Name: Genetische Analyse der erblichen Transthyretin-Ala97Ser im Zusammenhang mit Amyloidose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Erfahren Sie ein zuverlässiges Protokoll zur Bestätigung von Punktmutationen bei hereditärer Transthyretin-Amyloidose mittels PCR und Agarose-Gelelektrophorese. Diese Methode ermöglicht eine frühzeitige Diagnose im klinischen Labor.

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Wir wollen Miss Shin-Fun Wu für ihre Hilfe in den Experimenten zu danken. Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) und IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.

Die Tests im Labor wurde gemäß den Anforderungen von den klinischen Labor Verbesserung Änderungen (CLIA) von 1988, die Vorschriften genehmigt durch die institutionelle Review Board der Chang Gung Memorial Hospital durchgeführt und Universität (Lizenz Nr. 100 - 4470A3 und 104-2462A3). Die Einwilligung wurde von allen Patienten.
1. Probe Blutentnahme
<ol><li>Sammeln Sie Vollblut in handelsübliche EDTA behandelt Röhren. Vorsichtig mischen und Blutprobe bei 4 ° C bis zur Verarbeitung lagern.</li>
</ol>(2) DNA-Extraktion aus dem peripheren Blut
Verwenden Sie den DNA-Extraktion Kit für die genomische DNA-Extraktion (siehe Tabelle der Materialien).
<ol><li>Die Blutprobe 4,0 mL 10 mL der Lösung 1 hinzufügen. Inkubation der Probe für 10 min auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 2.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie und entsorgen Sie überstand sorgfältig. Das Pellet in 3 mL der Lösung 1 aufzuwirbeln.</li>
	<li>Die Probe bei 2.000 x g für 5 min bei 4 ° C wieder Zentrifugieren und überstand verwerfen. Das Pellet in 3 mL der Lösung 2 aufzuwirbeln.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL Pronase Stammlösung (225 mg/mL) um eine Endkonzentration von 100 µg/mL und gut mischen. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren.</li>
	<li>Das Rohr auf dem Eis für 10 min. Add 0,8 mL der Lösung 3 zum Beispiel Chill und invertieren 3 - 5 Mal. Legen Sie Beispiel für 5 min auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Übertragen Sie überstand sorgfältig auf eine 15 mL sterile konische Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 6 µL RNase-Stammlösung (10 mg/mL) um eine Endkonzentration von 20 µg/mL zu erhalten. Inkubation bei 37 ° C für 15 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie 2,5 mL Isopropylalkohol und Mischung gründlich durch sanft invertieren mehrmals, DNA auszufällen (Stränge aus Weißen, flockiges Material bilden). Mit einer großen Bohrung pipettieren übertragen Sie DNA Fällungsmittel, eine neue 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 12.000 x g für 3 min bei 4 ° C. Überstand vorsichtig zu verwerfen. Waschen Sie DNA-Pellet durch Zugabe von 500 µL 70 % Ethanol.</li>
	<li>12.000 x g für 1 min zentrifugieren und überstand verwerfen. DNA-Pellet bei Raumtemperatur Lufttrocknen. Fügen Sie 100 µL DdH2O und inkubieren Sie bei 65 ° C für 15 min zur DNA aufzuwirbeln.</li>
</ol>(3) genomischer DNA Quantifizierung
Verwenden Sie ein Spektralphotometer (siehe Tabelle der Materialien), die Quantität und Qualität der genomic DNA zu erkennen.
<ol><li>Melden Sie sich bei dem Computer mit dem Spektralphotometer-Computer angeschlossen. Öffnen Sie die Software.</li>
	<li>Die Spektralphotometer-Maschine zu initialisieren:<ol>
<li>Das Spektralphotometer-Software "Nukleinsäure" anklicken.</li>
		<li>Reinigen Sie den Sockel mit einem Einweg-Papier abwischen und gereinigtes Wasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Spektralphotometer leer:<ol>
<li>Laden Sie 2 µL des gereinigten Wassers auf dem Podest.</li>
		<li>Senken Sie den oberen Arm des Spektralphotometers und klicken Sie auf "Leer", um es zu kalibrieren.</li>
		<li>Wenn es fertig ist, heben Sie den Oberarm und trocknen Sie den Sockel mit einem Tuch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen der Probenmaterials:<ol>
<li>Klicken Sie auf "DNA-50" auf Probe.</li>
		<li>Laden Sie 2 µL DNA-Probe auf dem Podest.</li>
		<li>Senken Sie den oberen Arm, und klicken Sie auf "Messen", um das A260/A280-Verhältnis und die Konzentration der Probe zu messen.</li>
		<li>Reinigen Sie das Podest zwischen jedem Lauf mit einem Tuch und gereinigtes Wasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie auf "Print Screen", um die Daten zu sammeln.</li>
</ol>4. genetische Analysen von Mutationen
Die Ziel DNA mit dem PCR-4zu verstärken. Führen Sie PCR in eine 25 µL Reaktion Mischung mit einer DNA-Polymerase kit (siehe Tabelle der Materialien). Tabelle 1 zeigt das TTR-gen intronischen Primer.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>gen</td>
			<td>Primer Sequenz</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon1</td>
			<td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3 " R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3 "</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon2</td>
			<td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3 " R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3 "</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon3</td>
