Name: Ca2 + Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Erfahren Sie die Fluoreszenzmikroskopie zur Analyse lokaler und globaler Calciumsignale in HeLa-Zellen während Shigella-Infektionen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung pathogeninduzierter zellulärer Prozesse in vivo.

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Wir danken für ihre Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts Jenny-Lee Thomassin. Die Arbeit wurde unterstützt durch die ANR gewährt, MITOPATHO und PATHIMMUN, aus dem Labex Memolife und PSL IDEX Shigaforce gewährt. Chunhui Sonne ist ein Empfänger Ph.d. von der China Scholarship Council. Laurent Combettes und Guy Tran Van Nhieu sind Empfänger von einem WBI-Frankreich-Austausch Tournesol Programm N ° 31268YG (Wallonie-Brüssel International, Fonds De La Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires Étrangères et Européennes, Ministère de nannte Supérieur et De La Recherche Dans le Cadre des Partenariats Hubert Curien).

1. Vorbereitungen
<ol><li>
Bakterien-Vorbereitung
	<ol>
<li>Platte die Bakterien –Shigella Wildtyp Stamm mit dem Ausdruck der AfaE adhäsin (M90T-AfaE) – auf einem Trypticase Soja (TCS) Agar Platte mit 0,01 % Kongo-rot (CR) und inkubieren sie 18 h bei 37 ° C. Hinweis: Um ihre Reproduzierbarkeit zu erhöhen, die Shigella -Platten in Schritt 1.1.1 erhaltenen bei 4 ° C gelagert werden und sollte innerhalb einer Woche verwendet werden, da alle Kolonien auf CR-Medium im Laufe der Zeit schließlich rot angezeigt werden.</li>
		<li>TCS Pre bouillonkultur durch Abnehmen 3 rote Kolonien von den Streifen Platten zu impfen. Hinweis: Eine Impfung mit 3 Kolonien wird durchgeführt, um begrenzen die Wahrscheinlichkeit der Kommissionierung eines einzigen Klons, deren Virulenz Plasmid eine genetische Rekombination unterzogen wurde.</li>
		<li>Flüssige Bakterienkulturen in einem schütteln Inkubator für 16 h bei 37 ° C bei 200 u/min zu wachsen. Fügen Sie Ampicillin auf eine Endkonzentration von 75 mg/mL. Antibiotika-Konzentrationen sollte 3 x der minimalen inhibitorischen Konzentration nicht überschreiten, da ein Übermaß an Antibiotikum zum Verlust des großen Virulenz Plasmids führen kann. Hinweis: Die Wartung des Plasmids Shigella Virulenz sollte überprüft werden, durch Ausplattieren der Bakterienkulturen auf CR-Platten mit geeigneten Antibiotika-Konzentrationen ergänzt. Das Vorhandensein von weißen Kolonien zeigt Plasmid Verlust.</li>
		<li>Die TCS-Kultur mit der bakteriellen Vorkultur bei einer Verdünnung von 1: 100 zu impfen. Inkubieren Sie es bei 37 ° C in einem schütteln Inkubator für 2 h bei 200 u/min. Sicherstellen, dass die Extinktion bei 600 nm (OD600nm) ist 0,2 - 0,4.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur für 2 min bei 13.000 x g bei 21 ° C und Aufschwemmen das Pellet in gleichwertigem Umfang der EM Medium (120 mM NaCl, KCl 7 mM, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM Glukose und 25 mM HEPES pH = 7,3).</li>
		<li>Verdünnen Sie der Bakteriensuspension in einem EM-Puffer auf eine endgültige OD600nm 0,1 und sofort einsetzen Sie oder bei 21 ° C lagern Sie und verwenden Sie es innerhalb der nächsten 60 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Handy-Vorbereitung
	<ol>
<li>Kultur-HeLa-Zellen in DMEM mit 1 g/L Glukose mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS) ergänzt und bei 37 ° C mit 10 % CO2zu wachsen. Wachsen Sie TC-7 gewachsen in DMEM mit 4,5 g/L Glukose, mit 10 % FCS und nicht-essentiellen Aminosäuren in einem 37 ° C Inkubator mit 10 % CO2.</li>
		<li>Für Zelle verknüpft Wartung, teilen Sie die Zellen regelmäßig um eine Hemmung des Wachstums Kontakt zu vermeiden, konfluierende Staaten; Dies ist entscheidend für eine hohe Ca2 + Sonde laden/Transfection Leistungsfähigkeit.</li>
