Name: Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie das mitochondriale Membranpotential in humanen kardialen Myozyten nach Hypoxie/Reoxygenation mit JC-1-Farbstoff und Durchflusszytometrie messen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung schützender Substanzen.

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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der nationalen Schlüssel Forschung und Entwicklung-Programm von China (Nr. 2017YFC1700503), die nationale Basic Research Program (973-Programm) von China (No.2012CB518602), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81370223 und Nr. 81573957), und die Doktoranden Innovative Research Foundation of Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).

1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie komplette Medium menschlichen kardialen Myozyten (HCMs) durch Zugabe von 25 mL Myozyten Wachstumsmedium Ergänzung Mix 500 ml von Myozyten Wachstumsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers. Shop bei 4 ° C und Warm auf 37 ° C vor der Verwendung.</li>
	<li>Bereiten Sie Tongxinluo (TXL) Lösung durch Auflösen von TXL ultrafeine Pulver in serumfreien/Glukose Dulbeccos Adlers Medium (DMEM) geändert und passen Sie die Konzentration von TXL bis 400 µg/mL durch Zugabe von DMEM (für mehr Details, siehe11). Shop bei 4 ° C und Warm auf 37 ° C vor der Verwendung.</li>
	<li>Bereiten Sie 5 mL der JC-1 funktionierende Lösung durch Zugabe von 25 µL der Stammlösung (200 X), 4 mL Reinstwasser und 1 mL Puffer (5 X) in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen im Dunkeln Färbung Lager JC-1 vor. Pipette das Gemisch nach oben und unten mehrmals und vor der Verwendung auf 37 ° C warm.</li>
	<li>Bereiten Sie 30 mL Färbung Puffer zu arbeiten, indem 24 mL Reinstwasser zu 6 mL Puffer (5 X) in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen Färbung Lager vor. Verwenden Sie diese Lösung eiskalt.</li>
</ol>(2) die Einrichtung von Hypoxie/Flussbettfilters-Modell
<ol><li>Platte 1,0 x 105 Zellen pro Bohrloch mit HCM komplette Medium für eine 6-well-Platte. Wachsen Sie, eine Konfluenz von ca. 70 % in einer Zelle Inkubator mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft bei 37 ° c zu erreichen</li>
	<li>Waschen Sie HCMs mit Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS). Setzen sie auf unterschiedliche Behandlungen (400 µg/mL TXL oder nicht) in 2 mL/Glukose serumfreien DMEM für 30 min vor Hypoxie in eine Zelle Inkubator mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft bei 37 ° C.</li>
	<li>Inkubieren HCMs in einem luftdichten und hypoxischen Glas (2,5 L) mit einem Katalysator ausgestattet um abfangen freien Sauerstoff und induzieren Hypoxie für 18 h (Abbildung 1A) und anaeroben Indikator zur Messung der Sauerstoff-Spannung in die mittleren11,12, 13, in eine Zelle Inkubator mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft bei 37 ° C. Hinweis: Es dauert ca. 1,5 h nach dem Katalysator zu freien Sauerstoff in der Dose zu ergattern. Daher sind die HCMs in Glas für 19,5 h gehalten, bevor das Glas geöffnet wird. Die Farbe des anaeroben Indikator wechselt von hellblau in Inklusieve Umgebung nach blass Weiss in hypoxischen Zustand (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Reoxygenate HCMs durch Verschieben der 6-well-Platte in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft für 2 h eingestellt.</li>
</ol>3. Vorbereitung der HCMs Durchflusszytometrie
<ol><li>0,25 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) Lösung und PBS auf 37 ° c warm</li>
	<li>Aspirieren Sie Medium aus jedem Brunnen, spülen Sie die Zellen mit 1 mL PBS und 0,5 mL 0,25 % Trypsin entlang der Wand des Brunnens.</li>
	<li>Inkubieren Sie bei 37 ° C, bis alle HCMs fast freistehend (ca. 1 min) sind.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL DMEM komplette Medium (DMEM Medium mit 10 % fötalen Rinderserum) in die Vertiefungen der Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und pellet HCMs durch Zentrifugieren bei 500 X g für 3 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Aspirieren Sie sorgfältig den überstand ohne zu stören das Pellet.</li>
	<li>Jedes Rohr 0,5 mL der HCM komplette Medium und 0,5 mL der JC-1 Arbeitslösung hinzufügen. Aufschwemmen der HCMs durch pipettieren rauf und runter.</li>
	<li>Decken Sie die ganze Rohre mit Alufolie zu verhindern, dass Bleichen des Indikators fluoreszierende und inkubieren Sie HCMs unter normalen Bedingungen (bei 37 ° C mit 5 % CO2 % bis 95 % Luft) für 20 min.</li>
	<li>Pellet HCMs durch Zentrifugieren bei 500 X g für 3 min bei 4 ° C.</li>
	<li>HCMs zweimal mit 2 mL eiskaltes JC-1 Färbung Puffer spülen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie HCMs in einem Endvolumen von 300 µL der eiskalte Färbung Puffer in das Probenröhrchen (12 x 75 mm) und verwenden Sie die Zellen für die Analyse innerhalb von 30 Minuten. Hinweis: Verwenden Sie Carbonyl Zyanid m-Chlorophenyl Hydrazone (CCCP), ein potenter Inhibitor der Atemwege Elektronentransport-Kette, um HCMs für 1 h bei einer Konzentration von 20 µM für die Positivkontrolle zu behandeln.</li>
</ol>(4) Flow Cytometer Setup
<ol><li>Starten Sie das Durchflusszytometer und sicherzustellen Sie, dass die Software mit ihm verbunden ist.</li>
	<li>Fluidics Neustart durchführen, starte den Stream und die Abreißkupplungen eingerichtet.</li>
	<li>Öffnen Sie zwei Dot-Plot-Fenster in der Flow-zytometrie-Software.<ol>
<li>Wählen Sie nach vorne verteilt Licht (FSC) auf der x-Achse und verstreut Streiflicht (SSC) auf der y-Achse in der erste Punkt des Grundstückes, die Eigenschaften der Zellen in Bezug auf ihre Größe und ihre Granularität bzw. zu vertreten.</li>
