Name: Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Giftstoffe aus Raubwanzen und anderen Heteropteren durch Elektrostimulation, Provokation oder Drüsensektion gewinnen. Diese Methoden ermöglichen die Charakterisierung bisher wenig erforschter Insektengifte für biomedizinische Anwendungen.

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Wir anerkennen finanzielle Unterstützung von der Australian Research Council (Zuschüsse DP130103813 und LP140100832, G.F.K., DECRA Gemeinschaft DE160101142, EABU), der Australian National Health & Medical Research Council (Principal Research Fellowship APP1044414, G.F.K.), und der University of Queensland (Postdoctoral Fellowship, A.A.W.).

Dieses Protokoll entspricht der University of Queensland Maßnahmengruppe in Responsible Care und das Verwenden von Tieren in Forschung und Lehre (PPL 4.20.11) sowie die National Health und Medical Research Council Australian Code für die Pflege und Nutzung der Tiere für wissenschaftliche Zwecke (8th Edition 2013).
Achtung: Achten Sie darauf, nicht Envenomated werden beim Umgang mit Assassin Bugs. Achten Sie darauf, um die Augen zu schützen, im Umgang mit Arten, die Venom defensiv zu spucken. Kümmern sich im ganzen nicht auf Versuchstiere zu verletzen. Dazu gehören Überwachung des Drucks über Beschränkungen wie Gummibänder und um sicherzustellen, dass der Rüssel nicht unterbrochen wird.
Hinweis: Optional, Betäuben Tiere durch die Einwirkung von CO2 für 0,5-2 min oder Kühlung auf 4-10 ° C vor der Venom Ernte 1-3 soll sichere Übertragung und Zurückhaltung zu erleichtern. Betäubung ist nicht unbedingt erforderlich aber sichere Zurückhaltung der agile oder starke Proben erleichtern kann. Tiere dürfen jedoch, wach um Venom Ernte zu ermöglichen. Behalten Sie downstream-Anwendungen im Hinterkopf, wenn die Entscheidung, ob Proteaseinhibitoren hinzufügen.
1. Ernte Venom Giftstoffe durch Elektrostimulation
<ol><li>Erhalten Sie lebende Exemplare, um Giftstoffe zu ernten.</li>
	<li>Einsatz vorbereitete Kunststoff Pinzette mit positiven und negativen Elektroden montiert auf beiden Tipp. Schließen Sie elektrifizierte Pinzette an ein Elektrostimulator oder eine Quelle für konstante Spannung, der ermöglicht die Anpassung der Spannung an.<ol>
<li>Verwenden Sie für kleine (~ 10 mm) und groß (~ 25 mm) Assassin Bugs Peak Spannungen von 15 und 25 V bzw..</li>
		<li>Verwenden Sie für größere Wanzen wie riesige Wasserwanzen bis zu 40 V.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zurückhalten Sie live Fehler durch Umreifen sie zu einer Plattform mit einem Gummiband über dem Thorax.</li>
	<li>Setzen Sie die Spitze der Rüssel in einen entsprechenden Hinweis sammeln. Verwenden Sie für Assassin Bugs einer PIPETTENSPITZE P200. Für riesige Wasserwanzen, schneiden die Extremität aus ein P200-Tipp, um die Blende zu vergrößern.<ol>
<li>Heben Sie den Rüssel mit einem geschlossenen sauberen Pinzette und schieben Sie offenen Blende der Sammlung Spitze über das Ende der Rüssel.</li>
		<li>Falls gewünscht, Aufnahme ~ 5 µL Reinstwasser vor Erteilung der Rüssel in das Sammeln Tipp. Dies reduziert die Verluste Gift bleibt innerhalb der Spitze, obwohl die geernteten Venom verdünnt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gelten Sie Elektrostimulation. Tauchen Sie die stimulierenden Elektroden in leitfähigen Gel, wie 2,5 M NaCl/50% Glycerin. Bringen Sie die Elektroden auf den Brustkorb. Belostomatids beantragen Sie die beiden Elektroden an die dorsale hintere Oberfläche des Kopfes.</li>
	<li>Speichern Sie Venom, Autodegradation zu verhindern. Nachdem Venom extrudiert wird, übertragen Sie schnell auf ein Rohr bei-20 ° C oder-60 ° C oder ein Röhrchen mit Protease-Inhibitor Cocktail.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,5 und 1,6 bis ausreichend Venom übernommen wird oder keine weiteren Venom bevorstehend ist.</li>
</ol>2. Gewinnung von Venom Giftstoffe durch Belästigung
<ol><li>Bereiten Sie Tiere für die Ernte von Venom und setzen Sie die Spitze der Rüssel in einen Vorraum der Sammlung, wie in den Absätzen 1.1 und 1.3-1.4 beschrieben.</li>
	<li>Wenn Venom spontan extrudiert wird, gehen Sie zu Schritt 2.3. Ist dies nicht der Fall, die Tiere zu belästigen, sanft berühren sie an Beinen, Bauch und Antennen mit einer Pinzette bis Venom entsteht.</li>
