Name: CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Erfahren Sie die CRISPR/Cas9-Genomeditierung zur Erzeugung bedingter glmS-Knockdown-Mutanten in Plasmodium falciparum. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinfunktionen beim menschlichen Malaria-Parasiten.

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Wir danken Muthugapatti Kandasamy Herzstück der University of Georgia (UGA) biomedizinischen Mikroskopie für technische Hilfe und Jose Juan Lopez-Rubio für den Austausch der pUF1-Cas9 und pL6 Plasmide. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Bögen Foundation Awards, D.W.C. und H.M.K., UGA Start Mittel caracterización, Zuschüsse aus der March of Dimes Foundation (Basil O'Connor Starter Gelehrter Forschungspreis) gegangen und US National Institutes of Health gewährt (R00AI099156 und R01AI130139), caracterización und (T32AI060546), H.M.K.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Umsetzung der CRISPR/Cas9 in p. Falciparum hat sowohl erhöht die Effizienz und verringert den Zeitaufwand für die Änderung der Parasit Genom, im Vergleich zu bisherigen Methoden der genetischen Manipulation. Dieses umfassende Protokoll beschreibt die Schritte, die notwendig für die Erzeugung von bedingten Mutanten mit CRISPR/Cas9 in p. Falciparum. Während die Methode hier speziell für die Generation von HA -quantifizierten Mutanten ausgerichtet ist, kann diese Strategie für eine Vielzahl vo...