		<li>HeLa-Zellen auf sterile 25-mm-Durchmesser kreisförmige Deckgläsern in 6-Well-Platten bei einer Dichte von 3 x 105 Zellen/gut am Vortag das Experiment für die HeLa-Zellen-Platte.</li>
		<li>Für TC-7 Zellen trypsinize und Zellen zu zählen. Säen sie an 4 x 105 Zellen/Brunnen und inkubieren sie 5-7 Tage bei 37 ° C in einer 10 % CO2-Inkubator vor den versuchen, um eine Polarisierung zu ermöglichen.<ol>
<li>Aktualisieren Sie das Zellkulturmedium jeden Tag bis zum Tag des Experiments. Hinweis: Glasboden 35 mm Durchmesser Einweg-Kammern können auch als Alternative zu den Deckgläsern-haltigen Brunnen verwendet werden. Wenn letztere verwendet, Temperaturregelung durch einen beheizten Objekttisch oder Ziel nicht ausreichend ist und eine Thermostat Inkubation Kammer montiert auf ist der Mikroskoptisch erforderlich.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am Tag des Experiments, das Medium zu entfernen und waschen Sie die Zellen 3 X mit 1 mL EM Medium bei 21 ° C.</li>
	<li>Wägezellen Sie die mit 3 mM Fluo-4-AM14 in einem EM-Puffer für 30 min bei 21 ° C. Hinweis: Während das Laden der Sub konfluierende HeLa-Zellen keine große Probleme aufwirft, ist die Belastung des polarisierten TC-7 Zellen oft heterogenen und schlecht effizient. Für diese Zellen fanden wir, dass die laden-Effizienz durch die Zugabe von dem Dispergiermittel verstärkt wird – Pluronic Säure – auf eine Endkonzentration von 0,1 % und der Anionen-Transporter-Inhibitor Bromosulfophtalein auf eine Endkonzentration von 20 µM, die Fluo-4-Uhr-haltigen EM. Die Verwendung von chemischen ratiometrischen Sonden oder genetisch codiert-FRET Sonden, die erfordern Dual-Erwerb nicht kompatibel mit der Geschwindigkeit des Erwerbs für die Darstellung der lokalen Ca2 + Antworten erforderlich ist.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben 3 X mit EM Puffern und inkubieren sie weiter in 1 mL EM Puffer bei 21 ° C für die Hydrolyse von AM Glyko-ermöglichen. Verwendung Fluo-4 geladen Zellen sofort oder innerhalb der nächsten 90 min (gepflegt bei 21 ° C).</li>
</ol>(2) Infektion und Bildaufnahme der lokalen Ca2 + Antworten
<ol><li>Ort das Deckglas mit Fluo-4 geladen Zellen in einer bildgebenden Kammer oder Glas-untere Kammer. Waschen Sie die Proben in der bildgebenden Kammer oder Glasboden Einweg Kammer 3 X mit EM Puffer, Verbindungen, die möglicherweise durch Lyse der Zelle zu entfernen. Fügen Sie 1 mL EM-Puffer.</li>
	<li>Legen Sie die Kammer auf einer invertierten Fluoreszenz-Mikroskop-Bühne bei 33 ° c erwärmt Hinweis: Diese Temperatur ist als Kompromiss zwischen den optimalen Temperaturen kompatibel mit dem Shigella -Invasion-Prozess und die Verlangsamung des Ca2 + Antworten ausgewählt, um lokale Lösungen zu visualisieren. Wir verwenden eine 63 X eintauchen Öl Ziel (NA = 1,25) mit Phase Kontrast Ringen ausgestattet.</li>
	<li>Wählen Sie ein Feld der Mikroskopie und richten Sie Aufnahmeparameter, einschließlich der Belichtungszeit und binning, falls erforderlich, um das Fluoreszenzsignal Fluo-4 zu optimieren. Hinweis: Die großen Herausforderungen der lokalen Ca2 + Bildgebung sind niedrige Amplitude und die kleinen Dauer der Antworten, erfordert den Erwerb mindestens alle 30 ms mehrere handelsübliche Rückseite beleuchtet EM-CCD- oder C-MOS Kameras präsentieren die erforderlichen Sensibilität zu lokalen Ca2 + Antworten mit Fluo-4 zu erkennen. Empfindlichkeit ist auch ein wichtiges Thema, lichtbedingten oder Artefakte wie spontane Reaktionen verknüpft die fluoreszierenden Anregung der Fluo-4 mit einer hohen Frequenz zu begrenzen. Hier, eine LED-basierte Beleuchtung von 470 nm, mit einem 480 ± 40 nm Anregung Bandpaßfilter, 505 nm dichroitische Filter und eine 527 ± 30 nm Bandpass-Emission bei 5 % seiner maximalen Intensität kombiniert mit einem 1,0 Graufilter verwendet wurden verwendet, um diese Probleme zu minimieren unter dem Strahl des Übernahmen von begrenzter Dauer. Eine Analyse der lokalen Ca2 + Signale