Name: CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Erfahren Sie die CRISPR/Cas9-Genomeditierung zur Erzeugung bedingter glmS-Knockdown-Mutanten in Plasmodium falciparum. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinfunktionen beim menschlichen Malaria-Parasiten.

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Wir danken Muthugapatti Kandasamy Herzstück der University of Georgia (UGA) biomedizinischen Mikroskopie für technische Hilfe und Jose Juan Lopez-Rubio für den Austausch der pUF1-Cas9 und pL6 Plasmide. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Bögen Foundation Awards, D.W.C. und H.M.K., UGA Start Mittel caracterización, Zuschüsse aus der March of Dimes Foundation (Basil O'Connor Starter Gelehrter Forschungspreis) gegangen und US National Institutes of Health gewährt (R00AI099156 und R01AI130139), caracterización und (T32AI060546), H.M.K.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Malaria+Report%22">World Malaria Report</a>. , World Health Organization. Geneva. (2017).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li>
<li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li>
<li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310(2012).</li>
<li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+the+USA%22%5BJournal%5D)">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li>
<li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li>
<li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li>
<li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li>
<li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li>
<li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li>
<li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783(2013).</li>
<li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727(2016).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
<li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li>
<li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li>
<li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li>
<li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients%2C+grow+and+replicate%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Resesarch%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li>
<li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuPaGDT%3A+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Genomes%22%5BJournal%5D)">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033(2015).</li>
<li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR%2FCAS9%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li>
<li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270(2018).</li>
<li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li>
<li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li>
<li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li>
<li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li>
<li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li>
<li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li>
<li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-free+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Umsetzung der CRISPR/Cas9 in p. Falciparum hat sowohl erhöht die Effizienz und verringert den Zeitaufwand für die Änderung der Parasit Genom, im Vergleich zu bisherigen Methoden der genetischen Manipulation. Dieses umfassende Protokoll beschreibt die Schritte, die notwendig für die Erzeugung von bedingten Mutanten mit CRISPR/Cas9 in p. Falciparum. Während die Methode hier speziell für die Generation von HA -quantifizierten Mutanten ausgerichtet ist, kann diese Strategie für eine Vielzahl vo...

Malaria ist eine verheerende Krankheit verursacht durch Protozoen Parasiten der Gattung Plasmodium. P. Falciparum, der meisten tödlichen menschlichen Malaria-Parasiten verursacht rund 445.000 Todesfälle pro Jahr, meist bei Kindern unter dem Alter von fünf1. Plasmodium -Parasiten haben einen komplizierten Lebenszyklus mit einem Moskito Vektor und ein Wirbeltier Host. Menschen infizieren sich zunächst eine infizierte Mücke eine Blutmahlzeit nimmt. Dann der Parasit dringt in die Leber, wo es wächst, entwickelt sich und teilt für etwa eine Woche. Nach diesem Vorgang sind die Parasiten in den Blutkreislauf freigesetzt, wo sie asexuelle Reproduktion in roten Blutkörperchen (Erythrozyten) unterzogen werden. Wachstum des Parasiten innerhalb der Erythrozyten sind direkt verantwortlich für die klinischen Symptome im Zusammenhang mit Malaria-2.