Malaria ist eine verheerende Krankheit verursacht durch Protozoen Parasiten der Gattung Plasmodium. P. Falciparum, der meisten tödlichen menschlichen Malaria-Parasiten verursacht rund 445.000 Todesfälle pro Jahr, meist bei Kindern unter dem Alter von fünf1. Plasmodium -Parasiten haben einen komplizierten Lebenszyklus mit einem Moskito Vektor und ein Wirbeltier Host. Menschen infizieren sich zunächst eine infizierte Mücke eine Blutmahlzeit nimmt. Dann der Parasit dringt in die Leber, wo es wächst, entwickelt sich und teilt für etwa eine Woche. Nach diesem Vorgang sind die Parasiten in den Blutkreislauf freigesetzt, wo sie asexuelle Reproduktion in roten Blutkörperchen (Erythrozyten) unterzogen werden. Wachstum des Parasiten innerhalb der Erythrozyten sind direkt verantwortlich für die klinischen Symptome im Zusammenhang mit Malaria-2.
Bis vor kurzem war die Herstellung von transgenen p. Falciparum ein langwieriger Prozess, an denen mehrere Runden der Droge-Auswahl, das dauerte viele Monate und hatte eine hohe Ausfallrate. Diese zeitraubende Prozedur Relieson bricht die Generierung von zufälligen DNA in der Region von Interesse und die endogene Fähigkeit des Parasiten zu Flicken sein Genom aber Homologen Reparatur3,4,5,6 . Vor kurzem hat die gruppierten regelmäßig dazwischen palindromische Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) Genom-Bearbeitung erfolgreich in p. Falciparum7,8verwendet worden. Die Einführung dieser neuen Technologie in der Malaria-Forschung hat für die Förderung von Verständnis für die Biologie dieser tödlichen Parasiten Plasmodium kritisiert. CRISPR/Cas9 ermöglicht eine spezifische Ausrichtung der Gene durch Guide RNAs (gRNAs), die Homolog zu gen von Interesse sind. Die gRNA/Cas9-Komplex erkennt das Gen durch die gRNA und Cas9 führt dann eine Doppel-Strang Pause zwingen die Einleitung von Reparaturmechanismen in den Organismus9,10. Da p. Falciparum Maschinen zur Reparatur von DNA-Brüchen durch nicht-homologe Ende Beitritt fehlt, es homologe Rekombination Mechanismen nutzt und integriert transfizierten homologe DNA-Templates um die Cas9/gRNA-induzierte reparieren Doppel-Strang Pause11,12.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Generation der bedingten Knockdown Mutanten in p. Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden. Das Protokoll veranschaulicht Verwendung der quantifizierten Ribozym, bedingt Knockdown proteingehalte der PfHsp70x (PF3D7_0831700), ein Chaperon exportiert durch p. Falciparum in Host RBCs13,14. Die quantifizierten Ribozym wird durch Behandlung mit Glucosamin (die zu Glucosamin-6-Phosphat in den Zellen umgewandelt wird) um seine zugehörige mRNA, führt zu einem Rückgang der Protein-14Spalten aktiviert. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere bedingte Knockdown Tools, z. B. Destabilisierung Domänen oder RNA aptameren4,5,15nutzen zu können. Unsere Protokolldetails sind die Generation der ein Reparatur-Plasmid, bestehend aus einem Hämagglutinin (HA) Tag und quantifizierten Ribozym Codierung Sequenz flankiert von Sequenzen, die Homolog zu PfHsp70x offenen Leserahmen (ORF) und 3'-UTR. Wir beschreiben auch die Generation der zweite Plasmid zu Laufwerk Ausdruck der gRNA. Diese zwei Plasmide, zusammen mit einem Dritten, der Ausdruck der Cas9, treibt in Erythrozyten transfiziert und verwendet, um das Genom von p. Falciparum Parasiten ändern. Schließlich beschreiben wir eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Technik, um die Integration der Tags und quantifizierten Ribozym überprüfen. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig für die Änderung oder die komplette ko von keine p. Falciparum Gene, Verbesserung unserer Fähigkeit, neue Einblicke in die Biologie des Malaria-Parasiten zu generieren.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Xcell Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>Wir kaufen diejenigen, die einzeln verpackt sind</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>Geschenk von Akhil Vaidya Labor</td><td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>TPP Gewebekultur 6 Well Platten</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>TPP 100 mm Gewebekulturschalen (12 mL Platte)</td><td>MIDSCI</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>TPP Gewebekultur 96 Well Platten</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>TPP Gewebekultur 24 Well Platten</td><td>MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0157L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td>#R3131L</tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Steritop Flaschenaufsatz-Filtereinheit</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td>Sie können jede Größe verwenden, die Ihren Anforderungen entspricht</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>pMK-U6</td><td>Erzeugt durch das Muralidharan Lab</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pHA-glmS</td><td>Erzeugt durch das Muralidharan Lab</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pUF1-Cas9</td><td>Geschenk aus dem Jose-Juan Lopez-Rubio Labor</td><td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin-Reagenz</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Thymidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr><td>PL6-eGFP BSD,</td><td>erzeugt durch das Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puf1-Cas9 eGFP gRNA</td>, <td>erzeugt durch das Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel und PCR-Aufreinigung</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td></tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N / A</td><td>Sie werden ein paar Chargen ausprobieren wollen, um herauszufinden, was die Parasiten am besten wachsen</td></tr><tr><td>Human Red Blood Cells</td><td>Interstate Blood Bank, Inc</td><td>E-Mail oder rufen Sie sie direkt an, um zu bestellen</td><td>Wir verwenden normalerweise O + Blut</td></tr><tr><td>3D7 Parasitenlinie</td><td>Erhältlich auf Anfrage</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>Sie können Ihre eigenen herstellen, es ist nicht notwendig, genau dieses</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>zu verwenden Wir stellen eine 1000X Aktie bei 100mg/ml in Wasser her und lagern in der -20C</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EF1alpha</td><td>Dr. Daniel Goldberg's Lab</td><td>Washington University in St. Louis</td><td>Sie können Ihre bevorzugte Ladesteuerung für Western Blots verwenden. Dies ist nur das, was wir in unserem Labor verwenden</td></tr><tr><td>Ratte Anti-HA Klon 3F10, monoklonal</td><td>Hergestellt von Roche, verkauft von Sigma</td><td>11867423001</td><td>Sie können Ihren bevorzugten Anti-HA-Antikörper</td></tr><tr><td>verwenden 0,6 mL Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Fisher HealthCare* PROTOKOLL* Hema 3* Manuelles Färbesystem (Fixativ + Lösung I und II)</td><td>Fisher</td><td>22-122-911</td><td>Sie können auch Giemsa-Färbung verwenden</td></tr><tr><td>Fisherfines Premium mattierte Objektträger - Größe: 3 x 1 Zoll</td><td>Fischer</td><td>12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 gen bearbeitung zu machen bedingte mutanten der menschlichen malaria-parasiten p. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria ist eine wesentliche Ursache für Morbidität und Mortalität weltweit. Diese Krankheit, die vor allem in tropischen und subtropischen Regionen lebenden Menschen beeinflusst, verursacht durch Infektion mit Plasmodium -Parasiten. Die Entwicklung wirksamer Medikamente zur Bekämpfung der Malaria kann durch ein besseres Verständnis der Biologie dieser komplexen Parasiten beschleunigt werden. Genetische Manipulation dieser Parasiten ist der Schlüssel zum Verständnis ihrer Biologie; Allerdings ist historisch das Genom von p. Falciparum schwierig zu handhaben gewesen. Vor kurzem wurde CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung im Malaria-Parasiten, zulassend einfacher Protein tagging, Erzeugung von bedingten Protein Niederschlägen und Löschung von Genen genutzt. CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung erweist sich ein mächtiges Werkzeug für die Förderung der Malaria-Forschung. Hier beschreiben wir eine CRISPR/Cas9 Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in p. Falciparum. Diese Methode ist sehr anpassungsfähig an andere Arten von genetischen Manipulationen, einschließlich Protein-tagging und gen Knockouts.