	<li>Übertragen Sie schnell Venom auf ein Rohr bei-20 ° C oder 60 ° C oder ein Rohr mit Proteasehemmer cocktail, falls gewünscht.</li>
</ol>3. Gewinnung von Venom Giftstoffe durch Belästigung von Venom "Spucken" Arten
<ol><li>Betäuben Sie oder betäuben Sie teilweise, das Insekt vor Herausnahme aus seinem Gehege, vorzeitige defensive spucken zu verhindern.</li>
	<li>Venom spucken Verhalten zu provozieren. Enthalten Sie, und positionieren Sie das Insekt mit dem tiefen Deckel von einem Standard 90 x 16 mm Petrischale. Halten Sie den Deckel leicht posterior und 1-4 cm über das Insekt, Flug zu verhindern. Die meisten Insekten werden mehrfach, oft kurz hintereinander spucken. Sicherstellen Sie, dass alle Venom auf der Unterseite der Schale gesammelt wird.</li>
	<li>Sammeln Sie die Venom auf der Unterseite der Petrischale durch Spülen mit 10 µL Reinstwasser. Übertragen Sie schnell auf ein Rohr bei-20 ° C oder-60 ° C oder ein Röhrchen mit Protease-Inhibitor Cocktail.</li>
</ol>4. Ernte Venom Giftstoffe durch Drüse Dissektion
<ol><li>Tiere zu opfern. Stark zu betäuben oder zu töten, Tiere mit > 5 min Exposition gegenüber CO2. Rohr-pure CO2 direkt in die Luftlöcher des Tieres Gehäuse Gehäuse.</li>
	<li>PIN-Insekt Dissektion Tray. Sezieren Sie für Assassinen Bugs durch die ventrale Oberfläche (4.3). Sezieren Sie für riesige Wasserwanzen durch die dorsalen Oberfläche (4.4).</li>
	<li>Ventralen Dissektion<ol>
<li>Fügen Sie drei Stifte in den hinteren Bauchraum das Insekt ohne Durchbohrung der Giftdrüsen gedrückt.</li>
		<li>Geschnitten Sie einen kurze Mittellinie Schnitt in der ventralen Oberfläche des Bauches mit einer Miniatur-Skalpell. Verwenden Sie Miniatur Schere, um die Mittellinie Inzision anterior auf den Kopf, kümmert sich um das Exoskelett nur schneiden und beschädigt nicht die interne Strukturen zu verlängern.</li>
		<li>Um die internen Strukturen aufzudecken, machen Sie mehrere seitliche Einschnitte erstreckt sich von der Mittellinie Schnitt an der Seite des Insekts. Dann pin wieder jede Klappe des ventralen Exoskelett, interne Strukturen zu offenbaren.</li>
		<li>Machen Sie für große Assassin Bugs vier seitliche Einschnitte in die Mitte des Abdomen, vorderen Bauch, zwischen ersten und zweiten Beine und vor der ersten Etappe.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dorsalen Dissektion<ol>
<li>Entfernen Sie die Flügel in der Nähe der Basis. Fügen Sie drei Stifte in den hinteren Bauchraum das Insekt ohne Durchbohrung der Giftdrüsen gedrückt.</li>
		<li>Schneiden Sie einen Mittellinie Schnitt aus dem Kopf auf den Bauch mit Miniatur-Schere und Skalpell, kümmert sich um das Exoskelett nur geschnitten und interne Strukturen nicht zu beschädigen.</li>
		<li>Erzwingen Sie die beiden Hälften des Insekts auseinander. Platzieren von mehreren Pins seitlich entlang der Länge des Insekts, der inneren Hohlraum ausgesetzt zu verlassen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Flugmuskeln mit einer Pinzette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Dissektion Tablett zu überfluten. Fügen Sie PBS, bis der Fehler untergetaucht ist, um interne Strukturen hinaufschweben und werden leichter visualisiert.</li>
	<li>Mit Pinzette und Mikro-Schere, vorsichtig, Binde- und Nervengewebe und Luftröhre. Die Giftdrüsen erscheinen als länglich, durchscheinend Strukturen entlang jeder Seite der Verdauungskanal erstreckt.<ol>
<li>Identifizieren Sie die wichtigste Drüse durch ihr charakteristisches Erscheinungsbild, mit vorderen und hinteren Lappen und zwei Kanälen an der Hilus.</li>
		<li>Falls gewünscht, identifizieren Sie die Zubehör Drüse durch das Rohr aus dem Hilus verfolgen. Befreien Sie die wichtigste Drüse durch Schneiden die zwei Kanäle aus dem Hilus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ernten Sie die gewünschte Drüse Lumen. Übertragen die Drüse zu einem Microcentrifuge auf Eis mit 30 µL PBS oder RTL plus Proteaseinhibitor cocktail. Die Drüsen mit einer sauberen scharfe Nadel Lanze.<ol>
<li>Vortex für 10 s und Zentrifuge (1 min, 5.000 × g, 4 ° C), die Drüse Lumen zu leeren. Entfernen Sie das Drüsengewebe mit einer Pinzette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klären des Toxin-Extraktes. Zentrifuge (5 min, 17.000 × g, 4° C), feste Partikel, Beibehaltung des Überstands und verwerfen die Pellets zu entfernen. Lagerung bei-20 ° C und-60 ° C bis Autoproteolytic Abbau zu verhindern.</li>
</ol>

