways.
- Operational Value: Minimizes variability by normalizing MMP readout to mitochondrial content via ratiometric JC-1 detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of compounds that preserve MMP and reduce apoptotic commitment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating MMP stabilization in human cardiac myocytes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cardiac myocyte culture and hypoxia/reoxygenation modeling.
- Dependent on flow cytometry with FITC and PE detection channels and logarithmic fluorescence scaling.
- Necessitates strict temperature control during JC-1 staining to preserve mitochondrial membrane potential integrity.
- Requires standardization of hypoxia duration and reoxygenation timing across experimental groups.
- Limited to adherent cell types amenable to trypsinization and washing without loss of viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Establishment of Hypoxia/Reoxygenation Model
1:57
Preparation of HCMs for Flow Cytometry
3:49
Flow Cytometer Setup
4:43
Flow Cytometry Measurement and Data Analysis
5:40
Results: Validation of the Establishment of Hypoxia/Reoxygenation (H/R) Model by Flow Cytometry
6:34
Conclusion