von Chargen von 120 s-Streams wurde routinemäßig durchgeführt. Unter diesen Bedingungen geringer Beleuchtung wurde Fluorophor Immunofluoreszenz während 2 min-Stream Akquisitionen nicht beobachtet. Aufeinander folgende Akquisitionen an derselben Probe können durchgeführt werden, sofern verschiedene Felder verwendet werden. Als in der Regel erfolgt ein erste Akquisition Stream ein Kontrollfeld in der Abwesenheit von Bakterien Stimulation auf das Fehlen der spontanen Antworten zu gewährleisten. Wenn spontane Reaktionen beobachtet werden, werden die Proben mit EM-Puffer gewaschen, bis keine Reaktionen beobachtet werden.</li>
	<li>Um Bakterien zum Beispiel hinzuzufügen, entfernen Sie 500 µL Puffer EM aus der Kammer zu, und fügen Sie 500 µL Bakteriensuspension, die in Schritt 1.1.6 vorbereitet, um eine endgültige OD600nm von 0,05, mit der gebotenen Sorgfalt zu vermeiden, Verschieben der ausgewählten Mikroskopie-Bereich zu erhalten; die Bände sorgen für eine richtige Mischung von Bakterien und eine homogene Verteilung der Bakterien auf die Zellproben.</li>
	<li>Führen Sie eine Übernahme auf die bakterielle Zugabe. Alternativ führen Sie eine Akquisition 10 min nach dem bakteriellen hinzufügen, das entspricht der zeitliche Aufwand für Bakterien zu sedimentieren auf Zellen unter Bedingungen verwendet. Am Ende des Datenstroms Erwerb erwerben Sie ein Phasenkontrast-Bild des ausgewählten Feldes, die Bakterien, die Kontaktaufnahme mit den Zellen und die Membran Rüschen bakteriellen Invasion Websites zugeordnet zu visualisieren.</li>
	<li>Wiederholen der Erwerb wie in Schritt 2.5, in Abständen, die für die Dauer der Bild Akquisitionen, Dateien Einsparungen und Auswahl eines neuen Felds zur Deckung des gesamten Prozesses zugänglich sind. Hinweis: Für Shigellafanden wir, dass Erwerb streamt alle 5 min für 20 min, nach der 10 min bakterielle Sedimentation, erlaubt, den Großteil der Invasion Veranstaltungen zu decken.</li>
	<li>Fügen Sie am Ende des Verfahrens Übernahme eine Endkonzentration von 2 µM der Ca2 + Ionophore Ionomycin Proben zu bestimmen, die maximale Amplitude der Ca2 + -Signale. Abrufen von Bildern jedes 3-5 s bis Signal Stabilisierung, in der Regel für weniger als 10 Minuten.</li>
	<li>Folgen Sie durch Hinzufügen von Ca2 + Chelator EGTA an eine Endkonzentration von 10 mM bis das Fluoreszenzsignal bei fehlender Ca2 +zu bestimmen. Abrufen von Bildern jedes 3-5 s bis Signal Stabilisierung, in der Regel für weniger als 10 Minuten. Hinweis: Wegen der relativ langsame Dynamik der globalen Ca2 + Variationen führen Sie diese übernahmen alle 3-5 s (nicht im Streaming-Modus), zulassend Ca2 + imaging auf einem mikroskopischen Feld während der aufeinanderfolgenden Behandlungen.</li>
</ol>3. Analyse
<ol><li>Express cytosolischen Ca2 + Variationen im Laufe der Zeit als der Prozentsatz der ΔF/F0, wo ΔF die Veränderung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der Region of Interest (ROI stellt) und F0 die Grundlinie Fluoreszenz im gleichen ROI, zu dem ein nicht relevante Region des Feldes frei von Zellen wird abgezogen.<ol>
<li>Entfernen Sie die basalen Fluoreszenz-Ebenen für jede Zelle in verschiedenen Bereichen, Ausgangswert entspricht; Diese Ebenen eindeutig ermittelt werden, aufgrund der niedrigen Frequenz und relativ kurze Dauer der lokalen Ca2 + Antworten in einer angegebenen Stream-Akquisition. Hinweis: Quantifizieren Sie auffälligsten Merkmale der Antworten in Bezug auf die gestellten Fragen und die pathogenen Modell untersucht. Klassischerweise werden verschiedene Parameter berücksichtigt, Ca2 + Signale, einschließlich der Häufigkeit der Zellen mit lokalen oder globalen Ca2 + Antworten, sowie die Dauer, Amplitude und Frequenz dieser Antworten zu analysieren. Im Falle von Shigella und lokale Reaktionen ist ein weiterer wichtiger Aspekt der Analyse die räumliche Vereinigung der Antworten mit bakteriellen Invasion Websites.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zur Quantifizierung des Anteil der reagieren Zellen zeigen globale oder lokale Reaktionen zeichnen ROIs in Zellen, in Zeitreihen, die Variationen der Fluo-4 Intensität entspricht.<ol>
