Name: Alvéolaire Lavage Exosomen in Lipopolysaccharid-induzierte septischen Lungenschädigung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Alveolarlavage-Exosomen bei LPS-induzierter septischer Lungenschädigung in Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung entzündlicher Zellkommunikation und potenzieller Therapieansätze.

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Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt erklärt.

Das gesamte Protokoll erfordert 2 Tage, unter anderem am ersten Tag der Sepsis Induktion und Absonderung von BAL-Flüssigkeit aus der Tier- und am zweiten Tag exosomen Isolation von der Maus BALF. Alle Verfahren wurden überprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee an Atlanta VA medical Center genehmigt.
1. akute septische Lunge Verletzungen Mausmodell
<ol><li>Verwenden Sie 6 bis 8 Wochen - alte männliche Wildtyp C57BL/6J Mäuse (20-22 g Gewicht) für das Tier zu modellieren, und führen Sie alle Verfahren mit aseptischen Techniken und Instrumente. Autoklav alle chirurgischen Instrumente, einschließlich Pinzetten und Scheren für 20 min bei 121 ° C.</li>
	<li>Verteilen Sie Mäuse in experimentellen und Kontrollgruppe nach dem Zufallsprinzip. Mäuse auf eine chirurgische Board zurückhalten. Behandeln Sie Mäuse mit Escherichia coli Lipopolysaccharid (LPS, 15 mg/kg), intraperitoneale Weg. Verdünnen Sie nach dem individuellen Körpergewicht entsprechende LPS Dosierungen bis 0,1 mL PBS per Mausklick, dann injizieren Sie LPS-Lösung mit einer 1 mL Spritze mit 27 G Nadel und Spritzen Sie gleichwertigem Umfang von PBS zu Kontrolltieren.</li>
	<li>Halten Sie Mäuse in der tierischen BSL2-Anlage, bestehend aus sauberen Käfigen angemessene Raumtemperatur.</li>
	<li>24 Stunden später einschläfern Mäuse mit CO2 Einatmen.</li>
	<li>Wählen Sie den OP-Bereich in der Mitte der Maus Hals. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 5 mm) und trennen Sie vorsichtig Muskeln für den Zugriff auf die Luftröhre mit stumpfen Pinzette, bis die Luftröhre ausgesetzt ist.</li>
	<li>Maus-BAL-Flüssigkeit mit 10 mL sterile Spritze mit einer 27 G Nadel zurückziehen. Zuerst sanft, Stechen Sie die Nadel in die Luftröhre und Spritzen Sie 1 mL sterile PBS langsam in die Luftröhre, dann ziehen Sie BALF in eine Einweg-Spritze 3 mL mit einer 27 G Nadel. Nach Abschluss des Verfahrens Spritzen und Nadeln im Biohazard Sharps Container entsorgen.</li>
	<li>Chirurgische Instrumente mit Chlordioxid, zu behandeln, wie zuvor beschrieben von Chauret Et al. 27, und Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren für 20 min bei 121 ° C.</li>
</ol>(2) Exosomen Isolation-seriell Ultra-Zentrifugation und Charakterisierung
<ol><li>Maus-BAL-Flüssigkeit in 15 mL konische Röhrchen zu sammeln. Alveoläre Zellen ernten, Zentrifugieren Sie Proben für 10 min bei 1.000 g bei 4 ° C.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand auf neue 15 mL konische Röhrchen, dann Zentrifugieren Sie Proben für 30 min bei 4.000 x g bei 4 ° C, Zelle Ablagerungen zu entfernen.</li>
	<li>Sammeln des Überstands in Ultrazentrifuge Tuben und Zentrifuge Proben 60 min bei 10.000 x g bei 4 ° C, größere zelluläre Partikel zu entfernen.</li>
	<li>Den überstand auf neue konische Rohre übertragen, dann die Proben durch 0,2 µm Spritze-Filter zu entfernen, bleiben größere Partikel zu filtern.</li>
	<li>Proben in Ultrazentrifuge Rohre und Rohre zu balancieren. Zentrifugieren Sie Proben für 2 h bei 140.000 x g bei 4° C zu die exosomen Pellets. Hinweis: Die Größe der exosomen variiert 20-200 nm. 0,2 µm-Filter dient zur Entfernung von größerer Partikeln, die mehr als 200 nm Größe.</li>
