Name: Subzellulären Fraktionierung von frischen und gefrorenen Magen-Darm-Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Lernen Sie die subzelluläre Fraktionierung von frischen und gefrorenen Magen-Darm-Proben zur Trennung zytoplasmatischer und nukleärer Proteine. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinlokalisationsstudien.

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Autoren erkennen die Hilfe von Ander Lopez und Miren Telletxea für video aufnehmen und bearbeiten. ACR ist von einer Ikerbasque Gemeinschaft und ein Forschungsprojekt von Asociación de Celiacos Madrid (ACM) finanziert. JRB wird finanziert durch Projekt ISCIII-PI16/00258 und kofinanziert von der Europäischen Union EFRE/ESF "A Way to Europa machen". IST ein Projekt Forschungsstipendium 2015111068 der baskischen Gesundheitsministerium finanziert. IRG und AJM werden durch predoctoral Gemeinschaft Zuschüsse aus der UPV/EHU und das baskische Department of Education unterstützt.

Diese Studie wurde vom Cruces University Hospital Ethics Board genehmigt und Analysen wurden durchgeführt, nach Einwilligung aus allen Fächern bzw. deren Eltern.
1. Biopsie Sammlung
Hinweis: Gewebeproben aus der distalen Zwölffingerdarm des Patienten während der Routinediagnostik Endoskopie Verwaltung Biopsien dieses Bereichs zwischen 2 und 10 mg Gewicht erhalten. Biopsiert Gewebe ist ein komplexes Gewebe bestehend aus verschiedenen Zelltypen, einschließlich der epitheliale, Immun- und endotheliale Zellen. Klinischen Gastroenterologen durchführen der Endoskopie folgenden klinischen Leitlinien.
<ol><li>Ort der Biopsie auf ein steriles Filterpapier nur nach der Endoskopie.</li>
	<li>Verwenden Sie Zange zum Übertragen der Biopsien in 1,5 mL Tuben, Tränken sie mit PBS und legen Sie es in ein Cryotube.</li>
	<li>Halten Sie Röhren auf Eis, bis im Labor eintreffen.<ol>
<li>Mit der Verarbeitung von frischen Biopsien sofort beginnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für gefrorene Biopsien Blitz einfrieren die Biopsie mit Röhren und in flüssigem Stickstoff bis zu seiner Verwendung zu speichern. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Probe eingefroren, bis der kalte ergänzte Puffer 1 hinzugefügt wird.</li>
</ol>2. Puffer Vorbereitung
Hinweis: Bevor Sie beginnen, ergänzen Sie die Puffer wie folgt.
<ol><li>Fügen Sie 1 mM DTT (Endkonzentration) und Protease und Phosphatase-Inhibitor cocktail (1 x Endkonzentration) auf die hypotone Puffer 1 und hypertonen Puffer 2 (Tabelle 1).<ol>
<li>1,5 mL Puffer 1 und 150 µL Puffer 2 pro Probe vorbereiten. DVB-t-verhindert die Oxidation der Proben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Kerne Waschpuffer durch Zugabe von 1 % Waschmittel (Nonyl Phenoxypolyethoxylethanol), eine Endkonzentration von 0,1 % auf den bereits ergänzt Puffer 1. Bereiten Sie 1 mL Waschpuffer Kerne pro Probe.</li>
</ol>(3) Biopsie Homogenisierung
<ol><li>
Frische Biopsien
	<ol>
<li>Legen Sie die Einweg-Stößel im motorisierten Mixer. Sicherstellen Sie, dass die Stößel den Boden des Rohres erreicht.</li>
		<li>Nehmen Sie die Biopsie aus der Cryotube heraus und legen Sie sie in eine 1,5 mL-Tube mit einer PIPETTENSPITZE.</li>
		<li>Der 1,5 mL Tube 200 µL ergänzt Puffer 1 hinzufügen.</li>
		<li>Homogenisieren Sie die Biopsie mit dem Stößel zu, bis das Gewebe vollständig unterbrochen wird, und halten sie auf dem Eis.</li>
		<li>Nachdem alle Biopsien homogenisiert werden mit Schritt 4 fortfahren. Hinweis: Einweg-Stößel müssen zwischen Biopsien geändert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gefrorene Biopsien Achtung: Gehen Sie vorsichtig mit flüssigem Stickstoff; Kontakt von flüssigem Stickstoff mit Haut oder Augen kann einfrieren Verletzungen führen. Schützen Sie Hände und Augen, immer beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff.<ol>