			<td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3 " R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3 "</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon4</td>
			<td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3 " R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3 "</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. TTR-gen intronischen Primer. (NCBI Referenzsequenz: NC_000018.10)
<ol><li>Eine 0,2 mL PCR-Tube die Reagenzien in Tabelle 2 hinzufügen.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Komponenten</td>
			<td>Volumen (µL)</td>
			<td>Endkonzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x Puffer</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 GC Enhancer</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>360-DNA-Polymerase</td>
			<td>0,2</td>
			<td>2 U/Reaktion</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (25 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grundierung F (10 µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grundierung R (10 µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA (100 ng)</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR-Klasse Wasser</td>
			<td>13.8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamtvolumen</td>
			<td>25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2. PCR-Reaktion Zustände.
<ol start="2"><li>Vorsichtig mischen und kurz Zentrifugieren auf einer Benchtop-Zentrifuge, alle Komponenten an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Legen Sie Rohr in einem Thermocycler.</li>
	<li>Durchführen Sie für 30 Zyklen PCR. Jeder Zyklus besteht aus einer Denaturierung Schritt für 30 s bei 94 ° C, Grundierung glühen für 30 s bei 58 ° C und Polymerase-Erweiterung für 45 s bei 72 ° C (siehe Tabelle 3).</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Schritt</td>
			<td>Temperatur (° C)</td>
			<td>Zeit</td>
			<td>Zyklus</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anfängliche Denaturierung</td>
			<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA-Denaturierung Schritt</td>
			<td>94</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer annealing Schritt</td>
			<td>58</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polymerase-Erweiterung Schritt</td>
			<td>72</td>
			<td>45 s</td>
			<td>30 Zyklen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post Dehnung Schritt</td>
			<td>72</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ende der PCR Radfahren</td>
			<td>4</td>
			<td>Unbestimmte</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3. Bedingungen zur Verstärkung der PCR-Produkte mit dem Fahrrad.
<ol start="4"><li>Überprüfen Sie das PCR-Produkt durch die Visualisierung mit Gelelektrophorese:<ol>
<li>Bereiten Sie eine 1,2 % Agarosegel:<ol>
<li>1,2 g Agarose-Pulver mit 100 mL 0,5 mischen X TBE in microwavable Kolben. Mikrowelle für 2 min bis die Agarose komplett aufgelöst ist. Die Agarose-Mischung auf 55 ° c abkühlen</li>
			<li>Die Agarose-Mischung 2 µL einer Interkalation-Bromid-Lösung (10 mg/mL) hinzufügen und vorsichtig mischen. Die Agarose-Teig in eine Gel-tiefziehschiene auf ca. 5-7 mm, dann fügen Sie die Comb(s) im Ort. Lassen Sie es zu festigen (mindestens 30 min) und entfernen vorsichtig Comb(s).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Proben zu laden und Ausführen einer Agarose-Gels:<ol>
<li>Legen Sie Gel und Tablett in der Elektrophorese-Zelle. Füllen Sie die Elektrophorese-Zelle mit 0,5 X TBE bis das Gel bedeckt ist.</li>
			<li>Sorgfältig laden 2 µL eines 100 bp DNA-Leiter (siehe Tabelle der Materialien), in der eine Spur des Gels als molekulare Größe Marker. Last Farbstoff/Probe Mischung (5 µL des PCR-Produkt-Mix mit 1 µL 6 x laden Farbstoff) in den zusätzlichen Fahrspuren.</li>
			<li>Schalten Sie die Stromversorgung. Führen Sie das Gel für 25 min bei 100 V.</li>
			<li>Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophorese-Zelle. Visualisieren Sie die DNA-Fragmente unter UV-Licht in ein bildgebendes System.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) DNA-Sequenzierung
<ol><li>PCR-Produkte mit einem kommerziellen Kit reinigen und kommerziell oder mit einem automatischen Sequenzer-Sequenz (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Senden Sie Nukleotidsequenzen an den BLAST NCBI-Server die Abfrage Nukleotid Nukleotid Datenbanken10zu vergleichen. Nachdem die Ergebnisse angezeigt werden, führen Sie Reihenfolge Ausrichtungen und identifizieren Sie die erwarteten Mutation zu.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es gibt zwei wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls. Erstens sollte ein Hemodiluted Exemplar um ausreichende Anzahl von weißen Blutkörperchen, vermiedene11. Zweitens ist die Verwendung von entsprechenden PCR Primer grundlegend für zuverlässige Ergebnisse12zu erhalten. Wir verwendet die Primer-BLAST-Web-Tool, um Primer4,13zu entwerfen; ein Minimum von 40 Basenpaare auf jeder Seite vier TTR Exons sollten abgedeckt...