	<li>Entsorgen Sie die Überstände sanft. Das Pellet mit 100 µL PBS oder Lyse-Lösung und Transfer exosomen Proben zu 1,5 mL Röhrchen lösen und bei-80 ° C bis zur Verwendung aufbewahren. Hinweis: Transmissions-Elektronenmikroskop wird empfohlen, um isolierte exosomen zu überprüfen.</li>
	<li>Folgen Sie der Standardprobe TEM Verarbeitung Protokoll28. Analysieren von exosomen Proben mit Transmissions-Elektronenmikroskopie und nehmen Sie Bilder, Skala bar 200 nm.</li>
</ol>3. Vorbereitung der MiRNA und darstellende MiRNA-Q-RT-PCR
Hinweis: MiRNA-Q-RT-PCR wird empfohlen, Ausdruck von MiRNAs analysieren.
<ol><li>Folgen Sie standard-MiRNAs Isolierung Protokoll und achten Sie darauf, eine gleiche Menge von gereinigtem RNAs in Einzel-Strang reversen Transkription24.</li>
	<li>Folgen Sie das Echtzeit-PCR Standardprotokoll zur Erkennung von Exosomal RNA Ebene in BAL-Flüssigkeit. Verwenden Sie spezifische Echtzeit-PCR-Primer vor MiR-155, MiR-146a und U6 SnRNA. Laufen Sie PCR-Reaktion mit dem quantitativen PCR-Gerät und Normalisieren Sie die Ausdruckswerte zur internen Kontrolle U6 SnRNA. Hinweis: Jede Gruppe besteht aus dreifacher Proben24.</li>
</ol>4. Exosomen Etikettier- und Reinigung
<ol><li>Aussetzen Sie exosomen Pellet mit 100 µL Aussetzung Lösung in einem 1,5 mL Polypropylen Röhrchen, dann fügen Sie 0.4 µL der exosomen Farbstoff in das andere Rohr mit 100 µL der Aussetzung-Lösung.</li>
	<li>Schnell die Farbstofflösung exosomen in der Lösung hinzu und mischen Sie es gründlich durch pipettieren. Beispiele für 5 min bei Zimmertemperatur aufbewahren, vor Licht schützen.</li>
	<li>Setzen Sie eine exosom Spin Spalte in einem 1,5 mL Elution Rohr. Übertragen Sie die Lösung-Mischung in die Mitte der Spalte exosom Spin.</li>
	<li>Drehen Sie die Spalte für 2 min bei 800 X g bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Verwerfen Sie die Spalte und speichern Sie die eluierten Probe bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu.</li>
</ol>5. Validierung von Exosomen Up Empfängerzellen getroffenen
<ol><li>Samen Sie 1 x 104 MLE 12 /cell in einem 8-Well-Kammer-Folie und Zellkulturen bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL Leuchtstoff-Label exosomen zu den Zellen. 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Entfernen Sie, Kultur, Medien und waschen Sie Zellen mit PBS, dann befestigen Sie Zellen mit 1 % Paraformaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Montieren Sie die Folie in Mount Medium mit DAPI.</li>
	<li>Analysieren Sie Proben durch ein Fluoreszenzmikroskop und nehmen Sie Bilder, 40 X Vergrößerung.</li>
</ol>6. Überprüfung der Interaktion zwischen Exosomen und Empfängerzellen
<ol><li>Samen 2 x 105 MLE12/Brunnen in einer Kultur 12-Well-Platte mit geeigneten Nährmedium und Zellkulturen bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>MLE12 Zellen 20 µg exosomen aus Maus BAL Flüssigkeit hinzufügen und Einrichten von Wiederholungen pro Versuchsgruppe.</li>
	<li>24 h später Zellen mit PBS waschen und Hinzufügen von 600 µL Lyse Puffer in Brunnen. Schütteln Sie die Platte und Lyse Proben in 1,5 mL-Tube mit der Pipette.</li>
	<li>Folgen Sie den gesamten RNA Isolierung Standardprotokoll und cDNA reversen Transkription Protokoll, vervollständigen Sie die Einzel-Strang cDNA reversen Transkription29.</li>
	<li>Folgen Sie Real-Time PCR Standardprotokoll zur Erkennung von mRNA Ausdruck Ebene in empfängerzellen29. Verwenden Sie spezifische Echtzeit-PCR-Primer gegen TNF-α, IL-6 und ZO-1. Laufen Sie PCR-Reaktionen mit dem quantitativen PCR-Gerät und Normalisieren Sie die Ausdruckswerte der internen Kontrolle GAPDH. Hinweis: Jede Gruppe besteht aus dreifacher Proben.</li>
</ol>