<li>Nehmen Sie einige flüssigen Stickstoff in einer Box zum Aufbewahren der Cryoröhrchen aus der Stickstofftank abgerufen werden.</li>
		<li>Finden Sie die Biopsie in der Stickstofftank und platzieren Sie die Cryotube in der Box mit flüssigem Stickstoff. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Biopsien.</li>
		<li>Übertragen Sie die Biopsie von der Cryotube auf eine 1,5 mL-Tube. Hinweis: Biopsien werden am zugefrorenen Rohr befestigt werden. Drücken Sie die Biopsie mit einer sterilen PIPETTENSPITZE, so dass es aus der Tube lösen wird.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL ergänzt Puffer 1.</li>
		<li>Das Gewebe mit Stößel und Mörser, bis das Gewebe vollständig unterbrochen wird, die Temperatur bei 4 ° C während des Verfahrens zu homogenisieren. Hinweis: Lassen Sie nicht Auftauen vor dem Hinzufügen des Puffers Biopsien.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Zytoplasma Isolation
<ol><li>Inkubieren Sie die homogenisierte Biopsie für 10 min auf Eis.</li>
	<li>Jede Probe, eine Endkonzentration von 0,05 % 10 µL 1 % Waschmittel (Nonyl Phenoxypolyethoxylethanol) hinzufügen. Hinweis: Zellen werden anschwellen und platzen durch osmotische Lyse, da die Feinwaschmittel der Zellmembran stören wird.</li>
	<li>5 Minuten auf dem Eis inkubieren.</li>
	<li>Vortex kurz und Zentrifuge bei 400 X g bei 4 ° c für 2 min.</li>
	<li>Nach dem aufschütteln Entfernen des Überstands und überträgt es auf eine neue saubere 1,5 mL Tube; Dies wird den zytoplasmatischen Bruch sein. Entsorgen Sie die Tablette nicht.</li>
</ol>(5) nukleare Isolation
<ol><li>Die Pellets aus dem vorherigen Schritt mit 200 µL Waschpuffer Kerne aufzuwirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr für 2 min bei 400 x g und 4 ° C.</li>
	<li>Den überstand verwerfen und des Waschvorgangs noch zweimal zu wiederholen. Hinweis: Waschungen werden in der nuklearen Bruchteil zytoplasmatischen Verunreinigungen entfernen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie nach der dritten Wäsche das Pellet in 100 µL Puffer 2.</li>
	<li>Die Probe kräftig schütteln bei 4 ° c für 30 min. Alternativ, die Probe auf Eis und Wirbel alle 5 min inkubieren.</li>
	<li>Nach dem schütteln, Zentrifugieren die Probe für 10 min bei Höchstgeschwindigkeit (> 12.000 x g) und 4 ° C.</li>
	<li>Nach dem aufschütteln übertragen des Überstands in eine neue saubere 1,5. mL-Tube. Dies wird den nuklearen Bruch sein.</li>
</ol>(6) Protein Quantifizierung
Hinweis: Quantifizierung der Proteine mit einem Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay Kit. Die Konzentration der Proteine in den Fraktionen werden zwischen 0,5 und 5 µg/µL, tiefer in die nukleare Bruchteil Bereich (siehe Tabelle 2 für proteinkonzentrationen von 2 mg Biopsien).
<ol><li>Bereiten Sie eine Standardkurve mit den folgenden Rinderserumalbumin (BSA) Mengen (µg)12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>Bereiten Sie die Reagenzien 100 µL der BCA Endmischung pro Probe verwenden musste.</li>
	<li>Pipette 2 µL der einzelnen Protein-Fraktionen in einer 96-well-Platte, die BCA-Mischung hinzufügen und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Lesung.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das hier beschriebene Protokoll wird für die Kern- und zytoplasmatischen Fraktionierung von intestinalen Biopsien verwendet. Der gereinigten Proteine sind nicht denaturiert und kann verwendet werden, nicht nur in der western-Blot Analyse wie in Abbildung 2 und 3 , aber auch in Tests erfordern Native gefaltete Proteine wie Immunopräzipitation, elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay (EMSA) dargestellt oder Native Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE).
<p class="j...