Transthyretin (TTR) Amyloidose (ATTR) ist die häufigste Form des erblichen systemische Amyloidose1und kann durch eine autosomal dominant vererbte Mutation im Transthyretin (TTR) gen2verursacht werden. TTR Mutationen destabilisieren die tetrameres Protein-Struktur und führen zu seiner Dissoziation in Monomere, die Amyloid-Fibrillen2setzt. Mehr als 100 Amyloidogenic TTR Mutationen wurden berichteten weltweit1. Genetische Analysen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methoden bestätigen das Vorhandensein von TTR Punktmutation und haben Vorteile, einschließlich den Umgang mit radioaktiv markierte Sonden im Vergleich zu Südlicher Fleck3zu vermeiden. PCR ist eine schnell, einfach, billig und zuverlässige Technik, die auf zahlreichen Feldern in modernen Wissenschaften4angewendet wurde.
Die Früherkennung dieser progressive und tödliche Krankheit ist schwierig, angesichts ihrer phänotypischen Heterogenität. Mit zunehmender Aufmerksamkeit und breitere Anerkennung auf den frühen Manifestationen der ATTR sowie die aufstrebenden Behandlungen5, sind entsprechende diagnostische Untersuchungen einschließlich TTR Gentest daher kritisch grundlegend für die Prognose zu verbessern. Darüber hinaus sind verschiedene Mutationen im Zusammenhang mit unterschiedlicher Penetranz des Merkmals, Erkrankungsalter, Muster der Progression, schwere der Erkrankung, mediane Überlebenszeit, Wirksamkeit der Lebertransplantation oder TTR Stabilisatoren2,6, und Variable Grad der neurologischen und kardiologischen Beteiligung, die große Auswirkungen auf die genetische Beratung7,8,9haben. Ein hochgenauer Gentest ist übrigens das einzige Werkzeug, das unterscheidet zwei verschiedenen Arten von ATTR: erbliche (mutierten) und Wildtyp (nicht mutierte Form, senile systemische Amyloidose, SSA)7. Es ist zwingend notwendig, um die Arten von ATTR, bestätigen, weil die Therapien2unterschiedlich. Daher ist eine zunehmende Notwendigkeit, das schrittweise Protokoll der TTR-Gentest zu beschreiben.
Die molekularen Ansatz zu erkennen, die Mutation wird mit Ala97Ser, die am häufigsten verwendeten endemische Mutation in Taiwan, als Beispiel veranschaulicht werden. Änderungen in der DNA-Extraktionsschritt reduzieren die Menge der drei Lösungen verwendet und liefert eine ausreichende Menge an DNA. In diesem Protokoll alle vier TTR Exons wurden analysiert, während Regionen einschließlich 5' stromaufwärts, 3' flussabwärts, Promotoren, Introns und unübersetzte Regionen (UTR) wurden nicht sequenziert.