		<li>Wählen Sie den PE (575 ± 26 nm) Erkennung Kanal für die y-Achse und FITC (530 ± 30 nm) für die x-Achse mit einer logarithmischen Skala in dem zweiten Punkt Grundstück, die verwendet wird, um die Fluoreszenzintensität der JC-1 Farbstoff in den Zellen zu messen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) flow Cytometry Messung und Analyse von Daten
<ol><li>Klicken Sie auf Entfernen zu lassen, das Rohr stützen Sie Arm und positionieren Sie die leere (HCMs, die nicht gefärbt worden mit JC-1) Rohr auf es zu probieren. Klicken Sie auf Laden um das Rohr Unterstützung Arm in die Arbeitsposition zurück.</li>
	<li>Klicken Sie auf Datensatz , um Partikel von der Aussetzung in das leere Probenröhrchen zu sammeln und dann Tor der Zellpopulation (P1) zur weiteren Analyse in der erste Punkt des Grundstückes (Abbildung 3).</li>
	<li>Sammeln Sie HCMs in anderen Probenröhrchen und optimieren Sie die Messung durch Anpassen der Spannungen der Fluoreszenz-Kanäle, um sicherzustellen, dass die Zelle Punkt sich im Zentralbereich des zweiten Dot-Plot befindet.</li>
	<li>Zeigen Sie die Statistiken der einzelnen Probenröhrchen und berechnen Sie die MMPs jeder Probe dividiert das Verhältnis der rote Fluoreszenz-Intensität von der grünen Fluoreszenzintensität.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1606915">Acute Myocardial Infarction.</a> New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li>
<li>Ibanez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation%3A+The+Task+Force+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).</li>
<li>Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Myocardial reperfusion injury.</a> New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).</li>
<li>Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+role+in+myocardial+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).</li>
<li>Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+cardioprotection%3A+signal+transduction+in+ischemic+pre-%2C+post-%2C+and+remote+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning.</a> Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).</li>
<li>Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+an+isolated+mitochondrial+population+revealed+by+cytofluorometric+analysis+at+the+single+organelle+level%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level.</a> Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).</li>
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<li>Chen, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+miR-128-3p+by+Tongxinluo+Protects+Human+Cardiomyocytes+from+Ischemia%2Freperfusion+Injury+via+Upregulation+of+p70s6k1%2Fp-p70s6k1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+autophagy+by+Tongxinluo+through+the+MEK%2FERK+pathway+protects+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+from+hypoxia%2Freoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+protects+mesenchymal+stem+cells+against+hypoxia+and+serum+deprivation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis.</a> Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.prot065490.short">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).</li>
<li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic-induced+preconditioning+delays+opening+of+mitochondrial+permeability+transition+pore+via+protein+Kinase+C-epsilon-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway.</a> Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Excessive+Histone+Deacetylases+Activity+in+Diabetic+Hearts+Attenuates+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Injury+via+Mitochondria+Apoptosis+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway.</a> Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).</li>
<li>Qiu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-induced+melanoma+cell+death+is+associated+with+mitochondrial+permeability+transition+pore+%28mPTP%29+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).</li>
<li>Zhen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+dependent+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+is+required+for+dexamethasone-induced+death+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts.</a> Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).</li>
<li>Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+as+a+potential+target+of+mitochondrial+superoxide+and+its+role+in+endothelial+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).</li>
<li>Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mitochondrial+KATP+channel+on+voltage-gated+K%2B+channel+in+24+hour-hypoxic+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).</li>
<li>Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neuroprotective+Effects+of+Hypothermia+on+Bilirubin-Induced+Neurotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro.</a> Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).</li>
<li>Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+Jiang+Zhi+Granule+protects+against+metabolic+stress-induced+hepatocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury.</a> World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).</li>
<li>El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renoprotective+Effects+of+Aldose+Reductase+Inhibitor+Epalrestat+against+High+Glucose-Induced+Cellular+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury.</a> Biomed Research International. 2017, 5903105(2017).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die JC-1 Farbstoff verwendet, um die MMP der Zellen beurteilen nach der Belichtung H/R. erkannt durch JC-1-Assay, der MMP der Zellen ist unabhängig von Faktoren wie mitochondriale Größe, Form und Dichte, die Einkomponenten-Fluoreszenz beeinflussen können 14-Signale. Infolgedessen sind die Ergebnisse der JC-1-Assay relativ zuverlässig. Außerdem ist es bequem und zeitsparend, JC-1-Assay durchzuführen. Dieser Test hat eine niedrige Anforderung für Materialien und...