<li>Stellen Sie strenge Parameter, lokale Ca2 + Antworten, z. B. eine Amplitude von dreifache oben Hintergrund Variationen der durchschnittliche Fluoreszenz Intensität Zelle Baseline oder einer Dauer von mindestens 200 ms, zu identifizieren, um zu vermeiden, erzielte einen Fehlalarm. Hinweis: Als Faustregel, auch kleine lokale Ca2 + Antworten von unterschieden werden störende Hintergrundgeräusche durch ihr Profil. ROIs sollte groß genug, um genügend Fluoreszenz-Signale, um die Erkennung von lokalen Variationen ermöglichen zu integrieren. Je nach Intensität der Fluo-4-Erkennung können diese ROIs Kreise mit Durchmessern von 2-5 mM entsprechen.</li>
		<li>Messen Sie die Variationen der durchschnittliche Fluo-4 Fluoreszenzintensität in 2 Regionen in einem eigenständigen Bereich der gleichen Zelle, um festzustellen, ob die Antworten lokal oder global sind. Hinweis: Die Analyse einer großen Anzahl von Zellen wird durch den Einsatz von imaging-Software ermöglicht die Online-Bildschirmanzeige der Variationen der durchschnittliche Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit für die ausgewählten Regionen erleichtert. Handelsüblicher imaging-Software hat eine solche Option, aber dies kann auch mit der Icy Freeware, mit dem ROI Intensität Evolution Plugin durchgeführt werden.</li>
		<li>Bestimmen Sie den Anteil der Zellen zeigt lokale Reaktionen. Hinweis: Dieser Prozentsatz errechnet sich aus der Gesamtzahl der Zellen im Bereich Mikroskopie, die in ausreichender Zahl zur Unterstützung sollte analysiert eine statistisch Bedeutung mit einem nicht-parametrischen Test.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Dauer der lokalen Reaktionen. Hinweis: Lokale Ca2 + Antworten weiter unterschieden werden nach ihrer Dauer reicht (d.h. weniger als 500 ms, zwischen 5 und 10 s oder über 10 s) und ihrer Verbindung mit Shigella Invasion Websites.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Amplitude der Antworten zu quantifizieren. Erstens kalibrieren Sie die maximalen Ca2 + und Zelle Hintergrundwerten ermittelt wie in Schritt 2.1.7. Da die Fluo-4 Last für jede Zelle variieren kann, führen Sie diese Bestimmungen für einzelne Zellen im Feld.<ol>
<li>Drücken Sie die Amplitude der Antworten als relative Prozentsatz der maximalen Antwort.</li>
		<li>Durchzuführen Sie statistische Tests mit einem Normalität Test, gefolgt von einem parametrischen Test Potentialdifferenzen in der Amplitude der Reaktionen zwischen Proben analysieren.</li>
		<li>Bestimmen der Verein dieser Antworten Bezug zu der bakteriellen Invasion Websites durch ihre jeweiligen Lokalisation, die bakteriell bedingte Membran-Rüschen in der entsprechenden Phase kontrastreiche Bilder visualisiert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li>
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<li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567(2013).</li>
<li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+PtdIns%284%2C5%29P%282%29+into+PtdIns%285%29P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li>
<li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li>
<li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+Ca2%2B+requirement+of+calpain+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fluorescent+Ca2%2B+indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li>
<li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2%2B+signals+during+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li>
<li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes%2C+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verzollen.

Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll, das wir entwickelt, um lokale Ca2 + Signale während der relativ kurzen Kinetik einer Shigella -Invasion, sowie globale Ca2 + Antworten während der erweiterten Kinetik von Shigellazu folgen. Im folgenden Signale Schlüssel finden Sie Themen, die angesprochen werden, um die Erkennung von Ca2 + optimieren müssen bei gleichzeitiger Minimierung der Interferenzen mit der biologischen Prozesse.
Chemischen v...

Ca2 + regelt alle bekannten Zellprozesse, einschließlich Zellskelett Reorganisation, Entzündungsreaktionen und Zelle Tod Wege im Zusammenhang mit Wirt-Pathogen Interaktionen1,2,3. Unter physiologischen Bedingungen basale cytosolische Ca2 + Konzentrationen sind niedrig, in den Hunderten von nM-Bereich, aber können zu einem vorübergehenden Anstieg nach Agonist Stimulation unterzogen werden. Diese Variationen zeigen oft oszillierende Verhalten durch das Wirken von Pumpen und Kanäle im Plasma und endoplasmatische Retikulum Membranen. Das Muster dieser Schwingungen zeichnet sich durch die Zeit, Dauer und Amplitude der Ca2 + erhöht und wird durch Zellen, die wiederum bestimmte Reaktionen lösen in, was als Ca2 + Code4,5 bekannt entschlüsselt . Eine nachhaltige Steigerung der cytosolischen Ca2 + Konzentration unter pathologischen Bedingungen führen zum Zelltod führt die Permeabilisierung der mitochondrialen Membranen und die Freisetzung von Pro-apoptotische oder nekrotischen Faktoren6zugeordnet, 7.
Shigella, dem Erreger der bazillendysenterie, dringt Epithelzellen durch Einspritzen von Effektoren in Wirtszellen mit einem Typ III-Sekretion System (T3SS)8,9. Eine Shigella -Invasion von Wirtszellen ist verbunden mit lokalen und globalen Ca2 + Signale ausgelöst durch die T3SS. Für Pore bilden Giftstoffe, die T3SS-Translocon, die fügt in Host Zellmembranen und ist erforderlich für die Injektion von T3SS Effektoren wahrscheinlich ist verantwortlich für die Aktivierung der SPS und der Inosit (1, 4, 5)-Trisphosphate (InsP3)-abhängige Ca2 + lassen Sie los. Die Kombination aus der lokalisierten PLC-Stimulation und die Anhäufung von polymerisierten Aktin an Standorten eines Shigella Invasion führen eine untypisch lang andauernde InsP3-abhängige Ca2 + release10. Der Typ-III-Effektor IpgD, ein Phosphatidyl 4,5-Bisphosphate (PIP2)-4-Phosphatase, beschränkt die lokalen PIP2, wodurch die Steuerung der Menge der verfügbaren Substrat für SPS, InsP3, generieren, die an die enge des lokalen Ca2 + trägt Antworten bei bakteriellen Invasion Seiten11,12. Diese lokalen Ca2 + Antworten wahrscheinlich dazu beitragen, die Aktin-Polymerisation bei Shigella Invasion Websites10. Globalen Ca2 + Antworten, die jedoch auch durch Shigella, ausgelöst werden sind entbehrlich für die bakterielle Invasion Prozess aber auslösen, die Öffnung der Connexin-Hemichannels an der Plasmamembran und die Freisetzung von ATP in der extrazellulären Fach. Freigesetzte ATP Parakrine handeln, stimuliert wiederum Ca2 + oszillierende Reaktionen in den Zellen neben der infizierten Zelle. IpgD ist auch verantwortlich für die Gestaltung der globalen Ca2 + Antworten zu unberechenbar isolierten Reaktionen mit langsamen Dynamik. IpgD führt schließlich, nach einer längeren bakterielle Infektion auf die Hemmung der InsP3-vermittelten Ca2 + Signale. Durch seine Einmischung mit Ca2 + Signalisierung IpgD verzögert eine Ca2 +-abhängigen Calpain Aktivierung führt zu die Demontage der fokale Adhäsion Strukturen und die vorzeitige Ablösung von infizierten Zellen13.
Während Ca2 + Signale wichtige Aspekte der Pathogenese beteiligt sind, wirft die Verwendung eines Mikroorganismus eine Reihe von technischen Herausforderungen, die nicht im klassischen Agonist Studien anzutreffen sind. Die Protokolle beschrieben verwenden Sie hier die häufigsten verwendeten fluoreszierenden Ca2 + chemischen Indikator Fluo-4, die wir entwickelt, um lokale Ca2 + Signale während einer Shigella Infektion zu charakterisieren. Schritte für die Erkennung dieser Signale werden erläutert, sowie Verfahren für die Quantitative Analyse, die erforderlich sind, um die Rolle der bakteriellen Effektoren in Ca2 + Signalisierung zu charakterisieren.