<table><tbody><tr><td>EDTA-behandelte Röhrchen</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-Extraktionskit</td><td>Stratagen</td><td>200600</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND2000 Spektralphotometer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Wischtücher für zarte Aufgaben</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td></td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 DNA-Polymerase-Kit</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>4398823</td> TTR-Gen-intronische <td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>Exon1</td><td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon1</td><td>R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon2</td><td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon2</td><td>R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon3</td><td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon3</td><td>R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon4</td><td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon4</td><td>R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresezelle</td><td>ADVANCE</td><td>Mupid-2plus</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Leiter</td><td>Protech</td><td>PT-M1-100</td><td></td></tr><tr><td>Farbstoff</td><td>BioLabs</td><td>B7021</td><td></td></tr><tr><td>AlphaImager EC</td><td>Alpha Innotech</td><td>AlphaImager EC</td><td></td></tr><tr><td>automatischer Sequenzierer&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>3730xl DNA-Analysator</td><td></td></tr></tbody></table>

genetische analyse der erblichen transthyretin-ala97ser im zusammenhang mit amyloidose

Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis

Gentests ist der zuverlässigste Test für erbliche Transthyretin Amyloidose und sollte in den meisten Fällen der Transthyretin-Amyloidose (ATTR) durchgeführt werden. ATTR ist eine seltene, aber tödlichen Krankheit mit heterogenen Phänotypen; Daher wird die Diagnose manchmal verzögert. Mit zunehmender Aufmerksamkeit und breitere Anerkennung auf frühen Äusserungen der ATTR sowie aufstrebenden Behandlungen, geeignete diagnostische Studien, einschließlich der genetischen Transthyretin (TTR) zu testen, um die Typen zu bestätigen und Varianten der ATTR sind daher grundlegender Bedeutung für die Prognose zu verbessern. Genetische Analysen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methoden bestätigen das Vorhandensein von TTR Punktmutationen sehr viel schneller und sicherer als herkömmliche Methoden wie Südlicher Fleck. Hier zeigen wir genetische Bestätigung der ATTR Ala97Ser Mutation, die am häufigsten verwendeten endemische Mutation in Taiwan. Das Protokoll umfasst vier Hauptschritte: Sammeln von Vollblut-Probe, DNA-Extraktion, genetische Analyse der alle vier TTR Exons mit PCR und DNA-Sequenzierung.

Agarose-Gelelektrophorese von zwei Patienten und eine gesunde individuelle offenbarten Bands der erwarteten Größen, einschließlich ein 454 bp-PCR-Produkt für Exon 4 des TTR-Gens (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57743/57743fig1.jpg"> Abbildung 1 . Gelelektrophorese Darstellung PCR verstärkt TTR gen. Normal: ein...

Hier präsentieren wir ein Protokoll bestätigen das Vorhandensein von Punktmutation für die Diagnose einer erblichen Transthyretin-Amyloidose, mit Ala97Ser, die am häufigsten verwendeten endemische Mutation in Taiwan, als Beispiel.

Genetische Analyse der erblichen Transthyretin-Ala97Ser im Zusammenhang mit Amyloidose

Genetic testing is the most reliable test for hereditary transthyretin related amyloidosis and should be performed in most cases of transthyretin ...