Koronarer Herzkrankheit ist die häufigste Todesursache weltweit. Die Therapie der Wahl ist für ischämische Schädigung Reduzierung und Begrenzung Infarkt Größe bei Patienten mit ST-Segment Myokardinfarkt erhöhten rechtzeitige und wirksame myokardialen Reperfusion über primäre perkutane Koronarintervention (PCI)1, 2. Reperfusion verursacht zusätzlichen Schaden, die bis zu 30 Prozent des letzten Infarkt Größe3ausmachen kann. Es ist allgemein anerkannt, dass die mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP) nicht nur zentral in mitochondrialen Schäden und Zelle Tod während Ischämie/Reperfusion (ich / R), sondern ist auch ein konvergierende Ziel kardioprotektive Signalisierung4 , 5. mPTP Eröffnung Depolarisation der inneren mitochondrialen Membran potenzielle (MMP)4bringen würde, wir haben festgestellt, mPTP Eröffnung mit 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3′-Tetraethylblei-Imidacarbocyanineiodide (JC-1) Assay.
Die JC-1-Assay ist eine Cytofluorimetric Methode, die sowohl quantitative als auch qualitative, und es wurde weiter durch die Analyse der MMP auf der Ebene eines einzelnen Mitochondrien6validiert. JC-1 existiert als aggregierter Form, eine rote bis orange farbigen Emission (590 ± 17,5 nm) in der Matrix der Mitochondrien mit normalen MMP nachgeben; mit dem Verlust von MMP ist JC-1 in monomerer Form konvertiert, die grünen Fluoreszenz mit einer Emission von 530 nm ± 15 ergibt. Daher deutet eine Abnahme in der rot/grünen Fluoreszenz Intensitätsverhältnis den Rückgang von MMP Bedingungen wie Ischämie/Reperfusion (ich / R).
MMP ist neben JC-1 auch mit Membran durchlässig lipophilen kationen wie Rhodamin 123 und 3, 3′-Dihexyloxadicarbocyanine Jodid [DiOC6(3)] untersucht worden. JC-1 ist jedoch im Vergleich zu diesen zwei Sonden, zuverlässiger für die Analyse von MMP. Rhodamin 123 hat relativ schlechte Sensitivität (insbesondere Quench Modus7,8) und schlechte Spezifität. Die Verschiebung der Rhodamin 123 ist manchmal so klein, dass es schwer für Forscher oder Ausrüstung zu beobachten/zu erkennen. Außerdem in einer einzelnen Zelle, gibt es verschiedene Mitochondrium Bindungsstellen für Rhodamin 123 und so, daß es eventuell unterschiedliche Fluoreszenz Emissionen9. DiOC6(3) wird nicht empfohlen für die Erkennung von MMP entweder so, wie es sensibel auf die Depolarisation der Plasmamembran10 reagiert.
Deshalb verwenden wir hier die JC-1-Assay MMP HCMs bewerten nach Hypoxie/flussbettfilters mit oder ohne einem Schutzmittel ausgesetzt wird.