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Version 7.7</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolLED-Beleuchtungssystem pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroschüssel 35 mm, hoch&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soja (TCS) Bouillon</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>TCS Agar</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>Kongorot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>Shigella flexneri Serotyp V. exprimiert das AfaE adhesin</td><td></td></tr><tr><td>ipgD-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>isogener ipgD-Mutantenstamm, der das AfaE-Adhesin</td><td></td> exprimiert</tr></tbody></table>

ca2 + antworten imaging während der shigella infektion von epithelzellen

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2 + ist eine allgegenwärtige Ion alle bekannten zellulären Prozessen beteiligt. Während globale Ca2 + Antworten Zelle Schicksal beeinträchtigen können, Regeln lokale Variationen in frei Ca2 + cytosolischen Konzentrationen, verbunden zum lösen vom internen Speicher oder einen Zustrom durch Plasmamembran Kanäle, kortikale Zellprozesse. Krankheitserreger, die an oder dringen Host Zellen Trigger eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts zugrunde liegenden Host Plasmamembran, die wahrscheinlich sowohl auf globaler als auch auf lokalen Ca2 + Signalisierung betrifft. Da diese Ereignisse bei niedrigen Frequenzen in einer Pseudo-stochastische Weise über erweiterte Kinetik auftreten können, wirft die Analyse von Ca2 + Signale durch Krankheitserreger verursacht große technischen Herausforderungen, die angegangen werden müssen.
Hier berichten wir Protokolle zum Nachweis von globalen und lokalen Ca2 + Signale auf eine Shigella Infektion der Epithelzellen. In diesen Protokollen Artefakten verknüpft zu einer längeren Exposition und lichtbedingten verbunden mit der Anregung von Ca2 + fluoreszierende Sonden sind streng kontrollieren die Aufnahmeparameter über definierte Zeiträume während einer Fehlerbehebung Shigella Invasion. Verfahren werden implementiert, um konsequent die Amplitude und Frequenz der globalen cytosolischen Ca2 + Signale analysieren während der ausgedehnten Infektion Kinetik mit der chemischen Sonde Fluo-4.

Shigella Invasion ist atypisch lang anhaltende lokale Ca2 + Antworten zugeordnet:
Nach dem oben genannten Protokoll Fluo-4 geladen HeLa-Zellen wurden mit WT Shigella herausgefordert und Stream Akquisitionen wurden durchgeführt, um Ca2 + Signale analysieren. Abbildung 1zeigt eine repräsentative Experiment mit Zeitraffer-Bilder-Serie von der Fluoreszenzintensität d...

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um Kalzium (Ca2 +) Reaktionen hervorgerufen durch HeLa-Zellen infiziert durch Shigellazu visualisieren. Durch die Optimierung der Parameter der bakteriellen Infektion und Bildgebung mit Ca2 + fluoreszierende Sonden, sind atypische globaler und lokaler Ca2 + Signale über einen grossen Bereich der Infektion Kinetik durch Bakterien verursachten gekennzeichnet.