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</ol>

Diese Arbeit wurde von VA Verdienst Beitrag 2I01BX001786-06A1 Finanzierung RS unterstützt.

Mausmodelle von Krankheiten werden üblicherweise verwendet, um die physiologische Funktion bestimmter Gene bewerten und zur Reduzierung der Kosten des Experimentierens2. Die akute septische Lungenversagen beschrieben hier imitiert Entzündungsreaktion bei Menschen mit ARDS gesehen. Dieses Modell ist relevant, die molekulare Pathogenese, Entwicklung von Biomarkern zu untersuchen und mögliche neue Therapien5zu testen.
Kokultur Systeme sind relevant ...

ALI und ARDS sind die lebensbedrohliche Formen der respiratorische Insuffizienz mit schweren Hypoxämie, verursacht durch nicht-kardiogenen Lungenödem betrifft etwa 1 Million Menschen weltweit pro Jahr1. Die Ätiologie des ARDS umfasst direkte Verletzung zu den Lungen von Infektionen oder Aspiration und eine Vielzahl von indirekten Beleidigungen. Im letzten Jahrzehnt gab es ein besseres Verständnis der molekularen Pathogenese des ARDS, gezielten Spezialbehandlungen für ARDS sind jedoch noch zu2,3entwickelt.
Verschiedenen Tiermodellen der akuten Lungenversagen sind entwickelt worden, die eine Brücke bieten, für die Übersetzung von experimentellen Therapien auf Studien am Menschen4,5. Häufigsten verwendeten Modelle verfügen über lokale Installation von Ölsäure, Bakterien, LPS und Bleomycin. Andere Ansätze sind Ischämie-Reperfusion, cecal Ligatur Punktion, mechanische Lüftung-induzierte Stretch Verletzungen, hyperoxie oder systemischen Verabreichung von Bakterien und LPS5. Diese Modelle bieten ein nützliches biologische System um klinische Hypothesen zu testen und für die Entwicklung von möglichen Therapien. Um menschliche ARDS zu simulieren, sollten Tiermodellen Entzündungen und akute Verletzung der epithelialen und endothelial Zellen mit defekten in Barriere-Funktion in der Lunge reproduzieren.
Exosomen sind membranvesikel mit 20-200 nm im Durchmesser, deren molekulare Inhalt Lipide, Proteine, DNA und RNA enthält, und Inter Mobilfunk in Gewebe Mikroumgebung über Molekulare Zusammensetzung Transfer erleichtern. Exosomen sind mehrere Arten von Zellen, wie endothelial Zellen, Epithelzellen, glatten Muskelzellen und Tumor-Zellen sezerniert und im menschlichen Körper Flüssigkeit vorhanden. Studien zeigen, dass exosomen Übersprechen zwischen Immunzellen und Stromazellen Zellen bei Infektions- und sterilen entzündlichen Erkrankungen regulieren und ihre abnorme Release erscheint durch die verschiedenen natürlichen und experimentellen Stimuli während physiologische geregelt werden und pathologische Prozesse6. Solchen Kommunikationsnetz kann eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Lungenerkrankungen und pathophysiologischen Fortschreiten7,8beeinträchtigen. So 18-22 Nukleotid nicht-kodierende RNAs, MiRNAs vorhanden im Gewebe und Körperflüssigkeiten, Plasma, Serum und modulieren mRNA Expression am Post-translationalen Ebene9,10.
Verpackte MiRNAs in exosomen zu beeinflussen, Differenzierung und Funktion von mehreren Arten von Zellen und übermässigem sind verbunden mit einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs, Lungenkrankheiten, Fettleibigkeit, Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen11, 12,13,14,15,16. Einstieg in den empfängerzellen und pendelt von Exosomal MiRNAs erleichtern interzelluläre Kommunikation ändern die Blutstillung Mikroumgebung17,18. Akutes Lungenversagen ist eine komplexe Prozesse, bei denen mehrere Zelltypen mit umfangreichen