Bis vor kurzem war die Herstellung von transgenen p. Falciparum ein langwieriger Prozess, an denen mehrere Runden der Droge-Auswahl, das dauerte viele Monate und hatte eine hohe Ausfallrate. Diese zeitraubende Prozedur Relieson bricht die Generierung von zufälligen DNA in der Region von Interesse und die endogene Fähigkeit des Parasiten zu Flicken sein Genom aber Homologen Reparatur3,4,5,6 . Vor kurzem hat die gruppierten regelmäßig dazwischen palindromische Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) Genom-Bearbeitung erfolgreich in p. Falciparum7,8verwendet worden. Die Einführung dieser neuen Technologie in der Malaria-Forschung hat für die Förderung von Verständnis für die Biologie dieser tödlichen Parasiten Plasmodium kritisiert. CRISPR/Cas9 ermöglicht eine spezifische Ausrichtung der Gene durch Guide RNAs (gRNAs), die Homolog zu gen von Interesse sind. Die gRNA/Cas9-Komplex erkennt das Gen durch die gRNA und Cas9 führt dann eine Doppel-Strang Pause zwingen die Einleitung von Reparaturmechanismen in den Organismus9,10. Da p. Falciparum Maschinen zur Reparatur von DNA-Brüchen durch nicht-homologe Ende Beitritt fehlt, es homologe Rekombination Mechanismen nutzt und integriert transfizierten homologe DNA-Templates um die Cas9/gRNA-induzierte reparieren Doppel-Strang Pause11,12.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Generation der bedingten Knockdown Mutanten in p. Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden. Das Protokoll veranschaulicht Verwendung der quantifizierten Ribozym, bedingt Knockdown proteingehalte der PfHsp70x (PF3D7_0831700), ein Chaperon exportiert durch p. Falciparum in Host RBCs13,14. Die quantifizierten Ribozym wird durch Behandlung mit Glucosamin (die zu Glucosamin-6-Phosphat in den Zellen umgewandelt wird) um seine zugehörige mRNA, führt zu einem Rückgang der Protein-14Spalten aktiviert. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere bedingte Knockdown Tools, z. B. Destabilisierung Domänen oder RNA aptameren4,5,15nutzen zu können. Unsere Protokolldetails sind die Generation der ein Reparatur-Plasmid, bestehend aus einem Hämagglutinin (HA) Tag und quantifizierten Ribozym Codierung Sequenz flankiert von Sequenzen, die Homolog zu PfHsp70x offenen Leserahmen (ORF) und 3'-UTR. Wir beschreiben auch die Generation der zweite Plasmid zu Laufwerk Ausdruck der gRNA. Diese zwei Plasmide, zusammen mit einem Dritten, der Ausdruck der Cas9, treibt in Erythrozyten transfiziert und verwendet, um das Genom von p. Falciparum Parasiten ändern. Schließlich beschreiben wir eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Technik, um die Integration der Tags und quantifizierten Ribozym überprüfen. Dieses Protokoll ist sehr anpassungsfähig für die Änderung oder die komplette ko von keine p. Falciparum Gene, Verbesserung unserer Fähigkeit, neue Einblicke in die Biologie des Malaria-Parasiten zu generieren.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Xcell Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Elektroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>Wir kaufen diejenigen, die einzeln verpackt sind</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>Geschenk von Akhil Vaidya Labor</td><td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>TPP Gewebekultur 6 Well Platten</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>TPP 100 mm Gewebekulturschalen (12 mL Platte)</td><td>MIDSCI</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>TPP Gewebekultur 96 Well Platten</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>TPP Gewebekultur 24 Well Platten</td><td>MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0157L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td></td>#R3131L</tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Steritop Flaschenaufsatz-Filtereinheit</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td>Sie können jede Größe verwenden, die Ihren Anforderungen entspricht</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>pMK-U6</td><td>Erzeugt durch das Muralidharan Lab</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pHA-glmS</td><td>Erzeugt durch das Muralidharan Lab</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pUF1-Cas9</td><td>Geschenk aus dem Jose-Juan Lopez-Rubio Labor</td><td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin-Reagenz</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Thymidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr><td>PL6-eGFP BSD,</td><td>erzeugt durch das Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puf1-Cas9 