Proteine an nahezu alle biologischen Funktionen innerhalb einer Zelle und Abweichungen in Struktur, Menge oder Lage zu einem pathogenen Szenario führen kann. Fraktionierung Beispielmethoden Gewebe sind ein sinnvoller Ansatz zur Verringerung der Komplexität der Krankheit im Zusammenhang mit Protein-Analysen. Einige Studien Protein Lokalisierung Informationen verwenden oder ein Protein aus einem spezifischen zellulären Fach zu bereichern, so ein Protokoll für reproduzierbare Fraktionierung von intakten Proteinen sinnvoll, bestimmte biologische Fragen zu beantworten. Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen und Überwachung ihrer Substruktur Umverteilung oder Wechselwirkungen bei basalen und Erkrankungen werden dazu beitragen, die Krankheit zu identifizieren im Zusammenhang mit funktionalen Unterschiede1,2. Diese Methode soll somit reproduzierbar Darmgewebe Biopsien, frisch und gefroren, in zytoplasmatischen und nukleare subzelluläre Kompartimente fraktionieren.
Intestinale Biopsie Proben werden routinemäßig während der Endoskopie Verfahren3 (Abbildung 1) gewonnen und können effektiv für Protein Quantifizierung oder Immunopräzipitation Studien verwendet werden. Da Gewebeproben von intestinalen epithelialen Proteine enthält, die direkt an der Krankheit Pathogenese4beteiligt sein können, sind intestinale Biopsie Proben eine sehr wertvolle Quelle für die erfolgreiche Identifikation des intestinalen krankheitsspezifische Proteine. Gespeicherten gefrorenen, geduldige Gewebeproben zusammen mit den klinischen Angaben sind nützliche Quellen für Protein-Analyse und eine einfache und reproduzierbare Probenvorbereitung ist ein Schlüsselthema Zelle lag mit einschränkenden Mengen von Informationen eingefroren Gewebe-5.
Es gibt mehrere handelsüblichen Kits für die Trennung von zellulären Brüche, aber diese sind teurer und in der Regel mehr Zeit in Anspruch als das Protokoll hier vorgestellten. Protokolle basierend auf mehreren Schritten Steigung Zentrifugierung und kontinuierliche Farbverläufe haben auch bereits genutzt, für die Fraktionierung von unterschiedlichen zellularen Fächern in verschiedenen Geweben6,7. Die Konsistenz von kontinuierlichen Gradienten ist jedoch oft eine schwierige Aufgabe. Ähnliche Protokolle basierend auf die sequentielle Lyse von Membranen wurden bisher beschrieben, aber sie brauchen in der Regel mehr als zwei Puffer und die Hände auf Zeit ist länger8 .
Wenn Gewebeproben Fraktionierung, denken Sie daran, dass Gewebe Proben anwesende Zell-Zell und Zelle-Matrix Interaktionen, die nicht in kultivierten Zellen vorhanden und wichtig sind, wenn zur Proteingewinnung voran. Die richtige Aufteilung zwischen Zellen und extrazellulären Matrix ohne die Proteinqualität wird ein kritischer Faktor im Darmgewebe Protein isoliert9sein. In diesem Protokoll sind Zell-Zell und Zellmatrix Kontakte zuerst gebrochen, Freigabe der Zellen und damit des Puffers, die einzelnen Zellen zu erreichen. Um Protein-Fach vor Fraktionierung Vermischung zu vermeiden, muss die Aufteilung der Kontakte auftreten, ohne dass die Integrität der Zellen oder der Kernmembran.