interzelluläre Kommunikation durch exosomen8. MiR-155 und MiR-146a Teilen der gemeinsamen transkriptionelle Regulierungsmechanismus und dazu beitragen, die entzündliche Reaktion und die Immuntoleranz19,20. Aktuelle Studien zeigen, dass sowohl entzündliche Reaktion über Exosomal MiRNAs pendeln zwischen Immunzellen21modulieren. Jedoch die molekularen Mechanismen, die modulierende Effekte der Exosomal MiRNAs alveoläre Reaktion auf Endotoxin bleiben unklar, zweifellos die potenzielle klinische Relevanz und Translationale Implikation Verdienst weitere Untersuchungen.
Kokultur Modelle werden eingesetzt, um die Interaktion der spezifischen Zelltypen im komplexen Umfeld, wie Entzündungen und Krebs22,23zu definieren. Diese Plattformen bieten eine alternative Strategie zur Nebensprechen zwischen Zelltypen besonders für immun- und strukturelle Zellen zu befragen.
Intra-trachealen, Aerosol, intraperitoneal oder systemische Gabe von LPS sind weit verbreitet, experimentelle Lunge Verletzungen24,25,26zu induzieren und haben gezeigt, dass die Durchlässigkeit von epithelialen und endotheliale induzieren Mängel. Hier verwenden wir intraperitoneale LPS, um septische Modellcharakter für die akute Lungenschädigung bei Mäusen zu induzieren. Innerhalb 24 h nach intraperitonealer Gabe von LPS induziert werden Permeabilität Defekte in der Lunge bei der Einstellung von Entzündungszellen. Darüber hinaus zeigen wir, dass exosomen aus BAL MiRNA-155 und MiR-146a enthalten, und exosomen von BAL-Flüssigkeit Pro-inflammatorischen Zytokinen Ausdruck im Empfänger Epithelzellen induzieren, wie IL-6 und TNF-α. Diese Daten sind erstmals zeigen, dass Exosomal MiRNAs sind in diesem Modell der akuten septischen Lungenschädigung in BAL abgesondert.

<table><tbody><tr><td>Lipopolysaccharid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Escherichia coli 055:B5</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH7.2(1X)</td><td>Life technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolationskit</td><td>Thermo Fisher</td><td>449774</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>mmu-miR-155 (002571) Primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-146a (000468) Primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>U6snRNA Primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>4427975</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;( Mm00443258_m1 ) Grundierung</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 (Mm00446190_m1&nbsp; &nbsp; )Grundierung</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 (Mm00493699_m1&nbsp; )Grundierung</td><td>Thermo Fisher</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>minimal essentielles Medium (MEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11095-072</td><td></td></tr><tr><td>Trysin-EDTA-Lösung (0,05%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Exosomen wurden mit PKH67 bis PKH67 grün fluoreszierender Zelllinker Mini-Kit markiert&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Exosomen-Spin-Säulen (MW3000)</td><td>Thermo Fisher</td><td>4484449</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima L-100XP Ultrazentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>L-100XP</td><td></td></tr><tr><td>Ultraklare Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskope (TEM)</td><td>JEOL Ltd</td><td>120 kV TEM</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX41 Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

alvéolaire lavage exosomen in lipopolysaccharid-induzierte septischen lungenschädigung