<ol><li>Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venoms+of+heteropteran+insects%3A+A+treasure+trove+of+diverse+pharmacological+toolkits%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits.</a> Toxins. 8 (2), 43(2016).</li>
<li>Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. <a target="_blank" href="https://www.hindawi.com/journals/psyche/2012/470436/">An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera.</a> Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).</li>
<li>Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/320234828_Quantification_protein_content_and_paralytic_potential_of_saliva_of_fed_and_prey_deprived_reduviid_Acanthaspis_pedestris_Stal_Heteroptera_Reduviidae_Reduviinae">Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae).</a> Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).</li>
<li>Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://jeb.biologists.org/content/38/1/61">The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae).</a> Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).</li>
<li>Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZerachia%2C+T+%22Animal+and+Plant+Toxins%22">Animal and Plant Toxins</a>. Kaiser, E. , Goldman. 143-146 (1973).</li>
<li>Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fish-killing+water+bug+reveals+ancient+and+dynamic+venom+evolution+in+Heteroptera%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li>
<li>Walker, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+fish-killing+water+bug+reveals+ancient+and+dynamic+venom+evolution+in+Heteroptera%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera.</a> Cell. Mol. Life Sci. , (2018).</li>
<li>Walker, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assassin+bug+Pristhesancus+plagipennis+produces+two+distinct+venoms+in+separate+gland+lumens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens.</a> Nature Communications. 9 (1), 755(2018).</li>
<li>Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+triabin+protein+family+of+American+hematophagous+reduviids%3A+Functional%2C+structural+and+phylogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis.</a> Toxins. 8 (2), 44(2016).</li>
<li>Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+the+saliva+of+Triatoma+infestans+%28Heteroptera%3A+Reduviidae%29+on+sodium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels.</a> Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).</li>
<li>Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+peptides+from+assassin+bugs+%28Hemiptera%3A+Reduviidae%29%3A+isolation%2C+chemical+and+biological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization.</a> FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).</li>
<li>Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+milking+and+electric+shocks+for+venom+collection+from+hunter+reduviids%5BTitle%5D)+AND+%22Entomon%22%5BJournal%5D)">Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids.</a> Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).</li>
<li>Silva-Cardoso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+activity+of+lysophosphatidylcholine+from+saliva+of+the+waterbug+Belostoma+anurum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum.</a> Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).</li>
<li>Noeske-Jungblut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triabin%2C+a+highly+potent+exosite+inhibitor+of+Thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).</li>
<li>Noeske-Jungblut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitor+of+collagen-induced+platelet+aggregation+from+the+saliva+of+Triatoma+pallidipennis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).</li>
<li>Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. <a target="_blank" href="http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1678-91992006000300011">Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens.</a> Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).</li>
<li>Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201301326115">Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae).</a> Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).</li>
<li>Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaran%2C+SPM+%22Biotechnological+Applications+for+Integrated+Pest+Management%22">Biotechnological Applications for Integrated Pest Management</a>. , Oxford Publishing. 125-131 (2000).</li>
<li>Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMaran%2C+SPM+%22Insect+Pest+Management%2C+A+Current+Scenario%22">Insect Pest Management, A Current Scenario</a>. Ambrose, D. P. , Entomology Research Unit. 346-361 (2011).</li>
<li>Pereira, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoagulant+activity+of+Triatoma+infestans+and+Panstrongylus+megistus+saliva+%28Hemiptera%2FTriatominae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae).</a> Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+salivary+vasodilator+in+the+blood-sucking+bug%2C+Rhodnius+prolixus%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus.</a> British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+prolixin-S+%28nitrophorin+2%29%2C+the+salivary+anticoagulant+of+the+blood-sucking+bug+Rhodnius+prolixus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Journal%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus.</a> Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).</li>
<li>Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+salivary+gland+and+salivary+enzymes+of+the+giant+waterbugs+%28Heteroptera%3B+Belostomatidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae).</a> Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).</li>
<li>Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1469-7998.1995.tb02743.x/full">On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae).</a> Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).</li>
<li>Fink, L. S. <a target="_blank" href="https://bugguide.net/node/view/1371711">Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae).</a> Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).</li>
<li>Herzig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogenesis%2C+gender%2C+molting+influence+the+venom+yield+in+the+spider+Coremiocnemis+tropix+%28Araneae%2C+Theraphosidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Venomous+Research%22%5BJournal%5D)">Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae).</a> Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).</li>
<li>Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+electrophoretic+analyses+of+saliva+from+the+predatory+reduviid+species+Rhynocoris+marginatus+%28Fab%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab).</a> Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der wichtigste Schritt bei der Ernte Assassin Bug Venom ist die Auswahl der geeigneten Methode je nach Zweck der Studie. Jede der drei Methoden zur Ernte Heteropteran Gifte hat vor- und Nachteile je nach downstream-Anwendungen.
Induktion Fehler Venom aus der Rüssel (Protokolle 1-3) vertreiben vermeidet Kontamination des Giftes von Drüsengewebe. Darüber hinaus diese Methoden sind nicht tödlich und können viele Male wiederholt werden, im Laufe des Lebens einen Fehler. Elektrostimulation in der R...