Eine schematische Darstellung der Plasmide verwendet diese Methode als auch ein Beispiel für ein Schild-Mutation sind in Abbildung 1dargestellt. Als ein Beispiel dafür, wie mutierte Parasiten nach Transfektion identifizieren sind Ergebnisse von PCRs zur Integration desquantifizierten Konstrukts HA - Überprüfung in Abbildung 2dargestellt. Ein repräsentatives Bild einer Klonen Platte ist in Abbildung 3...

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in Plasmodium Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden.

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Biologie des menschlichen Malariaparasiten P.Falciparum zu beantworten, indem sie hilft, die Proteinfunktion durch bedingten Knockdown aufzudecken. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine relativ einfache Erzeugung von bedingten Mutanten im Vergleich zu früheren Methoden ermöglicht. Um zu beginnen, gehen Sie zu Chop Chop und wählen Sie Fasta Target'Under Target, fügen Sie die 200 Basenpaare aus dem drei Primende des offenen Leserahmens eines Gens und 200 Basenpaare vom Beginn der drei wichtigsten UTR des Gens ein.Klicken Sie unter In'select P.Falciparum'and select CRISPR/Cas9'under Using'Next auf Zielsites suchen'Wählen Sie eine gRNA-Sequenz aus den vorgestellten Optionen aus, wobei die effizienteste gRNA bevorzugt wird, die dem Ort der Änderung am nächsten ist und die wenigsten Off-Target-Sites hat. Kaufen Sie die gRNA-Sequenz und ihre umgekehrte Komplement als Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gereinigte Oligos. Die gRNA-Sequenz, die als Ziel für PfH-sp70x verwendet wird, finden Sie im Textprotokoll.Fügen Sie jeweils 40 Mikrogramm pMK-U6, pUF1-Cas9 und pHA-glmS DNA in ein steriles 1,5-Millimeter-Zentrifugenrohr ein. Füge

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Details werden dargelegt, wie die QTL-Kartierung mit einer genomalen Genomsequenz auf genetischer Weise zur Identifizierung eines Arzneimittelresistenzgens in Toxoplasma gondii verwendet werden kann und wie dies mit dem CRISPR / Cas9-System verifiziert werden kann, das ein genomisches Ziel effizient bearbeitet, in diesem Fall die Arzneimittelresistenzgen...

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Einführung eines Genknockouts in den extrazellulären Amastigot von Trypanosoma cruzi, mit dem CRISPR/Cas9-System. Dem Wachstumsphänotyp kann entweder durch Zellzählung der axtischen Amastigotenkultur oder durch Proliferation intrazellulärer Amastigoten nach der Invasion der Wirtszelle gefolgt werden.

Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von Trypanosoma cruzi mit dem CRISPR/Cas9-System

CRISPR/Cas9 wird zunehmend zur Charakterisierung der Genfunktion in Nicht-Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Knock-out-Linien von Culex pipienserzeugt, von der Vorbereitung von Injektionsmischungen über die Gewinnung und Injektion von Moskitoembryonen bis hin zur Aufzucht, Kreuzung und dem Screening injizierter Moskitos und ihrer Nachkommen auf gewünschte Mutationen.

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.

Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Das Protokoll beschreibt, wie mit dem φC31-System ortsgerichtete Modifikationen im Genom von Anopheles-Malariamücken erreicht werden können. Zu den beschriebenen Modifikationen gehören sowohl die Integration als auch der Austausch transgener Kassetten im Genom von attP-tragenden Andockleitungen.

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Indeln, die durch CRISPR/Cas9 induziert werden, und zur Auswahl von Mutantenlinien in der Mücke Aedes aegypti unter Verwendung einer hochauflösenden Schmelzanalyse.

Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine effiziente Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Beschränkung durchgeführt werden kann, um ein präzises Zebrafisch-Krankheitsmodell mit zSpRY-ABE8e zu konstruieren.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

Die chemische Genetik beinhaltet die Substitution eines Gatekeeper-Rests durch eine Aminosäure, die eine andere Seitenkette am Zielort enthält. In dieser Arbeit haben wir einen mutierten Parasiten generiert, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, und kompensatorische Signalwege identifiziert, die der Parasit im mutierten Hintergrund einnimmt.

Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Genom-Editierung durch embryonale Mikroinjektion in der Mücke A. aegypti unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie.

Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

Erfahren Sie die CRISPR/Cas9-Genomeditierung zur Erzeugung bedingter glmS-Knockdown-Mutanten in Plasmodium falciparum. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinfunktionen beim menschlichen Malaria-Parasiten.

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

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