Ca2 + Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Das übergeordnete Ziel dieser fluoreszierenden mikroskopischen Analyse mit chemischen Sonden ist es, lokale und globale Kalziumreaktionen zu analysieren, die von Wirtszellen während einer Infektion mit pathogenen Shigellen ausgelöst werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der zellulären Mikrobiologie zu beantworten, wie z.B. die durch Krankheitserreger induzierte Signalübertragung, die zur Reorganisation des Zytoskeletts oder zum Zelltod führt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass man mit chemischen Sonden lokale Kalziumsignale verfolgen kann, die mit lokalen Prozessen verbunden sind, die vom Erreger abgelenkt werden.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie Parameter einstellen müssen, die es ermöglichen, lokale Kalziumsignale zu verfolgen und gleichzeitig die Integrität biologischer Proben zu erhalten. Zu Beginn wird die Wildtyp-Shigella, die die AfaE-Adhäsion exprimiert, auf eine Trypticase-Soja- oder TCS-Agarplatte mit 0,01 % Kongorot aufgefüllt und die Platten 18 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Bereiten Sie aus den gestreiften Platten Vorkulturen vor, indem Sie drei rote Kolonien auswählen und TCS-Bouillon mit 75 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin beimpfen.Züchten Sie die Flüssigkulturen in einem Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für 16 Stunden. Als nächstes beimpfen Sie TCS mit der bakteriellen Vorkultur in einer Verdünnung von 1:100. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator bei 200 U/min für zwei Stunden.Stellen Sie sicher, dass die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,2 bis 0,4 beträgt. Zentrifugieren Sie die Kultur zwei Minuten lang bei 13.000 g und 21 Grad Celsius und suspendieren Sie das Pellet in einem äquivalenten Volumen EM-Medium. Verdünnen Sie die Bakteriensuspension in EM-Puffer bei einem End-OD 600 von 0,1 und verwenden Sie sie sofort oder lagern Sie sie bei 21 Grad Celsius und verwenden Sie sie innerhalb der nächsten 60 Minuten.Züchten Sie HeLa-Zellen in DMEM mit einem Gramm pro Liter Glukose, ergänzt mit 10 % FCS, und züchten Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius mit 10 % CO2. Züchten Sie TC7-Zellen in DMEM mit 4,5 Gramm pro Liter Glukose, 10 % FCS und nicht-essentiellen Aminosäuren und kultivieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 10 % CO2. Um die Zellen zu erhalten, teilen Sie die Zellen regelmäßig, um eine Hemmung des Wachstumskontakts zu vermeiden, die mit konfluenten Zuständen verbunden ist.Dies ist entscheidend für eine hohe Belastung der Kalziumsonde und die Transfektionseffizienz. Trypsinisieren und zählen Sie die TC7-Zellen. Am Tag vor dem Experiment mit HeLa-Zellen plättieren Sie die Zellen auf sterile kreisförmige Deckfolien mit einem Durchmesser von 25 Millimetern in Sechs-Well-Platten mit einer Dichte von dreimal 10 zu den fünf Zellen pro Well.Um eine Polarisation vor den Experimenten zu ermöglichen, säen Sie die Zellen dann in viermal 10 bis fünf Zellen pro Vertiefung aus und inkubieren Sie sie fünf bis sieben Tage lang, wobei das Medium jeden Tag ausgetauscht wird. Entfernen Sie am Tag des Experiments das Medium und verwenden Sie einen Milliliter EM-Medium, um die Zellen dreimal zu waschen. Beladen Sie die Zellen mit drei mikromolaren Fluo-4 AM- und EM-Puffern und inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 21 Grad Celsius.Waschen Sie die Proben mit EM-Puffer dreimal, fügen Sie dann einen Milliliter EM-Puffer hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 21 Grad Celsius, um die Hydrolyse des AM-Teils zu ermöglichen. Legen Sie das Deckglas mit den mit Fluo-4 beladenen Zellen in eine Bildgebungs- oder Glasbodenkammer. Verwenden Sie EM-Puffer, um die Probe dreimal zu waschen, um Verbindungen zu entfernen, die möglicherweise aus der Zelllyse resultieren.Fügen Sie dann einen Milliliter EM-Puffer hinzu. Stellen Sie die Kammer auf einen inversen Fluoreszenzmikroskoptisch, der auf 33 Grad Celsius erhitzt wird. Wählen Sie ein Mikroskopiefeld aus und richten Sie bei Bedarf Erfassungsparameter wie Belichtungszeit und Binning ein, um das Fluoreszenzsignal von Fluo-4 zu optimieren.Um der Probe Bakterien hinzuzufügen, entfernen Sie vorsichtig 500 Mikroliter EM-Puffer aus der Kammer und fügen Sie 500 Mikroliter der Bakteriensuspension hinzu, um einen endgültigen OD 600 von 0,05 zu erhalten. Führen Sie sofort eine Akquisition durch oder warten Sie 10 Minuten, damit sich die Bakterien auf den Zellen ansiedeln können. Am Ende des Erfassungsstroms wird ein Phasenkontrastbild des ausgewählten