Heteropteran Gifte sind potent bioaktiven Substanzen1. Beispielsweise die Venom/Speichel Absonderungen von Blut-Fütterung Heteroptera wie Kissing Bugs (Triatominae) und Wanzen (Cimicidae) erleichtert die Fütterung durch Störung der Hämostase2. Giftstoffe in diese Gifte Zielen auf mehrere Wege einschließlich Koagulation, Thrombozytenaggregation sowie Vasokonstriktion und den Schmerz und Jucken Wege. Gifte von den meisten anderen Heteropteran-Arten werden angepasst, um Raub, anstatt Blut-Fütterung zu erleichtern. Ihre Gifte verursachen Lähmung, Tod und Gewebe Verflüssigung bei in Wirbellose Tiere3,4injiziert. Wenn in Wirbeltieren injiziert, kann ihres Giftes auch drastische Auswirkungen haben. Beispielsweise führt die Injektion des Giftes von Assassin Bug Holotrichius Innesi in Wirbeltieren Muskellähmung, Schmerzen und Blutungen; Mäuse-Envenomated von diesem Fehler sterben schnell durch Atemlähmung5.
Transkriptomischen und Proteomic Untersuchungen ergaben die Proteinzusammensetzung von einigen Heteropteran Gifte. Gifte predaceous Arten sind reich an Proteasen, andere Enzyme, und Peptide und Proteine der unbekannte Struktur und Funktion6,7,8. Kissing Bug Venom ist reich an Triabin-Protein-Familie, deren Mitglieder tiefgreifend Koagulation und Thrombozytenaggregation, Vasokonstriktion2,9 beeinflussen. Allerdings ist es nicht bekannt, welche Giftstoffe die meisten Bioactivities des Giftes zugrunde liegen. Z. B. Venom Kissing Bug Triatoma Infestans gemeldet werden Schmerzmittel und hemmen Natrium-Kanäle10, aber die Komponenten verantwortlich müssen noch geklärt werden. Ebenso ist es nicht bekannt, welche Komponente(n) Assassin Bug Gift Lähmungen oder Schmerzen verursachen. Voraussetzung für die Identifizierung verantwortlich für bestimmte Venom Bioactivities und zur Charakterisierung von Struktur und Funktion von neuartigen Venom Giften, Toxinen ist Venom erhalten.
Venom wurde von Wanzen durch Elektrostimulation5,6,7,8,11,12,13, Provokation der Defensive eingeholt Antworten4,8, mechanisch quetschen Thorax12,14,15,16, sezieren, Venom Drüsen8,17 ,18,19,20,21,22und Anwendung des Agonisten muskarin Acetylcholin-Rezeptor-23. Die möglichen vor- und Nachteile einer Methode zu urteilen wird erschwert durch die Morphologie der Heteropteran Giftdrüsen, die wichtigste Drüse mit zwei separaten Lumen, die vorderen wichtigste Drüse (AMG) und posterior wichtigste Drüse (PMG), bestehen als auch eine damit verbundenen Zubehör Drüse (AG). Diese verschiedenen Drüse Fächer produzieren unterschiedliche Protein Sekrete, die für verschiedene biologische Funktionen einschließlich Beutefang, Verteidigung und extraoralen Verdauung8,17spezialisiert werden können. In Peiratine und Ectrichodiine Assassin Bugs wurde der AMG Beutefang und die PMG mit extraoralen Verdauung17zugeordnet. Jedoch ist in der Harpactorine Fehler Pristhesancus Plagipennis die PMG für Beutefang und Verdauung spezialisiert, während die AMG wird theoretisiert, um defensive Venom8absondern. Die AG wurde als kleine sekretorischen Funktion in Assassin Bugs8 oder als ein wichtiger Standort der Protease Lagerung in riesigen Wasserwanzen23beschrieben. Weitere Arbeit ist natürlich erforderlich, die Funktion jedes Fach Drüse unter verschiedenen Heteropteran Untergruppen zu klären und die Funktion der meisten Venom Toxine zu bestimmen. In diesem Bericht beschreiben wir Protokolle für die Ernte Venom Giftstoffe aus Wanzen auf dieses Ziel hin.

