Ein Neurosphäre Assay auszuwertende endogenen neurale Stammzellen Aktivierung in einem Mausmodell der minimalen Spinal Cord Injury

Diese Methode kann helfen, Fragen zur Rolle neuronaler Vorläuferzellen in der regenerativen Medizin zu beantworten. Insbesondere können wir fragen, wie sich Verletzungen auf das Verhalten von neuralen Vorläuferzellen auswirken. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen Ansatz bietet, um die Auswirkungen von Rückenmarksverletzungen auf die Kinetik endogener neuraler Vorläuferzellen zu untersuchen.

visuelle Demonstration dieser Techniken ist von entscheidender Bedeutung. Denn die chirurgischen Schritte und die Sezierschritte erfordern Präzision und können schwer zu erlernen sein, obwohl sie mit etwas Übung perfektioniert werden können. Entfernen Sie vor Beginn des Eingriffs mit einer Haarschneidemaschine das Fell vom Rücken einer anästhesierten Maus vom mittleren Rücken bis zum Hals und den Ohren.

Nachdem Sie die Maus in einem stereotaktischen Gerät gesichert haben, legen Sie vier bis fünf Stücke gerollte Gaze unter den Bauch, während Sie leicht an der Basis des Schwanzes ziehen, um den Körper und die Wirbelsäule aufzurichten. Schieben Sie die Thoraxgazerolle rostral vom Mausbauch in Richtung des oberen Brustkorbs, um die Brustwirbelsäule zu stützen. Und verwenden Sie Laborband, um den Schwanz und die Gliedmaßen sternförmig zu fixieren.

Nachdem Sie die exponierte Haut mit nacheinander 70%igen Ethanol- und Povidon-Jod-Tupfern desinfiziert haben, verwenden Sie eine Skalpellklinge der Nummer 10, um einen vertikalen Schnitt parallel zur Längsachse des Tieres zu machen, von der Mitte beider Schulterblätter bis zur Krümmung der Brustwirbelsäule. Ziehen Sie die Haut zurück, um das Weichgewebe und die Kontur der Wirbelsäule freizulegen. Und identifizieren Sie den unteren Rand des superscapularen Fettpolsters.

Schneiden Sie dann mit dem Skalpell vorsichtig, aber kraftvoll an beiden Seiten der Wirbel T5 bis T8 und neun Knochen entlang, um die hinteren Muskelsehnen von der Wirbelsäule zu lösen. Positionieren Sie die Retraktoren so, dass die Zähne der Retraktoren auf beiden Seiten der Wirbelsäule in die Inzisionsstelle eingeführt werden. Und erweitern Sie jeden Retraktor, um die Exposition anzupassen, bis die Wirbelsäule ausreichend angehoben ist, ohne die eingezogenen Muskelschichten zu stark zu belasten.

Reinigen Sie unter einem Operationsmikroskop vorsichtig die verbleibenden Muskeln und andere Weichteile über der Wirbelsäule, um den Wirbelknochen freizulegen. Den Dornfortsatz der Wirbel mit einer Zahnzange umklammern und die Pinzette leicht auf und ab bewegen, um die Wirbel zu identifizieren, die entfernt werden sollen. Führen Sie als Nächstes eine Spitze einer gebogenen stumpfen Schere in beide Seiten des freiliegenden Foramens intervertebralis, kaudal zur zu exzidierenden Wirbellamina.

Und die verbindenden Zwischenwirbelgelenke beidseitig durchtrennen. Heben Sie dann die Lamina nach oben und schneiden Sie den oberen Ansatz der Lamina ab, um den Knochen zu isolieren und zu entfernen. Achten Sie beim Abschneiden und Entfernen der Wirbellamina darauf, die Schere immer nach oben zu richten, um das darunterliegende Rückenmark nicht zu beschädigen.

Mit den dorsalen Mittellinienvenen als Orientierungspunkt führen Sie den um 45 Grad gebogenen Schaft einer 30-Gramm-Nadelspitze mit der abgeschrägten Seite nach oben einen Millimeter tief in die dorsale laterale Oberfläche des Rückenmarks ein. Und etwa 0,5 Millimeter lateral zu beiden Seiten der Mittellinie. Bewegen Sie die Nadel etwa zwei Millimeter von der kaudalen in die rostrale Richtung, so dass die gesamte Länge der Fase in die Schnur eingeführt wird.

Verfolgen Sie dann den Pfad des Eingangs zurück, um die Nadel zu entfernen. Um die Wunde zu schließen, entfernen Sie den Retraktor und verwenden Sie eine resorbierbare 6-0-Naht, um die Rückenmuskulatur auf beiden Seiten der Verletzung entlang der Mittellinie zu verbinden. Und eine 4-0 Seidennaht, um die darüber liegende Haut zu schließen.