Feldes aufgenommen, um die Bakterien, die mit den Zellen in Kontakt kommen, und die Membrankräuselungen, die mit den bakteriellen Invasionsstellen verbunden sind, zu visualisieren.Wiederholen Sie den Aufnahmevorgang in Intervallen, die der Dauer der Bildaufnahmen, der Dateispeicherung und der Auswahl eines neuen Feldes entsprechen, um den gesamten Prozess abzudecken. Am Ende des Erfassungsvorgangs wird der Probe zwei Mikromolare des Calciumionophors Ionomycin zugesetzt, um die maximale Amplitude der Calciumsignale zu bestimmen. Nehmen Sie alle drei bis fünf Sekunden Bilder auf, bis sich das Signal stabilisiert hat, in der Regel für weniger als 10 Minuten.Anschließend wird der Calciumchelator EGTA bis zu einer Endkonzentration von 10 Millimolar zugegeben, um das Fluoreszenzsignal in Abwesenheit von Calcium zu bestimmen. Nehmen Sie alle drei bis fünf Sekunden Bilder auf, bis das Signal stabilisiert ist, in der Regel für weniger als 10 Minuten. Führen Sie eine Bildanalyse gemäß dem Textprotokoll durch.In diesem Experiment wurden Fluo-4-beladene HeLa-Zellen mit Wildtyp-Shigellen provoziert und Stromakquisitionen durchgeführt, um Kalziumsignale zu analysieren. Eine Zeitraffer-Bildserie der Fluoreszenzintensität der Fluo-4-Sonde wird in einem für eine einzelne Zelle interessierenden Bereich gemittelt und das entsprechende Phasenkontrastbild gezeigt. Atypische lokale Erhöhungen des freien zytosolischen Kalziums werden an der Shigella-Invasionsstelle mit einer unterschiedlichen Amplitude und Dauer von 2,5 bis fünf Sekunden beobachtet, gefolgt von globalen Erhöhungen in der infizierten Zelle.In diesem Beispiel induzierte ein isogener Mutantenstamm, der für den Typ-III-Effektor IpgD, eine Phosphatidyl-4,5-Bisphosphat-Phosphatase, defizient ist, im Vergleich zum Wildtyp-Shigella-Stamm globalere und weniger atypische lokale Reaktionen mit langer Dauer. Wie in diesem Experiment zu sehen ist, zeigt die Abbildung der globalen Kalziumreaktionen über eine ausgedehnte Infektionskinetik eine Abnahme der Häufigkeit der Reaktionen 30 Minuten nach der Provokation mit Wildtyp-Shigellen. Schließlich verdeutlicht die Quantifizierung dosisabhängiger Zellreaktionen auf den Calciumagonisten Histamin die Hemmung einer Inositoltriphosphat-abhängigen Calciumfreisetzung in späten Stadien einer Shigella-Infektion.Nach diesem Verfahren können alle Methoden, die kompatible Flüssigkeiten und Bildgebung kombinieren, gleichzeitig durchgeführt werden, um die Rolle der Kalziumsignale in einem bestimmten Prozess zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie Abfallentsorgung, Reinigung kontaminierter Oberflächen oder Geräte getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Vonaesch, P. et al., Immunfluoreszenzanalyse der Stressgranulatbildung nach bakterieller Herausforderung von Säugetierzellen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert die Infektion von Epithelzellen mit dem pathogenen Bakterium Shigella flexneri und die daraus resultierende zelluläre Reaktion des Wirts. Bakterielle Effektorproteine stören die Wirtstranslation und lösen die Bildung membranloser Organellen aus, sogenannte Stressgranulate, die die adaptive Reaktion der Zelle auf...

Stressgranulatbildung während der Shigella-Infektion von krebsartigen Epithelzellen

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

Dieses Video demonstriert eine Technik zum Nachweis der lokalen und globalen Kalziumionenreaktion bei einer Shigelleninfektion von menschlichen Epithelzellen. Shigella dringt in die Wirtszellen ein und setzt Invasionseffektoren frei, die sich auf den intrazellulären Kalziumspiegel auswirken. Die Amplitude und Frequenz des lokalen und globalen zytosolischen Calciums werden mit Hilfe eines Fluoreszenzindikators untersucht.

Ein bildgebendes Verfahren zur Untersuchung der Kalziumreaktion in bakterieninfizierten Zellen

Wir beschreiben ein Verfahren zum Verfolgen der endomembrane Bruch hervorgerufen durch die intrazelluläre...

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

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Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

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Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

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Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

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Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

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Ca^{2 +} Antworten Imaging während der Shigella Infektion von Epithelzellen

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