Durch die Anreicherung von verschiedenen Proteasen in der Darmschleimhaut10ist es wichtig, den Proteinabbau während der Extraktion zu kontrollieren. Um die potenziellen Proteinabbau zu minimieren, muss mehrere Protease-Inhibitor in die Protein-Extraktion-Puffer enthalten sein. Darüber hinaus Wenn Extrakte für funktionelle Assays verwendet werden sollen, ist es wesentlich, der Denaturierung von Proteinen oder Proteolyse zu vermeiden, da dies einen Verlust von Protein Aktivität11führt. Zu diesem Zweck des Protokolls erfolgt bei 4 ° C und frische Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) wird hinzugefügt, um die Puffer auf eine Endkonzentration von 0,1 mM nur vor der Anwendung weiter Proteolyse zu hemmen.
Der erste Schritt in Zelle Fraktionierung ist Gewebe Störungen und Zelle Lysis. Wie bereits erwähnt, ist das Ziel zu disaggregieren der Zellen und die Pause, die sie mit minimaler Beschädigung zu öffnen. Darm Gewebeproben homogenisiert werden müssen, und die Zellen lysiert, um maximale Bruch der Zellmembran zu erreichen. In diesem Protokoll verwenden wir einen motorisierte Stößel-Mixer, um das Darmgewebe zu brechen, die innerhalb von Sekunden durch high-Speed Bereich handeln homogenisiert wird. Nach der Homogenisierung sind Gewebezellen in eine Hypotonische Puffer inkubiert, die platzt die Zellmembran aber halten die Zellkerne intakt, gefolgt durch Zugabe von einem nicht Denaturierung Reinigungsmittel (Nonyl Phenoxypolyethoxylethanol) und eine kurze Vortex Kernen zu trennen aus der zytoplasmatischen Bruchteil. Nach dem Entfernen des Zytoplasmas ist die Zellmembran Kerne in einen hypertonen Puffer mit zitternden platzen.
Die hier vorgestellte Methode ist eine geeignete Methode für die subzellulären Fraktionierung von frischen und gefrorenen intestinalen Biopsien, die während der endoskopischen Verfahren und liegen zwischen 2 und 10 mg an Gewicht gewonnen haben. Das Protokoll ist einfach und reproduzierbar und mit grundlegenden Laborgeräte und Reagenzien in weniger als einer Stunde durchgeführt werden konnte.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase- und Phosphatase-Inhibitoren</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>BCA Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Proteinquantifizierungskit</td></tr><tr><td>Einweg-Kunststoffstößel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogenisierer</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