<table><tbody><tr><td>Elektrostimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>S48 Square Pulse Stimulator</td><td>Elektrostimulator für gepulste Elektrostimulation</td></tr><tr><td>Federleichte Pinzette</td><td>Australischer Entomologe Zubehör</td><td>E122B</td><td>Für den Umgang mit lebenden giftigen Insekten</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail</td><td>Sigma</td><td>4693124001</td><td>Zur Verhinderung der autoproteolytischen Verdauung von Gift</td></tr><tr><td>Dissektion Ausrüstung</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E152Micro</td><td>Für feine Dissektionen</td></tr><tr><td>Insektenstifte</td><td>Australian Entomological Supplies</td><td>E162</td><td>Für feine Dissektionen</td></tr></tbody></table>

ernte venom giftstoffe aus assassin bugs und andere heteropteran insekten

Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects

Heteropteran Insekten wie Assassin Bugs (Reduviidae) und riesigen Wasserwanzen (Belostomatidae) stammte aus einem gemeinsamen Vorfahren predaceous und giftige, und die Mehrzahl der erhaltenen Wanzen behalten diese trophische Strategie. Einige Wanzen ernähren vertebrate Blut umgestellt haben (z. B. Kissing Fehler, Triatominae; und Bettwanzen, Cimicidae) während andere zurückgesetzt haben, ernähren sich von Pflanzen (die meisten Pentatomomorpha). Allerdings ist mit Ausnahme von Kissing Bugs verwendet, um zu erleichtern, Blut-Fütterung, wenig Speichel über Heteropteran Gifte im Vergleich gegen die Gifte der Schlangen, Spinnen und Skorpione bekannt.
Ein Hindernis für die Charakterisierung von Heteropteran Venom Giftstoffe ist die Struktur und Funktion der Venom/Lippen Drüsen, die sowohl morphologisch komplex sind und mehrere biologische Aufgaben (Verteidigung, Beutefang und extraoralen Verdauung). Dieser Artikel beschreibt drei Methoden, mit denen wir erfolgreich Heteropteran Gifte zu sammeln. Erstens stellen wir Elektrostimulation sowie eine komfortable Möglichkeit, Venom zu sammeln, die oft tödlich, wenn injiziert ist Beute Tiere entfällt die Kontamination von Drüsengewebe. Zweitens zeigen wir, dass sanfte Belästigung der Tiere ausreichen, um Venom Extrusion aus dem Rüssel und/oder Venom spucken in einigen Gruppen von Wanzen zu produzieren. Drittens, beschreiben wir Methoden zur Ernte Venom Giftstoffe durch Dissektion narkotisierter Tiere, die Giftdrüsen zu erhalten. Diese Methode ist komplementär zu anderen Methoden, wie es gestatten, Ernte von Toxinen aus Taxa in denen Elektrostimulation und Belästigung unwirksam sind. Diese Protokolle können Forscher Giftstoffe aus Heteropteran Insekten zur Charakterisierung von Struktur und Funktion und mögliche Anwendungen in Medizin und Landwirtschaft zu ernten.

Einige Heteropteran Arten, wie die Harpactorine p. Plagipennis und die Reduviine Platymeris Rhadamanthus, liefern zuverlässig große Mengen (5-20 µL) des Giftes in Reaktion auf Elektrostimulation (Tabelle 1). Im allgemeinen führen die meisten Peiratine, Reduviine und Harpactorine Bugs Venom als Reaktion auf diese Methode. Unter den Stenopodaine Fehler entlockte Elektrostimulation Venom aus Oncocephalus SP., aber nicht Thodelmus sp. Die H...

Obwohl viele Insekten in der Unterordnung Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sind giftig, deren Venom-Zusammensetzung und die Funktionen ihrer Venom-Toxine sind meist unbekannt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zum Heteropteran Gifte für weitere Charakterisierung, mittels Elektrostimulation, Belästigung und Drüse Dissektion zu ernten.

Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten

Heteropteran insects such as assassin bugs (Reduviidae) and giant water bugs (Belostomatidae) descended from a common predaceous and venomous ancestor, ...