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Akute Lungenschädigung (ALI) und akute Atemnotsyndrom (ARDS) repräsentieren eine heterogene Gruppe von Lungenkrankheiten, die nach wie vor eine hohe Morbidität und Mortalität haben. Die molekulare Pathogenese von ALI wird besser definiert; jedoch aufgrund der Komplexität der Krankheit müssen Molekulare Therapien erst noch entwickelt werden. Hier verwenden wir ein Lipopolysaccharid (LPS) induzierte Mausmodell der akuten septischen Lungenschädigung, um die Rolle der exosomen in der entzündlichen Reaktion zu beschreiben. Mit diesem Modell konnten wir zeigen, dass Mäuse, die intraperitoneale LPS ausgesetzt sind, exosomen in Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit aus der Lunge absondern, die verpackt sind, mit MiRNA und Zytokine die entzündliche Reaktion zu regulieren. Weiter mit kokultur Modellsystem, zeigen wir, dass exosomen veröffentlicht von Makrophagen engen Kreuzung Proteinexpression in bronchialen Epithelzellen stören. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass (1) Übersprechen zwischen angeborenen immun- und strukturelle Zellen durch die Exosomal pendelt beitragen, die entzündliche Reaktion und Störung der strukturelles Hindernis und (2) diese MiRNAs targeting kann eine neuartige Plattform zur Behandlung von ALI und ARDS.

Septische Lungenschädigung induzieren, wurden Mäuse mit intraperitonealer LPS (15 mg/kg) behandelt. Innerhalb von 24 h LPS Verwaltung wurde neutrophile Zustrom in der Lunge gesehen, wie in Figur 1Adargestellt. Maus-BAL-Flüssigkeit wurde gezogen, gefolgt von Isolierung und Reinigung der exosomen. Morphologie der BALF exosomen bestätigte Transmissions-Elektronen-Mikroskopie (Abbildung 1 b).
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Mäusen intraperitoneal LPs absondern exosomen in Broncho-alveoläre Lavage (BAL) Flüssigkeit, die mit MiRNAs verpackt sind. Ein Kokulturen-System verwenden, zeigen wir, dass exosomen veröffentlicht in der BAL-Flüssigkeit engen Kreuzung Proteinexpression in bronchialen Epithelzellen stören und Ausdruck von Pro-inflammatorischen Zytokinen, die Lungenschädigung betonen zu erhöhen.

Alvéolaire Lavage Exosomen in Lipopolysaccharid-induzierte septischen Lungenschädigung