subzellulären fraktionierung von frischen und gefrorenen magen-darm-proben

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Dieses Protokoll soll menschliche Darmgewebe erhalten durch Endoskopie in Kern- und zytoplasmatischen Fächer für die Lokalisierung Analyse spezifischer Proteine oder Proteinkomplexe in verschiedene Gewebe Staaten (z. B. gesunde fraktionieren vs. Krankheit). Diese Methode ist nützlich für die Fraktionierung von beiden frischen und gefrorenen Darm Gewebeproben; Es ist leicht zugänglich für alle Laboratorien und nicht zeitaufwendig.

Abbildung 1 zeigt eine Hämatoxylin-Eosin Färbung eines intestinale Biopsie-Sektion mit intakten Zotten und Krypta Strukturen.
Repräsentative Ergebnisse der nuklearen und zytoplasmatischen Fraktionierung unter Verwendung dieses Protokolls sind in den Abbildungen 2 und 3gezeigt. Im Experiment gezeigt in Abbildung 2, ein frisches (Fh) und ...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine einfache zelluläre Fraktionierung für die subzelluläre Trennung der zytoplasmatischen und nukleare Proteine im menschlichen frisch- und Gefrierfleisch intestinalen Biopsien durchführen.

Subzellulären Fraktionierung von frischen und gefrorenen Magen-Darm-Proben

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

Das Ziel des folgenden Protokolls ist es, subzelluläre Fraktionen aus gefrorenen oder frischen gastrointestinalen Proben zu erzeugen. Proteine sind an fast allen biologischen Funktionen innerhalb einer Zelle beteiligt. In jeder Variation, in der sie an einem Ort extrahiert werden, kann dies zu einem pathogenen Szenario führen.Einige Studien nutzen die Bewertung der Proteinlokalisierung oder müssen ein Protein aus einem bestimmten zellulären Kompartiment eindringen. Daher ist die reproduzierbare Fraktionierung intakter Proteine in dieser Hinsicht wichtig. Darmbiopsieproben sind seit kurzem im Rahmen der Endoskopie erhältlich und können effektiv für Proteinquantifizierungs- oder Immunpräzipitationsstudien verwendet werden.Klinische Darmproben sind eine wichtige Ressource für die effektive Identifizierung von gewebe- und krankheitsspezifischen Proteinen. Der Name dieser Methode ist die Fraktionierung von menschlichem Darmgewebe, das durch Endoskopie gewonnen wurde, in nukleare und zytoplasmatische Kompartimente für die Lokalisierungsanalyse eines bestimmten Proteins oder Proteinkomplexes. Diese Methode dient der Fraktionierung beider.Zuerst findet unsere gefrorene Darmbiose statt. Für das Frozen Tissue-Verfahren frieren Sie die Proben sofort nach der Entnahme ein und lagern Sie sie bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff. Es ist wichtig, die Probe bis zur Zugabe des kalten Homogenisierungspuffers eingefroren zu halten.Bei frischen Proben übertragen Sie die Biopsie in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen und bewahren Sie sie bis zum Beginn des Eingriffs auf Eis auf. Gefrorene Gewebeproben werden in der Regel an der Wand des Kryoröhrchens befestigt, das Gewebe kann mit einer sterilen Pipettenspitze freigegeben werden, bevor es in ein konisches 1,5-ml-Mikroröhrchen überführt wird. Geben Sie 200 ml Puffer, einen mit DDT und Phosphatase- und Proteaseinhibitoren ergänzten Puffer, in das Mikroröhrchen, das die Probe enthält.Homogenisieren Sie die Probe mit einem Gefäß, bis das Gewebe vollständig aufgebrochen ist, und halten Sie sie auf Eis. Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis. Geben Sie 10 ml 1 Prozent Detergens zu jeder Probe bis zu einer Endkonzentration von 0,05 Prozent, um die Zellmembran zu zerstören.Fünf Minuten auf Eis inkubieren. Kurz vortexen und bei 400 g bei 4 Grad zwei Minuten zentrifugieren. Der Überstand mit der zytoplasmatischen Proteinfraktion wird entfernt und in ein sauberes Röhrchen überführt.Entsorgen Sie das Pellet nicht. Das Pellet wird in 200 ml Puffer zwei resuspendiert, der mit DDT und Phosphatase und Proteaseinhibitoren ergänzt wird. Bei 400 g 2 Minuten zentrifugieren.Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang noch zweimal. Nach der dritten Wäsche suspendieren Sie das Pellet wieder in 100 ml Puffer zwei. 30 Minuten lang bei 4 Grad kräftig schütteln.10 Minuten lang bei 4 Grad bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugieren. Der Überstand mit der Kernproteinfraktion wird in ein sauberes Röhrchen überführt. Zytoplasmatische und nukleare Fraktionen sind nun bereit für die Quantifizierung und nachgelagerte Experimente.Die Darmschleimhaut ist reich an mehreren Proteasen und daher muss der Proteinabbau während der Extraktion kontrolliert werden. Um den Proteinabbau zu minimieren, sollten mehrere Proteasehemmer in die Proteinextraktionspuffer aufgenommen werden. Darüber hinaus sollen die Extrakte für weitere Assays verwendet werden. Es ist wichtig, eine Proteindenaturierung oder Proteolyse zu vermeiden.Dies führt zu einem Verlust der Proteinaktivität. Als Folge der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte, die in Geweben vorhanden sind, müssen einige Modifikationen in den Proteinextraktionsprotokollen implementiert werden, die routinemäßig mit Zellkulturen verwendet werden. Die Trennung der Zellen von der transzellulären Matrix ohne Beeinträchtigung der Proteinqualität ist ein kritischer Faktor für die effiziente Isolierung von Darmgewebeproteinen.Auf der linken Seite zeigt die Tabelle die Proteinkonzentrationen der einzelnen Fraktionen aus den frischen und gefrorenen 2-ml-Biopsieproben. Die Konzentrationen werden in Mikrogramm pro Mikroliter angegeben. In diesem Experiment wurden eine frische und eine gefrorene Probe gleichzeitig gemäß dem Protokoll fraktioniert.Und es wurde ein Western Blot mit 20 mg jeder Probe durchgeführt. Um die Reinheit der Fraktionen zu überprüfen, wurden HSP90 und Tubulin als zytoplasmatische Kontrollen und HDAC1 und H3 als nukleare Kontrollen verwendet. Wie zu beobachten ist, befinden sich HSP90 und Tubulin hauptsächlich im Zytoplasma und HDAC1 und H3 im Zellkern mit sehr residualer Durchmischung zwischen den beiden Fraktionen.Um zu sehen, ob das Protokoll den Zelltod beeinflusst, haben wir auch CASP3 nachgewiesen. Beide Proben weisen eine sehr geringe Färbung für CASP3 auf, was bestätigt, dass das Verfahren den Zelltodweg auch nach dem Schockfrosten der Biopsien nicht beeinflusst. Die in diesem Experiment verwendeten gefrorenen Proben stammten von einer Person mit einer intestinalen Entzündungserkrankung und wie erwartet erscheint pSTAT1 im Zytoplasma dieser Probe, was bestätigt, dass die Proteinmodifikationen nach der Fraktionierung erhalten bleiben und somit für die nachgelagerte funktionelle Analyse verwendet werden können.Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in gefrorenen Biopsien ist in dieser Abbildung dargestellt. Die Fraktionen sind sauber und es gibt nur eine minimale Vermischung der Kompartimente. Frische und gefrorene Biopsien können in diesen Protokollen gleichermaßen verwendet werden, wobei gefrorene Biopsien saubere und reproduzierbare Ergebnisse liefern, wie in Abbildung 1 und 2 zu sehen ist.Das hier beschriebene Protokoll ist darauf ausgelegt, die möglichen Proteinfraktionen zu erzeugen. Eine gewisse intrinsische Variabilität innerhalb der Probe, einschließlich der Größe und des Status des Gewebes, kann jedoch zu Abweichungen in den Proteinmengen und den Verteilungsmengen in den Fraktionen führen.