Raubwanzen sind eine Gruppe von Insekten, die Gift verwenden, um ihre Beute zu lähmen und vorzuverdauen. Doch obwohl Tiergifte als neuartige Medikamente, Insektizide und wissenschaftliche Werkzeuge von Interesse sind, sind die Toxine, die sie produzieren, fast völlig uncharakterisiert. Ein Grund dafür ist, dass Mörderwanzen im Vergleich zu ikonischen giftigen Gliederfüßern wie Spinnen und Skorpionen weniger bekannt sind.Ein weiterer Grund ist, dass bis vor kurzem nur wenige Informationen darüber verfügbar waren, wie ihre Giftstoffe gewonnen werden können. In diesem Video stellen wir Methoden vor, die es Forschern ermöglichen, Giftgifte von Raubwanzen und auch von verwandten Insekten wie riesigen fischtötenden Wasserwanzen erfolgreich zu gewinnen. Protokoll eins beschreibt, wie man Gift durch Elektrostimulation erntet.Sammeln Sie zunächst geeignete Insekten. Erwachsene und große Nymphen sind am einfachsten zu handhaben. Der Einsatz von Käfern zwei bis sieben Tage nach der Fütterung ist ideal, um sicherzustellen, dass die Insekten Giftvorräte angesammelt haben, aber nicht verhungern.Bereiten Sie eine Pinzette mit Elektroden an den Spitzen vor und schließen Sie sie an eine Stromversorgung an. Im Idealfall sollte es sich dabei um einen Elektrostimulator handeln, der in der Lage ist, Fünf-Millisekunden-Impulse bei fünf Hertz abzugeben. Verwenden Sie Spitzenspannungen zwischen 15 und 25 Volt für kleine bzw. große Insekten.Wenn kein Elektrostimulator verfügbar ist, verwenden Sie konstante Spannungen von fünf bis 12 Volt. Halten Sie das Insekt mit Gummibändern und einer Schaumstoffplattform fest. Lege den Rüssel des Insekts in ein Auffangrohr.Ein P200-Pipettenröhrchen ist ideal für die meisten Raubwanzen. Optional kann vor der Ernte eine kleine Menge Wasser in die Spitze gegeben werden, um eine maximale Rückgewinnung des Giftes zu gewährleisten. Tragen Sie leitfähiges Gel auf die Elektroden auf, schalten Sie die Stromversorgung ein und setzen Sie die elektrifizierte Pinzette auf das Insekt auf.Experimentieren Sie mit einer Reihe von Kontaktpunkten, während Sie die Ausstoßung des Giftes aus dem Rüssel überwachen. Lagern Sie das Gift bei eisigen Temperaturen, um eine autoproteolytische Verdauung zu vermeiden. Wiederholen Sie die Elektrostimulation mit einem neuen Pipettenröhrchen, bis kein Gift mehr vorhanden ist.Protokoll zwei beschreibt, wie man Gift erntet, indem man eine Abwehrreaktion provoziert. Bereiten Sie einen Käfer wie oben beschrieben vor und halten Sie ihn zurück, indem Sie den Rüssel in eine Auffangspitze einführen. Belästigen Sie den Käfer sanft, um eine Abwehrreaktion zu provozieren, ohne das Tier zu verletzen.Manchmal kann das einfache Zurückhalten des Tieres oder das Einführen des Rüssels in das Sammelröhrchen eine Abwehrreaktion hervorrufen, die von der Ausstoßung des Giftes aus dem Rüssel begleitet wird. Wenn nicht, berühren Sie das Tier vorsichtig am Brustkorb, an den Beinen, am Bauch und vor allem an den Antennen, um Gift hervorzurufen. Im dritten Protokoll, in der schriftlichen Form dieses Artikels, beschreiben wir auch, wie man Gift von Arten erntet, die defensiv Gift spucken.Protokoll vier beschreibt, wie das Gift durch Dissektion direkt aus den Giftdrüsen gewonnen werden kann. Betäuben Sie die Tiere, indem Sie sie 10 Minuten lang Kohlendioxid aussetzen. Führen Sie drei Stifte in den hinteren Bauch ein, um das Insekt festzuhalten, ohne die Giftdrüsen zu durchstechen.Schneiden Sie mit einem Miniaturskalpell einen kurzen Schnitt in der Mittellinie in die Bauchfläche. Verwenden Sie eine Miniaturschere, um die Mittellinie in anteriorer Richtung zum Kopf zu verlängern, und achten Sie darauf, nur das Exoskelett zu schneiden und die inneren Strukturen nicht zu beschädigen. Um die inneren Strukturen freizulegen, machen Sie mehrere seitliche Schnitte, die sich vom Mittellinienschnitt bis zur Seite des Insekts erstrecken.Das ventrale Exoskelett zwischen jeweils zwei Schnitten kann dann nach hinten gesteckt werden, um die inneren Strukturen freizulegen. Fluten Sie die Sezierschale mit einer Kochsalzlösung, bis der Käfer untergetaucht ist, damit die inneren Strukturen nach oben schwimmen und leichter sichtbar werden können. Die Giftdrüsen erscheinen als durchscheinende, längliche Strukturen, die sich auf jeder Seite des Verdauungskanals erstrecken.Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer Mikroschere vorsichtig Binde- und Nervengewebe sowie die Luftröhre und versuchen Sie, den Verdauungskanal oder die Giftdrüsen nicht zu zerreißen. Die Hauptdrüse ist an ihrer charakteristischen Struktur mit Front- und Hinterlappen und zwei Gängen, die sich am Hilus treffen, zu erkennen. Bei Raubwanzen und vielleicht auch anderen Heteropteren werden fast alle Giftstoffe in den Lumen der beiden Lappen der Hauptdrüse gespeichert.Daher können nach der Befreiung der Hauptdrüse von Luftröhre und Bindegewebe die beiden vom Hilus führenden Kanäle durchtrennt und die Hauptgiftdrüse entnommen werden. Ist auch die akzessorische Drüse gewünscht, so liegt sie meist dicht am Darm und kann durch Nachzeichnen der Gänge vom Hilus aus eindeutig identifiziert werden. Achten Sie in jedem Fall darauf, die Drüsen nicht vorzeitig zu brechen und das Gift an die umgebende Kochsalzlösung zu verlieren.Wenn die Lappen der Hauptdrüse abgetrennt werden sollen, tun Sie dies schnell nach der Entnahme aus der Kochsalzlösung und fahren Sie sofort mit der Entnahme des Inhalts der Drüsenlumen fort, wie in den Schritten 4.6 und 4.7 des schriftlichen Manuskripts beschrieben. Die Ergebnisse variieren je nach dem genauen Unterprotokoll und der verwendeten Insektenart. Das erste und zweite Unterprotokoll, das in diesem Video vorgestellt wird, zeigten, wie Giftgifte durch Elektrostimulation bzw. Belästigung gewonnen werden können.Beide Verfahren ergeben typischerweise eine konzentrierte Flüssigkeit, die etwa 50 bis 250 Milligramm pro Mil Protein und über 100 proteinbasierte Komponenten, einschließlich Enzyme, porenbildende Toxine und Peptide, enthält. Der Hauptvorteil dieser beiden Protokolle besteht darin, dass sie schnell und nicht tödlich sind und das Gift nicht durch Drüsengewebe kontaminiert wird. Der größte Nachteil bei der Entnahme durch Elektrostimulation oder Belästigung besteht darin, dass die Drüsenquelle des gewonnenen Giftes unbekannt ist und der Proteingehalt des entnommenen Giftes je nach Protokoll unterschiedlich sein kann.Außerdem sind Elektrostimulation und Belästigung nicht bei allen räuberischen Arten von Heteropteren wirksam. Im letzten Subprotokoll haben wir gezeigt, wie man die angeschwollenen Giftdrüsen sezieren kann, um Giftstoffe direkt zu ernten. Diese Technik ergibt auch einen Cocktail aus verschiedenen Proteinen, obwohl in diesem Fall die Giftgifte eine gewisse Kontamination mit Drüsengewebe aufweisen können.Ein Vorteil der Gewinnung von Toxinen aus präparierten Drüsen ist jedoch, dass das Ursprungskompartiment der Drüsen genau bekannt ist. Zusammenfassend ermutigen wir die Forscher, eine für ihre Forschungsfrage geeignete Erntemethode zu wählen. Zum Beispiel werden Untersuchungen über die Biologie des Gifteinsatzes innerhalb einer Art von Vorteil sein, wenn mehrere Erntetechniken eingesetzt werden.Für Bioprospektionsstudien kann eine einzige Methode zur Gewinnung von Giften mehrerer Arten wirtschaftlicher sein, abhängig vom spezifischen Versuchsdesign. Wir hoffen, dass dieses Video und der begleitende geschriebene Artikel es den Forschern erleichtern werden, Gift von Raubwanzen und anderen heteropteren Insekten zu gewinnen, was eine Voraussetzung für das Verständnis ihrer Zusammensetzung, Bioaktivität und Evolution ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Extraktion von Gift von Spinnen mit Elektrostimulation, um 1) durchzuführen Proteom Charakterisierung, 2) stimulieren Giftdrüse Genexpression, und 3) durchführen funktionelle Studien von Giften. Dies wird durch eine Beschreibung der Giftdrüse Mikrodissektionen für Genexpressionsstudien gefolgt.