<table><tbody><tr><td>Assay-Kit für das Potenzial der mitochondrialen Membran mit JC-1</td><td>Beyodtime, China</td><td>C2006</td><td>Das Kit enthält JC-1-Stammlösung (200-fach), Stamm-Färbepuffer (5-fach) und CCCP (10 mM)</td></tr><tr><td>Tongxinluo ultrafeines Pulver</td><td>Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China</td><td>071201</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI Kit</td><td>Becton-Dickinson, USA</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Humaner kardialer Myozyten-Promocell</td><td>, Deutschland</td><td>C-12810</td><td></td></tr><tr><td>Myozyten-Wachstumsmedium (SupplementMix)</td><td>Promocell, Deutschland</td><td>C-39275</td><td></td></tr><tr><td>Myozyten-Wachstumsmedium (gebrauchsfertig)</td><td>Promocell, Deutschland</td><td>C-22070</td><td>verwendet mit Myozyten-Wachstumsmedium SupplementMix</td></tr><tr><td>GENbox</td><td>BioM&eacute; rieux, Marcy l' Etoile, Frankreich</td><td>96127</td><td>2,5-Liter-Katalysator</td></tr><tr><td>(AnaeroPack)</td><td>MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC.&nbsp;, Japan</td><td>&nbsp; C-1</td><td></td></tr><tr><td>Anaerober Indikator</td><td>BioM&eacute; rieux, Marcy l' Etoile, Frankreich</td><td>96118</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>Becton-Dickinson, USA</td><td>FACSAria 2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>Becton-Dickinson, USA</td><td></td><td>Version8.0.1</td></tr><tr><td>Probenröhrchen</td><td>Corning Science, USA</td><td>352054</td><td>12*75mm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone, USA</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr></tbody></table>

ein flow cytometry-basierten test zur messung der mitochondrien-membran-potential in kardialen myozyten nach hypoxie/flussbettfilters

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Zeitnahe und effiziente Reperfusion der verschlossenen Koronararterie ist die beste Strategie zur Verringerung der Größe der myokardialen Infarkt bei Patienten mit ST-Segment Herzinfarkt erhöht. Reperfusion schlechthin kann jedoch im weiteren Cardiomyocyte Tod, ein Phänomen bekannt als Reperfusion Verletzungen führen. Die Eröffnung der mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP), mit der Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) oder mitochondriale Depolarisation ist allgemein anerkannt als der letzte Schritt der Reperfusion Verletzungen und ist verantwortlich für Mitochondriale und Cardiomyocyte Tod. JC-1 ist eine lipophile kationischen Farbstoff, der in den Mitochondrien abhängig vom Wert des MMP ansammelt. Je höher die MMP ist, desto mehr JC-1 sammelt sich in den Mitochondrien. Die zunehmende Mengen von JC-1 in den Mitochondrien können durch eine Fluoreszenz Emission Verlagerung von Grün zum Ausdruck kommen (~ 530 nm) bis rot (~ 590 nm). Daher kann die Verringerung der rot/grünen Fluoreszenz Intensitätsverhältnis die Depolarisation der Mitochondrien angegeben. Hier nehmen wir Vorteil von JC-1 MMP Messen oder der Eröffnung des mPTP in menschlichen kardialen Myozyten nach Hypoxie/flussbettfilters, durch Durchflusszytometrie nachgewiesen.

Vor der Durchführung des JC-1-Tests um die Veränderungen der MMP zu bewerten, es empfiehlt Versuche durchgeführt werden, bestätigen die Bedingungen erfolgreich von den Forschern festgelegt. Dargestellt durch die Flow Cytometry Ergebnisse (Abbildung 2), verglichen mit der normalen Gruppe Hypoxie/flussbettfilters (H/R) deutlich induziert Apoptose von HCMs (Annexin V + /PI±), darauf hinweist, dass wir eine Zelle basierendes Modell i aufgebaut hatten / R (45,00 ±...