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In situ subzellulären Fraktionierung von Säugetierzellen auf Mikroskop-Deckgläser ermöglicht die Visualisierung von Protein-Lokalisierung.

In situ subzelluläre Fraktionierung von adhärenten und nicht adhärenten Säugetierzellen

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Isolierung von Einzelkernen aus frisch gefrorenem Gliomgewebe. Die isolierten Einzelkerne können als Proben für Sequenzierungstechniken wie die Einzelkern-RNA (snRNA)-Sequenzierung und die Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin (snATAC)-Sequenzierung verwendet werden, um tiefere Einblicke in die inter- und intratumorale Heterogenität zu erhalten, die bei Gliomen des zentralnervösen Gewebes beobachtet wird.

Isolierung von Zellkernen aus frisch gefrorenem Gliomgewebe: Eine Methode zur Gewinnung intakter Zellkerne aus Gliomtumorproben

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Isolierung von räumlich unterschiedlichen murinen Dickdarmepithel-Oberflächenzellen von den darunter liegenden Krypten-Basiszellen.

Kryoschneiden Verfahren zur Mikrodissektion von Murine Kolonschleimhaut

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung und Etablierung von primären Fibroblasten/Myofibroblasten (MF)-Kulturen aus gefrorenen Magen-, kleinen Darm- und Dickdarmgewebe-liefernden Zellen mit einem MF-Phänotyp vorgestellt. Diese Zellen exprimieren CD90, α-SMA und Vimentin. MFs können für eine Vielzahl von funktionellen Assays verwendet werden, einschließlich enzymatischer Aktivität und Zytokinproduktion.

Isolierung von CD 90+ Fibroblasten / Myofibroblasten von Human Gefrorene Magen-Darm-Proben

Das Ziel dieses Protokolls ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien isoliert von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Dieses Protokoll beinhaltet Probenvorbereitung Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe, Kryoschneiden, ethanolische Färbung und Dehydrierung, LCM, und RNA-Extraktion.

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Plasmamembran, Zytoplasma und Mitochondrien von U937 Zellen ohne den Einsatz von High-Speed-Zentrifugation zu isolieren. Diese Technik lässt sich subzelluläre Fraktionen für die anschließende Untersuchung des Proteins Lokalisierung über Immunoblotting zu reinigen.

Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation

Dieses Protokoll beschreibt mehrere Verfahren zur Herstellung hochwertiger gefrorener Gewebeproben zum Zeitpunkt der Nekropsie zur Verwendung im Kometentest zur Beurteilung von DNA-Schäden: 1) Hackfleisch, 2) abgekratzte Epithelzellen aus dem Magen-Darm-Trakt und 3) gewürfeltes Gewebe Eine Homogenisierung mit einem Gewebeminincing-Gerät erforderlich.

Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

Intratumorale Heterogenität ist ein inhärentes Merkmal von Tumoren, einschließlich Gliomen. Wir haben ein einfaches und effizientes Protokoll entwickelt, das eine Kombination aus Puffern und Gradientenzentrifugation verwendet, um einzelne Kerne aus frischem gefrorenem Gliomgewebe für Einzelkern-RNA- und ATAC-Sequenzierungsstudien zu isolieren.

Kernisolierung aus frischen gefrorenen Hirntumoren für Einzelkern-RNA-seq und ATAC-seq

Dieses Fraktionierungsprotokoll wird es Forschern ermöglichen, zytoplasmatische, nukleare, mitochondriale und Membranproteine aus Säugetierzellen zu isolieren. Die beiden letztgenannten subzellulären Fraktionen werden über einen isopyknischen Dichtegradienten weiter gereinigt.

Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung

Das Protokoll bietet einen zuverlässigen und optimierten Ansatz für die Isolierung von Zellkernen aus soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung mit der 10x Genomics-Plattform, einschließlich Empfehlungen für Gewebedissoziationsbedingungen, Kryokonservierung von Einzelzellsuspensionen und Bewertung isolierter Zellkerne.

Optimierte Zellkernisolierung aus frischen und gefrorenen soliden Tumorproben für die Multiom-Sequenzierung

Wir beschreiben ein Mausmodell des postoperativen Ileus, das durch intestinale Manipulation erzeugt wurde. Die gastrointestinale Transitfunktion, die pathologischen Veränderungen und die Aktivierung der Immunzellen wurden 24 Stunden nach der Operation beurteilt.

Postoperatives Ileus-Mausmodell

Lernen Sie die subzelluläre Fraktionierung von frischen und gefrorenen Magen-Darm-Proben zur Trennung zytoplasmatischer und nukleärer Proteine. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinlokalisationsstudien.

Subzellulären Fraktionierung von frischen und gefrorenen Magen-Darm-Proben

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