Mit zunehmender Aufmerksamkeit für frühe Manifestationen der Transthyretin-Amyloidose sowie für neue Behandlungen sind geeignete Studien zur Bestätigung der Arten und Varianten der Transthyretin-Amyloidose von grundlegender Bedeutung, um die Prognose zu verbessern. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass dieser Test im klinischen Labor durchführbar und leicht durchzuführen ist. Um das Protokoll zu beginnen, besorgen Sie sich ein DNA-Extraktionskit, fügen Sie 10 Milliliter Lösung eins zu der zuvor erhaltenen 4,0-Milliliter-Blutprobe hinzu und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Probe bei 2000 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn. Suspendieren Sie das Pellet erneut in drei Millilitern Lösung eins.Die Probe wird bei 2000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius erneut zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Pellet erneut in drei Millilitern Lösung zwei.Fügen Sie anschließend 10 Mikroliter Pronase-Stammlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, und mischen Sie den Inhalt gut. Inkubieren Sie die DNA über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag kühlen Sie die Tube 10 Minuten lang auf Eis.Geben Sie 0,8 Milliliter Lösung drei in die Probe und invertieren Sie sie drei- bis fünfmal. Legen Sie die Probe dann fünf Minuten lang auf Eis. Die Probe wird bei 3000 g 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert.Der Überstand wird vorsichtig in ein steriles konisches Zentrifugenröhrchen von 15 Millilitern überführt und sechs Mikroliter RNase-Stammlösung hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Inkubieren Sie die Probe, geben Sie 2,5 Milliliter Isopropylalkohol in das Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig um, um die DNA auszufällen, die als Stränge aus weißem Flockungsmittelmaterial erscheint. Mit einer Pipette mit großer Bohrung wird der Niederschlag in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.Zentrifugieren Sie den Niederschlag bei 12.000 g drei Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig. Waschen Sie dann das DNA-Pellet, indem Sie 500 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzufügen.Die DNA wird eine Minute lang bei 12.000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Trocknen Sie das DNA-Pellet bei Raumtemperatur an der Luft. Fügen Sie 100 Mikroliter DDH2O hinzu und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang bei 65 Grad Celsius, um die DNA wieder zu suspendieren.Führen Sie die PCR in einem 25-Mikroliter-Reaktionsgemisch mit einem DNA-Polymerase-Kit durch. Geben Sie die Reagenzien in ein 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen. Mischen Sie den Inhalt vorsichtig und zentrifugieren Sie ihn kurz in einer Tischzentrifuge.Legen Sie das Rohr in einen Thermocycler. Führen Sie die PCR für 30 Zyklen durch, mit einem Denaturierungsschritt für 30 Sekunden bei 94 Grad Celsius, einer Primeraktivierung für 30 Sekunden bei 58 Grad Celsius und einer Polymeraseverlängerung für 45 Sekunden bei 72 Grad Celsius. Bereiten Sie ein 1,2%iges Agarose-Gel vor, indem Sie 1,2 Gramm Agarosepulver mit 100 Millilitern 0,5 XTBE in einem mikrowellengeeigneten Kolben mischen.Die Lösung zwei Minuten lang in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Die Agarosemasse auf 55 Grad Celsius abkühlen lassen. Geben Sie zwei Mikroliter Ethidiumbromidlösung zur Agarosemischung und mischen Sie sie vorsichtig.Gieße die Mischung in eine Gelschale mit einer Größe von etwa fünf bis sieben Millimetern. Führen Sie dann den Kamm ein. Lassen Sie das Gel mindestens 30 Minuten lang festigen.Nachdem das Gel fest geworden ist, entfernen Sie vorsichtig den Kamm. Legen Sie das Gel und die Schale in die Elektrophoresezelle. Füllen Sie die Elektrophoresezelle mit 0,5 XTBE, bis das Gel bedeckt ist.Laden Sie vorsichtig zwei Mikroliter einer DNA-Leiter mit 100 Basenpaaren als Molekülgrößenmarker in die eine Spur des Gels. Laden Sie das Farb- und Probengemisch in die zusätzlichen Bahnen. Schalten Sie die Stromversorgung ein und lassen Sie das Gel 25 Minuten lang bei 100 Volt laufen.Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophoresezelle. Visualisieren Sie abschließend die DNA-Fragmente unter UV-Licht in einem Bildgebungssystem. Die Agarose-Gelelektrophorese von zwei Patienten und einer gesunden Person zeigt Banden der erwarteten Größe, einschließlich eines PCR-Produkts mit 454 Basenpaaren für das Exon vier des TTR-Gens.Sequenzchromatogramme zeigten eine Nukleotid-T-Substitution für G im Exon vier des TTR-Gens, was bei zwei Patienten zu einer Missense-Mutation und einer Alanin-Serin-Substitution an der Aminosäureposition 97 führte. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Vorhandensein von Punktmutationen für die Diagnose der hereditären Transthyretin-Amyloidose bestätigen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie in Kombination mit der Biopanning-Technologie haben wir ein negatives und positives Biopanning-System entwickelt, um Antikörper gegen krankheitsspezifische Proteinvarianten zu gewinnen, die in jedem biologischen Material vorhanden sind, selbst bei niedrigen Konzentrationen.  Es ist uns gelungen, Antikörper gegen TDP-43-Proteinvarianten zu erhalten, die an der Amyotrophen Lateralsklerose beteiligt sind.