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Rolle von Exosomen bei den Entzündungsreaktionen in einem LPS-induzierten, akuten septischen Lungenverletzungsmodell zu beschreiben. Diese Methode kann also dazu beitragen, wichtige Fragen im Zusammenhang mit der Zellwechselsprache bei akuter Lungenschädigung und akutem Atemnotsyndrom zu beantworten. Insbesondere die interzelluläre Kommunikation innerhalb der Alveolen-Mikro-Umgebung durch Exosomen-Shuttling.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung und Charakterisierung von hochgereinigten bronchoalveolären Lavage-Exosomen ermöglicht, die von Endotoxin-behandelten septischen Mäusen mit akuter Lungenschädigung stammen. Das Verfahren wird von Dr. Zhihong Yuan und Dr. Chetna Bedi demonstriert. Laden Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit 0,1 Millilitern LPS und PBS pro Maus und fixieren Sie die erste sechs bis acht Wochen alte männliche C57 Black 6J-Maus manuell.Verabreichen Sie das LPS intraperitoneal und bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück. Machen Sie 24 Stunden später einen fünf Millimeter langen Schnitt in der Mitte des Halses des ersten Tieres und verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um die Muskeln sanft zu trennen und die Luftröhre freizulegen. Führen Sie anschließend vorsichtig eine 27-Gauge-Nadel, die an einer sterilen 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, in die Luftröhre ein und injizieren Sie einen Milliliter steriles PBS.Ersetzen Sie dann sofort die 10-Milliliter-Spritze durch eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer neuen 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist. Aspirieren Sie das bronchoalveoläre Lavage-Fluid oder BOLF und geben Sie das BOLF in ein entsprechend gekennzeichnetes konisches 15-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Um die Exosomen zu isolieren, zentrifugieren Sie die BORF-Proben und überführen Sie die Überstände in neue 15-Milliliter-Röhrchen.Zentrifugieren Sie die Proben erneut und überführen Sie die Überstände in Ultrazentrifugenröhrchen, um die größeren, zellulären Partikel zu entfernen. Übertragen Sie die Überstände in neue konische Röhrchen und laden Sie die Proben in 0,2-Mikron-Spritzenvorsatzfilter, um verbleibende größere Partikel zu entfernen. Geben Sie die gefilterten Proben in neue Ultrazentrifugenröhrchen, um die Exosomen zu pelletieren.Entsorgen Sie die Überstände vorsichtig und suspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern PBS pro Röhrchen. Anschließend werden die Exosomenproben für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius in einzelne 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Um die Exosomen zu reinigen, geben Sie 0,4 Mikroliter des entsprechenden Exosomenfarbstoffs in ein Röhrchen mit 100 Mikrolitern Suspensionslösung pro Probe und geben Sie schnell eine aufgetaute Exosomenprobe in jedes Farbröhrchen.Mischen Sie die Exosomen gründlich mit dem Farbstoff und inkubieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation wird eine Exosom-Spin-Säule pro Probe in ein 1,5-Milliliter-Illusionsröhrchen gegeben und die Exosomenlösungen in die Mitte jeder Spin-Säule übertragen. Zentrifugieren Sie dann die Proben, verwerfen Sie die Säulen und lagern Sie die angedeuteten Proben bei minus 20 Grad Celsius.Um die Exosomenaufnahme durch Empfängerzellen zu messen, säen Sie zuerst eine mal 10 bis die vierte Lungenepithelzellen der Maus 12 Zellen in 0,5 Millilitern Medium in jede Vertiefung eines Objektträgers mit acht Vertiefungen für eine 16-stündige Kultur bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Geben Sie nach dem Auftauen 10 Mikroliter der gereinigten, fluoreszenzmarkierten Exosomen in jede Vertiefung und stellen Sie die Zellkulturen für eine Stunde in den Inkubator zurück. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie jede Co-Kultur 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 % Paraformaldehyd.Entfernen Sie das Medium und montieren Sie dann den Objektträger mit einem mit DAPI ergänzten Medium und bilden Sie die Proben durch Fluoreszenzmikroskopie mit einer 40-fachen Vergrößerung ab. Um die Interaktion des Exosoms mit den Empfängerzellen zu überprüfen, säen Sie zweimal 10 bis 12 Zellen des Lungenepithels der fünften Maus in zwei Millilitern Medium pro Vertiefung in eine 12-Well-Kulturplatte, die das geeignete Kulturmedium für eine zweistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid enthält. Am Ende der Inkubation geben Sie 20 Mikrogramm Exosomen in drei Vertiefungen mit Epithelzellen pro Versuchsgruppe und stellen die Zellen wieder in den Inkubator.Entfernen Sie nach 24 Stunden das Medium, waschen Sie die Zellen mit PBS und geben Sie 600 Mikroliter Lysepuffer unter leichtem Schütteln in jede Vertiefung. Übertragen Sie dann den gesamten Inhalt jeder Vertiefung in einzelne 1,5-Milliliter-Röhrchen und analysieren Sie die Proben gemäß den Standard-Echtzeit-PCR-Protokollen. Innerhalb von 24 Stunden nach der Verabreichung von LPS wird ein neutrophiler Einstrom in der Lunge von mit LPS behandelten Tieren beobachtet.Nach ihrer Isolierung und Reinigung, wie gerade gezeigt, kann das Vorhandensein von Exosomen in der BOLF von Tieren mit septischer Lungenschädigung durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt werden. Die Expression ausgewählter proinflammatorischer microRNA ist in bronchoalveolären Flüssigkeits-Exosomen von LPS-behandelten Tieren im Vergleich zu kontrollierten PBS-behandelten Mäusen signifikant erhöht. LPS-behandelte Exosomen werden von Bronchiolepithelzellen der Maus aufgenommen, wie die Co-Lokalisation von Fluoreszenzfarbstoff-markierten Exosomen mit DAPI-markierten Zellen nach einer Stunde Co-Kultur zeigt.Die Expression proinflammatorischer Mediatoren ist in Epithelzellen, die mit Exosomen von LPS-behandelten Tieren kokultiviert wurden, signifikant erhöht im Vergleich zu Co-Kulturen mit Exosomen von PBS-behandelten Kontrollmäusen. Darüber hinaus zeigen Zellen, die mit Exosomen von LPS-behandelten Mäusen behandelt wurden, eine signifikant abgeschwächte Expression von Zonula occludens im Vergleich zu Kontrollen, was auf eine weniger intakte Zellintegrität nach LPS-behandelter Exosomen-Co-Kultur hinweist. Die intraperitoneale Injektion von LPS, die Extraktion der bronchoalveolären Lavage und die Exosomendelegation aus der bronchoalveolären Lavage: Alle Schritte können in relativ kurzer Zeit abgeschlossen werden.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Co-Kultur von Exosomen und Epithelzellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Wechselwirkung zwischen angeborenen und strukturellen Zellen in der alveolären Mikroumgebung der Lunge zu beantworten. Die Wechselwirkung zwischen angeborenen Immun- und Strukturzellen über das Exosomen-Shuttling trägt zur Entzündungsreaktion und zur Störung der strukturellen Barriere bei, was darauf hindeutet, dass exosomales microRNA-Targeting eine normale Plattform für die Behandlung von akuten Lungenschäden und akutem Atemnotsyndrom bieten könnte. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine septische Lungenschädigung bei Mäusen induziert, bronchoalveoläre Lavage-Flüssigkeit von Mäusen isoliert, Exosomen aus der Spülflüssigkeit isoliert und ein Co-Kultur-Modell zur Abfrage von intrazellulärer Übersprechung verwendet.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit LPS gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung getroffen werden sollten.