Extraktion von Venom und Giftdrüse Mikrodissektionen von Spiders für Proteomik und transkriptomischen Analysen

Wir beschreiben eine Methode, um quantifizierbare Hämolymphe effizient aus kleinen Arthropoden für die anschließende Analyse zu gewinnen.

Eine präzise und quantifizierbare Methode zur Hämolymphentnahme von kleinen Gliederfüßern

Dieses Protokoll beschreibt den obligatorischen Fütterungstest, um die potenziell toxische Wirkung eines sekundären Pflanzenstoffs auf die Larven der Lepidoptera-Insekten zu bewerten. Dabei handelt es sich um einen hochgradig skalierbaren Insekten-Bioassay, mit dem sich die subletale und letale Dosis, die abschreckende Wirkung und die physiologische Wirkung leicht optimieren lassen. Dies könnte für das Screening umweltfreundlicher Insektizide verwendet werden.

Entwicklung eines Fütterungs-Assay-Systems zur Bewertung der insektiziden Wirkung von sekundären Pflanzenstoffen auf Helicoverpa armigera

Hier stellen wir erfolgreiche Erhaltungs- und Giftextraktionsprotokolle für die großflächige Haltung von Tityus serrulatus Lutz und Mello, 1922 (brasilianischer gelber Skorpion) vor, mit dem Ziel, Gift für die anschließende Skorpion-Gegengiftproduktion bereitzustellen, um den Bedarf des brasilianischen Gesundheitssystems zu decken.

Pflege in Gefangenschaft und Giftextraktion von Tityus serrulatus (Brasilianischer Gelber Skorpion) zur Herstellung von Gegengift

Hier stellen wir ein Protokoll zur Extraktion von Gift aus Trichogramma dendrolimi unter Verwendung eines künstlichen Wirts vor, der mit Polyethylenfilm und Aminosäurelösung hergestellt wurde.

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Wilde Tiere werden häufig von einer Vielzahl von Helminthen parasitiert. Die vier Haupttypen von Helminthen sind "Spulwürmer" (Nematoden), "Dornkopfwürmer" (Acanthocephalane), "Egel" (Trematoden) und "Bandwürmer" (Cestoden). Hier beschreiben wir, wie Helminthen von einem Wirbeltier gesammelt werden und wie sie konserviert und taxonomisch identifiziert werden.

Helminthensammlung und -bestimmung von Wildtieren

Die Integration der Mikroalgenkultivierung mit industriellem Rauchgas wird letztendlich Schwermetalle und andere anorganische Verbindungen in das Wachstumsmedium einbringen. In dieser Studie wird ein Verfahren vorgestellt, mit dem das Endschicksal und die Auswirkungen von Schwermetallen und anorganischen Kontaminanten auf das Wachstum von Nannochloropsis salina bestimmt werden können, die in Photobioreaktoren gezüchtet werden.

Quantifizierung von Schwermetallen und anderen anorganischen Kontaminanten auf die Produktivität von Mikroalgen

Verhaltensassays bieten leistungsstarke Werkzeuge zum Verständnis der neuronalen Funktion. Hier stellen wir mehrere Protokolle zur Quantifizierung des räuberischen Fressverhaltens vor, die beim Modellnematoden Pristionchus pacificus und seinen Verwandten gefunden wurden. Darüber hinaus stellen wir Methoden zur Analyse von räuberischen Fressanpassungen einschließlich Mundstrukturen und Zähnen zur Verfügung.

Die Untersuchung Räuberische Fütterung Behaviors in<em&gt; Pristionchus</em&gt; Und andere Nematoden

Mikroplastiken wirken als Vektor potenziell toxischer organischer Verunreinigungen mit unvorhersehbaren Wirkungen. Dieses Protokoll beschreibt eine alternative Methode zur Beurteilung der Konzentrationen von Organochlor-Pestiziden, die an Kunststoff-Pellets adsorbiert sind, und die Identifizierung der chemischen Polymerstruktur. Der Schwerpunkt liegt auf der Druckfluid-Extraktion und der abgeschwächten Totalreflexion Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie.

Extraktion von Organochlor-Pestiziden aus Kunststoff-Pellets und Kunststoff-Typ-Analyse

Es sind Verfahren zur gezielten Gewinnung von Tensiden in atmosphärischen Aerosolen und die Bestimmung ihrer absoluten Konzentrationen und Oberflächenspannungskurven in Wasser vorgelegt, einschließlich ihrer kritischen Micellenkonzentration (CMC).

Die Extraktion und Charakterisierung von Tensiden aus Atmosphärische Aerosole

Erfahren Sie, wie Sie Giftstoffe aus Raubwanzen und anderen Heteropteren durch Elektrostimulation, Provokation oder Drüsensektion gewinnen. Diese Methoden ermöglichen die Charakterisierung bisher wenig erforschter Insektengifte für biomedizinische Anwendungen.

Ernte Venom Giftstoffe aus Assassin Bugs und andere Heteropteran Insekten

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