Novel Rasterkraftmikroskopie.Wie Biopanning für Isolierung von Morphologie Spezifische Reagenzien gegen TDP-43 Varianten in Amyotrophe Lateralsklerose

Ein reverse-genetischer Ansatz zum Verständnis von Genfamilien, die mit menschlichen Krankheiten assoziiert sind, wird vorgestellt, wobei die Maus als Modellsystem verwendet wird, und der anschließende Maus-Phänotypisierungsplan wird beschrieben. Da Mäuse, die an einem interessierenden Gen, HtrA2, defekt waren, Parkinson-Symptome zeigten, konzentriert sich das Phänotypisierungsschema auf die Identifizierung neurologischer Defekte.

Eine Phänotypisierung Regimen für genetisch modifizierte Mäuse verwendet, um Gene in menschlichen Krankheiten des Alterns Beteiligt Study

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins.

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Amyloid-Ablagerungen ist ein Markenzeichen von verschiedenen Krankheiten und viele andere Organe befällt. Dieses Papier beschreibt die Anwendung der leuchtenden konjugierte Oligothiophene Fluoreszenz Färbung in Kombination mit Fluoreszenz-Mikroskopie-Techniken. Diese Färbung Methode darstellt, ein leistungsstarkes Tool für die Erkennung und Erforschung von Proteinaggregaten in klinischen und wissenschaftlichen Einrichtungen.

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation ist eine Zeit- und kosteneffiziente Ansatz, der in der Erforschung von Krankheiten und der klinischen Diagnostik immer beliebter wird. Das hier beschriebene Protokoll stellt die komplexen Workflow für die Sequenzierung erforderlich und der Bioinformatik-Prozess verwendet, um Genvarianten identifizieren, die zur Krankheit beitragen.

Gezielte Sequenzierung der nächsten Generation und Bioinformatik-Pipeline, um genetische Determinanten der konstitutionelle Krankheit zu bewerten

In der vorliegenden Studie, beschreiben wir eine Methodik zur Analyse des Genotyps C924T. Das Protokoll besteht aus drei Phasen: DNA-Extraktion, Verstärkung durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Analyse von der Beschränkung Fragment-Länge Polymorphismus (RFLP) auf Agarosegel.

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Aminosäure-Niveau Signal-Rausch-Analyse bestimmt die Prävalenz der genetischen Variation an einer bestimmten Aminosäure-Position auf Hintergrund genetische Variation einer bestimmten Population normalisiert. Dies ermöglicht eine Identifizierung der Variante "Hotspots" in eine Proteinsequenz (Signal), die über die Häufigkeit der seltenen Varianten gefunden in einer Population (Lärm) steigt.

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Blutbasierte Biomarker für neurodegenerative Erkrankungen sind für die Durchführung groß angelegter klinischer Studien unerlässlich. Ein zuverlässiger und validierter Bluttest sollte ein kleines Probenvolumen sowie eine weniger invasive Probenahmemethode erfordern, erschwinglich und reproduzierbar. Dieses Papier zeigt, dass der Immunoassay für kapillare Elektrophorese mit hohem Durchsatz Kriterien für die entwicklung potenzieller Biomarker erfüllt.

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Erfahren Sie ein zuverlässiges Protokoll zur Bestätigung von Punktmutationen bei hereditärer Transthyretin-Amyloidose mittels PCR und Agarose-Gelelektrophorese. Diese Methode ermöglicht eine frühzeitige Diagnose im klinischen Labor.

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