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die JC-1 Farbstoff verwendet, um die Mitochondrien-Membran-Potential der Zellen beurteilen nach Hypoxie/flussbettfilters mit oder ohne einem Schutzmittel ausgesetzt wird.

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Diese Methode kann helfen, die Wirkung von Hypoxie/Reoxygenierung auf Zellen im mitochondrialen Membranpotential zu messen, und sie kann verwendet werden, um zu beurteilen, ob ein Wirkstoff vor einer Verletzung schützt. Der Hauptvorteil dieses Assays besteht darin, dass MMP bei Faktoren wie der mitochondrialen Größe nachgewiesen wird. Darüber hinaus hat es einen geringen Bedarf an Materialien und Strahlkraft.Beginnen Sie mit 70 % konfluenten humanen Herzmyozyten in einer Sechs-Well-Platte. Nachdem Sie die Zellen mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung gewaschen haben, fügen Sie das Medikament oder Vehikel in zwei Milliliter Serum und glukosefreies DMEM hinzu. Inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator mit 5 % CO2 und 95 % Luft bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten vor der Hypoxie.Nach 30 Minuten die Schale mit den menschlichen Herzmyozyten in ein luftdichtes 2,5-Liter-anhypoxisches Gefäß geben. Ausgestattet mit einem Katalysator zum Abfangen von freiem Sauerstoff und einem anerobischen Indikator zur Messung der Sauerstoffspannung im Medium. Stellen Sie das Glas in den Gewebekultur-Inkubator.Die Farbe des anerobischen Indikators ändert sich von hellblau in normoxischer Umgebung zu blasswei

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Saponin-permeabilisierten Faseraufbereitung in Verbindung mit respirometrische oxidative Phosphorylierung Analyse bietet integrative Beurteilung der Funktion der Mitochondrien. Mitochondriale Atmung in physiologischen und pathologischen Zuständen kann reflektieren verschiedene regulatorische Einflüsse einschließlich mitochondrialer Interaktionen, Morphologie und Biochemie.

Respirometrische Oxidative Phosphorylierung Assessment in Saponin-permeabilisierten Cardiac Fibers

Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien...

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Dieses Video zeigt die Markierung neuronaler Zellen mit Antikörpern für mitochondriale Atmungskettenkomplexe, mitochondriale DNA-assoziierte Proteine und mitochondriale äußere Membranproteine, gefolgt von einer Durchflusszytometrie zur Quantifizierung ihrer Spiegel.

Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in Neuronen mittels Durchflusszytometrie

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung der mitochondrialen Außenmembran-Proteine ​​durch Immunmarkierung von Mitochondrien aus Nagetiergewebe und Analyse durch Durchflusszytometrie Strom isoliert. Diese Methode kann erweitert werden, um funktionale Aspekte der mitochondrialen Subpopulationen zu bewerten.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Dieses Protokoll soll veranschaulichen, wie zu verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch im Herzen ändern können.

Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer

Xenobiotische Efflux-Pumpen sind hochaktiv in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und verursachen die Extrusion von TMRM, einem mitochondrialen Membranpotenzial fluoreszierender Farbstoff. Hier stellen wir ein Protokoll zur genauen Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in HSPCs durch TMRM in Gegenwart von Verapamil, einem Efflux-Pumpeninhibitor, vor.

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Massen- und Membranpotenzials in ex vivo kultivierten hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

Die unterschiedlichen Auswirkungen unterschiedlicher Unterkühlungsgrade auf den Myokardschutz wurden nicht gründlich bewertet. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Konzentration des Zelltodes nach verschiedenen Hypothermie-Behandlungen in einem auf humanem Kardiomyozyten basierenden Modell zu quantifizieren und damit den Grundstein für zukünftige vertiefte molekulare Forschung zu legen.

In-vitro-Bewertung des Myokardschutzes nach Hypothermie-Vorkonditionierung in einem Human-Herz-Myozyten-Modell

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung von Assays zur direkten Messung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, molekularen Sauerstoff zu verbrauchen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Erfahren Sie, wie Sie das mitochondriale Membranpotential in humanen kardialen Myozyten nach Hypoxie/Reoxygenation mit JC-1-Farbstoff und Durchflusszytometrie messen. Diese Methode ermöglicht die Bewertung schützender Substanzen.

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters (Video) | JoVE Journal

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

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