bronchoalveolar-lavage-exosomes-lipopolysaccharide-induced-septic

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Source: Yuan, Z., et al. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates an in vivo mouse model for inducing and analyzing acute lung injury (ALI) using intraperitoneal administration of bacterial lipopolysaccharide. The inflammatory cascade triggered by alveolar macrophages and neutrophils leads to epithelial and endothelial barrier disruption, allowing fluid and immune cells to accumulate in the alveoli. Alveolar...

Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury in Mice for Exosome and Immune Analysis

Die Immunantwort des Wirts auf Pathogen-Infektion ist eine streng reguliert Prozess. Mit Hilfe eines Lipopolysaccharid Lungenexpositionsmodell in Mäusen, ist es möglich, hochauflösende Auswertungen der komplexen Mechanismen der Krankheitsentstehung verbunden durch.

Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

Wir beschreiben ein Verfahren zur Induktion von neutrophilen Lungenentzündung durch Herausforderung aerosolized Lipopolysaccharid durch Vernebelung, akuter Lungenschädigung-Modell. Darüber hinaus werden grundlegende chirurgische Techniken für Lungen Isolation, Intubation und Bronchiallavage ebenfalls beschrieben.

Verfahren zur Erzeugung von Lungen Neutrophilie Mit aerosolisiertes Lipopolysaccharide

Wiederholte Lungenspülungen bei narkotisierten Schweinen Lungenverletzung ähnlich wichtigen Aspekte der menschlichen akutem Atemnotsyndrom (ARDS) induzieren. Zu diesem Zweck werden die Lungen wiederholt mit 0,9% Kochsalzlösung bei 37 ° C gespült. Das Ziel des Protokolls ist eine reproduzierbare Milderung der Gasaustausch und Hämodynamik für die Forschung in ARDS.

Lavage-induzierte Surfactant Depletion in Schweine als Modell des Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Der Gesundheitszustand der Lunge spiegelt sich in der Art und Anzahl der Immunzellen, die in den Bronchiolen der Lunge vorhanden sind. Wir beschreiben eine bronchoalveoläre Lavagetechnik, die die Isolierung und Untersuchung von nichtadhärenten Zellen und löslichen Faktoren aus dem unteren Atemtrakt der Mäuse ermöglicht.

Bronchoalveoläre Lavage von murinen Lungen zur Analyse der entzündlichen Zellinfiltration

Hier beschreiben wir zwei extrazellulären Vesikel Isolierung Protokolle, Ultrafiltration Zentrifugation und Ultrazentrifugation mit Dichte Steigung Zentrifugierung, extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Flüssigkeitsproben zu isolieren. Die extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid durch beide Methoden abgeleitet werden quantifiziert und charakterisiert.

Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid eine Ultrafiltration Zentrifugation Technik

Hier wird ein Schrittweiseverfahren vorgestellt, um akute Lungenverletzungen bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation zu induzieren und FACS-Analysen von Blutproben, Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit und Lungengewebe durchzuführen. Minimale Invasivität, einfache Handhabung, gute Reproduzierbarkeit und Titration der Schwere der Erkrankung sind Vorteile dieses Ansatzes.

Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation

Kombinierte Ozon- und bakterielle Endotoxin-exponierte Mäuse zeigen einen weit verbreiteten Zelltod, einschließlich des von Neutrophilen. Wir beobachteten zelluläre Anpassungen wie die Störung der zytoskelettalen Lamellipodie, eine erhöhte zelluläre Expression der komplexen V-ATP-Synthase-Untereinheit β und Angiostatin in der broncho-alveolären Lavage, die Unterdrückung der Lungenimmunantwort und eine verzögerte Neutrophilenrekrutierung.

Visualisierung von lungenzellulären Anpassungen während kombinierter Ozon- und LPS-induzierter akuter Lungenverletzungen bei Der Maus

In dieser Studie wurde eine nicht-invasive endotracheale Instillationstechnik demonstriert, die ALI bei Ratten unter Verwendung eines einfachen Laryngoskops entwickelt, um eine präzise LPS-Abgabe an die Lunge sicherzustellen. Das LPS wird über ein Endotrachealrohr mit einem Laryngoskop eingebaut. Das Ausmaß der Lungenverletzung wird zu mehreren Zeitpunkten bewertet.

Nicht-invasive endotracheale Verabreichung von Lipopolysaccharid zur Auslösung akuter Lungenschäden bei Nagetieren

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur siRNA effizient transfizieren in frisch isolierten menschlichen villöse Zytotrophoblasten Verwendung Mikroporation und Identifizieren von DNA-Protein-Komplexe in diesen Zellen. Transfizierte Zellen können durch Western-Blot überwacht werden und EMSA-Analysen während der 4-tägigen Kulturzeit.

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Erfahren Sie die Isolierung von Alveolarlavage-Exosomen bei LPS-induzierter septischer Lungenschädigung in Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung entzündlicher Zellkommunikation und potenzieller Therapieansätze.

Alvéolaire Lavage Exosomen in Lipopolysaccharid-induzierte septischen Lungenschädigung

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