Um die Neurosphären zu isolieren, machen Sie einen Mittellinienschnitt in der Haut über die gesamte Länge des Rückens, um die Muskel- und Wirbelknochenkontur freizulegen. Heben Sie den medialen Aspekt jedes Schulterblatts an und schneiden Sie mit einer Schere das Weichgewebe zwischen dem Schulterblatt und den Wirbeln ab. Wenn die darunterliegende Wirbelsäule freigelegt wurde, führen Sie die Schere in die obere Brustöffnung ein, folgen Sie der Krümmung der Wirbelsäule und schneiden Sie die angesetzten Rippen, Muskeln und inneren Organe ab, um die Wirbelsäule zu isolieren.

Führen Sie die Schere in das Foramen der Schwanzwirbel ein und schneiden Sie die Zwischenwirbelgelenke auf beiden Seiten der Laminae durch, wobei Sie darauf achten, dass die intakte Nabelschnur nicht beschädigt wird. Wenn die entsprechende Länge des Rückenmarks freigelegt ist, schneiden Sie vorsichtig alle Spinalnerven ab, die sich seitlich vom Rückenmark erstrecken, bevor Sie das Rückenmarksgewebe in eine Petrischale mit normaler, künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit auf Eis geben. Schneiden Sie unter einem Präpariermikroskop das Rückenmarksgewebe so, dass es etwa zwei Millimeter Gewebe rostral und kaudal zur Verletzungsstelle umfasst, und trennen Sie das Rückenmark mit zwei Paar feinen Zangen vorsichtig in zwei Längshälften entlang der dorsalen und ventralen Fissuren.

Schneide mit der Mikroschere die verletzte dorsale seitliche weiße Substanz heraus. Und geben Sie das verletzte Gewebe in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Halten Sie eine Hälfte des Rückenmarks mit der Pinzette, reizen und entfernen Sie die unverletzte weiße Substanz mit zwei Pinzettenpaaren entlang der rostralen kaudalen Ausdehnung des Rückenmarks, um die entsprechende periventrikuläre Region zu isolieren.

Nachdem Sie die verletzte weiße Substanz und die zugehörigen periventrikulären Regionen auf die gleiche Weise von der anderen Hälfte des Rückenmarks isoliert haben, legen Sie die Stücke des periventrikulären Gewebes in einzelne konische 15-Milliliter-Röhrchen. Und mit der Mikroschere das Gewebe sanft gegen die Wände der Röhren hacken. Sobald das Gewebeverdauungsverfahren abgeschlossen und die Einzelzellsuspension erhalten wurde, wird eine Neurosphärenkultur eingerichtet, indem 10 Milliliter des entsprechenden Mediums in einen 25-Milliter-Gewebekulturkolben pro Zellzustand gegeben werden.

Und fügen Sie die isolierten neuralen Stammzellen bis zu einer klonalen Dichte von 10 Zellen pro Mikroliter für ihre Kultur in einem Zellkultur-Inkubator hinzu. Nach 24 Stunden die Kolben vorsichtig schwenken und den Inhalt zur Zentrifugation in einzelne konische 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Suspendieren Sie die Pellets zum Zählen in ein bis zwei Millilitern frischem neuralem Basalmedium.

Und die Zellen werden mit klonaler Dichte in einer 24-Well-Gewebekulturplatte pro Bedingung plattiert, die 500 Mikroliter des entsprechenden Mitogen-supplementierten Mediums pro Vertiefung enthält. Anschließend züchten Sie die Neurosphären sieben Tage lang im Zellkultur-Inkubator. Fünf Tage nach der minimalen Rückenmarksverletzung ist die absolute Anzahl der definitiven Neurosphären aus neuralen Stammzellen größer als die Anzahl der primitiven Neurosphären aus neuralen Stammzellen.

Definitive Neurosphären weisen einen größeren Durchmesser und ein großes dunkles Zentrum auf. Während primitive Neurosphären kleiner und dichter gepackt sind. Eine minimale Rückenmarksverletzung führt zu einer signifikanten Zunahme der Neurosphären, die aus dem Zentralkanal auf der Ebene der Verletzung gewachsen sind, verglichen mit einer relativ bescheidenen Zunahme des Zentralkanals, rostral zum Grad der Verletzung.

Definitive Neurosphären können auch aus der läsionierten weißen Substanz auf der Ebene der Verletzung erzeugt werden. Eine Region, die keine Neurosphäre enthält, die Zellen in der Laminektomie allein bei Tieren bildet. Ein ähnlicher Anstieg primitiver neuraler Stammzellen wird nach einer Verletzung beobachtet, mit Ausnahme von primitiven Neurosphären an der weißen Substanz auf der Ebene der Läsionsstelle.

Einmal gemeistert, kann die Operationstechnik in weniger als 40 Minuten durchgeführt werden. Und die Gewebedissektion und -isolierung kann bei richtiger Durchführung in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden. Nach dem chirurgischen Eingriff können je nach Tierstamm zusätzliche Methoden wie Immunhistochemie und Lineate Shocking verwendet werden, um zusätzliche Fragen wie Proliferationskinetik und Selbstschicksal der neuralen Vorläuferzellen nach einer Verletzung zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Neurosphären-Assay zur Beurteilung der Aktivierung neuraler Stammzellen nach einer Rückenmarksverletzung verwenden können.