eGFP gRNA</td>, <td>erzeugt durch das Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel und PCR-Aufreinigung</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td></tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N / A</td><td>Sie werden ein paar Chargen ausprobieren wollen, um herauszufinden, was die Parasiten am besten wachsen</td></tr><tr><td>Human Red Blood Cells</td><td>Interstate Blood Bank, Inc</td><td>E-Mail oder rufen Sie sie direkt an, um zu bestellen</td><td>Wir verwenden normalerweise O + Blut</td></tr><tr><td>3D7 Parasitenlinie</td><td>Erhältlich auf Anfrage</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>Sie können Ihre eigenen herstellen, es ist nicht notwendig, genau dieses</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>zu verwenden Wir stellen eine 1000X Aktie bei 100mg/ml in Wasser her und lagern in der -20C</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EF1alpha</td><td>Dr. Daniel Goldberg's Lab</td><td>Washington University in St. Louis</td><td>Sie können Ihre bevorzugte Ladesteuerung für Western Blots verwenden. Dies ist nur das, was wir in unserem Labor verwenden</td></tr><tr><td>Ratte Anti-HA Klon 3F10, monoklonal</td><td>Hergestellt von Roche, verkauft von Sigma</td><td>11867423001</td><td>Sie können Ihren bevorzugten Anti-HA-Antikörper</td></tr><tr><td>verwenden 0,6 mL Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Fisher HealthCare* PROTOKOLL* Hema 3* Manuelles Färbesystem (Fixativ + Lösung I und II)</td><td>Fisher</td><td>22-122-911</td><td>Sie können auch Giemsa-Färbung verwenden</td></tr><tr><td>Fisherfines Premium mattierte Objektträger - Größe: 3 x 1 Zoll</td><td>Fischer</td><td>12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 gen bearbeitung zu machen bedingte mutanten der menschlichen malaria-parasiten p. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria ist eine wesentliche Ursache für Morbidität und Mortalität weltweit. Diese Krankheit, die vor allem in tropischen und subtropischen Regionen lebenden Menschen beeinflusst, verursacht durch Infektion mit Plasmodium -Parasiten. Die Entwicklung wirksamer Medikamente zur Bekämpfung der Malaria kann durch ein besseres Verständnis der Biologie dieser komplexen Parasiten beschleunigt werden. Genetische Manipulation dieser Parasiten ist der Schlüssel zum Verständnis ihrer Biologie; Allerdings ist historisch das Genom von p. Falciparum schwierig zu handhaben gewesen. Vor kurzem wurde CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung im Malaria-Parasiten, zulassend einfacher Protein tagging, Erzeugung von bedingten Protein Niederschlägen und Löschung von Genen genutzt. CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung erweist sich ein mächtiges Werkzeug für die Förderung der Malaria-Forschung. Hier beschreiben wir eine CRISPR/Cas9 Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in p. Falciparum. Diese Methode ist sehr anpassungsfähig an andere Arten von genetischen Manipulationen, einschließlich Protein-tagging und gen Knockouts.

Eine schematische Darstellung der Plasmide verwendet diese Methode als auch ein Beispiel für ein Schild-Mutation sind in Abbildung 1dargestellt. Als ein Beispiel dafür, wie mutierte Parasiten nach Transfektion identifizieren sind Ergebnisse von PCRs zur Integration desquantifizierten Konstrukts HA - Überprüfung in Abbildung 2dargestellt. Ein repräsentatives Bild einer Klonen Platte ist in Abbildung 3...

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von quantifizierten-basierten bedingte Knockdown Mutanten in Plasmodium Falciparum CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung verwenden.

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Biologie des menschlichen Malariaparasiten P.Falciparum zu beantworten, indem sie hilft, die Proteinfunktion durch bedingten Knockdown aufzudecken. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine relativ einfache Erzeugung von bedingten Mutanten im Vergleich zu früheren Methoden ermöglicht. Um zu beginnen, gehen Sie zu Chop Chop und wählen Sie Fasta Target'Under Target, fügen Sie die 200 Basenpaare aus dem drei Primende des offenen Leserahmens eines Gens und 200 Basenpaare vom Beginn der drei wichtigsten UTR des Gens ein.Klicken Sie unter In'select P.Falciparum'and select CRISPR/Cas9'under Using'Next auf Zielsites suchen'Wählen Sie eine gRNA-Sequenz aus den vorgestellten Optionen aus, wobei die effizienteste gRNA bevorzugt wird, die dem Ort der Änderung am nächsten ist und die wenigsten Off-Target-Sites hat. Kaufen Sie die gRNA-Sequenz und ihre umgekehrte Komplement als Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese gereinigte Oligos. Die gRNA-Sequenz, die als Ziel für PfH-sp70x verwendet wird, finden Sie im Textprotokoll.Fügen Sie jeweils 40 Mikrogramm pMK-U6, pUF1-Cas9 und pHA-glmS DNA in ein steriles 1,5-Millimeter-Zentrifugenrohr ein. Fügen Sie ein Zehntel des VOLUMENs der DNA von drei molarem Natriumacetat in Wasser in die Röhre und mischen Sie es gut mit einem Wirbel. Dann fügen Sie das 2,5-fache des Volumens von 100 Prozent Ethanol in die Röhre und mischen Sie es gut mit einem Wirbel für mindestens 30 Sekunden.Legen Sie die Röhre auf Eis oder bei minus 20 Grad Celsius für 30 Minuten. Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei 18, 300 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig aus dem Rohr entfernen, ohne das Pellet zu stören.Fügen Sie das Dreifache des Volumens von 70 Prozent Ethanol in die Röhre und mischen Sie es kurz mit einem Wirbel. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 18, 300 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand erneut vorsichtig aus dem Rohr, ohne das Pellet zu stören.Lassen Sie das Rohr offen und lassen Sie das Pellet für 15 Minuten trocknen. Bewahren Sie die gefällte DNA bei minus 20 Grad Celsius auf, bis sie für die Transfektion benötigt wird. Um RBCs zu transfezieren, bereiten Sie 1X Cytomix-Puffer sowie unvollständiges und vollständiges RPMI vor, wie im Textprotokoll beschrieben.Filter sterilisieren den Puffer mit einem 0,22-Mikron-Filter. Fügen Sie 380 Mikroliter des 1X Zytomixes in die DNA und Wirbel, um sich aufzulösen. Lassen Sie die DNA im 1X Cytomix für 10 Minuten auflösen, wirbeln alle drei Minuten für 10 Sekunden.In einem sterilen, 15 Milliliter konischen Rohr, kombinieren 300 Mikroliter isolierter menschlicher RBCs im unvollständigen RPMI mit vier Millilitern 1X Cytomix. Zentrifugieren Sie die RBCs bei 870 mal G für drei Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand aus dem RBC-Pellet.Das RBC-Pellet mit dem DNA-Cytomix-Gemisch wieder aufhängen und auf eine 0,2 Zentimeter elektroporationküpation. Bewerten Sie die RBCs anhand der im Textprotokoll aufgeführten Bedingungen. Übertragen Sie den Inhalt nach der Elektroporation von der Küvette auf ein 15 Milliliter konisches Rohr mit fünf Millilitern komplettem RPMI.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 870 mal G für drei Minuten bei 20 Grad Celsius. Dann dekant den Überstand. Nun, setzen Sie das Pellet in vier Milliliter nbiss kompletten RPMI wieder auf und übertragen Sie es auf einen Brunnen in einer Sechs-Brunnen-Gewebekulturplatte.Fügen Sie 400 Mikroliter einer hochschizont Kultur zu den übertragenen RBCs. Halten Sie alle Kulturen bei 37 Grad Celsius unter drei Prozent Sauerstoff, drei Prozent CO2 und 94 Prozent Stickstoff. Am nächsten Tag waschen Sie die Kultur mit vier Millilitern kompletten RPMI.Zentrifugieren Sie die Kultur bei 870 mal G für drei Minuten. Aspirieren Sie den Überstand. Setzen Sie die Kultur in vier Millilitern des vollständigen RPMI wieder aus.48 Stunden später, waschen Sie die Kultur mit vier Milliliter n. Chr. Setzen Sie dann die Kultur in vollständigem RPMI, das ein Mikromolar DSM1 enthält, erneut aus, um für das Cas9-Plasmid auszuwählen. Ersetzen Sie danach das Kulturmedium alle 48 Stunden durch ein komplettes RPMI plus ein Mikromolar DSM1.Waschen Sie die Kulturen jeden Tag mit komplettem RPMI, bis Parasiten nicht mehr durch Blutabstrich eimpern sichtbar sind. Um einen Blutabstrich zu machen, Pipette 150 Mikroliter Kultur in eine 0,6 Milliliter Zentrifugenröhre. Nachdem Sie die Zellen 30 Sekunden lang durch Zentrifugieren bei 1, 700 mal G pelletiert haben, den Überstand absaugen.Verwenden Sie eine Pipette, um die pelletierten Zellen auf eine Glasrutsche zu übertragen. Mit einer zweiten Glasrutsche in einem 45-Grad-Winkel zur ersten Rutsche, schmieren Sie das Bluttröpfchen. Färben Sie die Folie mit einem handelsüblichen Färbeset nach dem Herstellerprotokoll.Sehen Sie sich die Parasiten mit dem 100-fachen Öl-Immersion-Objektiv an. Ab fünf Tagen nach der Transfektion, entfernen Sie zwei Milliliter der Kultur mit RBCs wieder im Kulturmedium ausgesetzt. Fügen Sie zwei Milliliter frisches Medium und Blut bei zwei Prozent Hämatokrit hinzu.Fügen Sie frisches Blut auf diese Weise einmal pro Woche, bis Parasit wieder auftauchen, wie durch dünne Blutabstrich bestimmt. Führen Sie serielle Verdünnungen der Parasitenkultur durch, um eine endgültige Konzentration von 0,5 Parasiten pro 200 Mikroliter zu erreichen. Fügen Sie 200 Mikroliter der verdünnten Kultur in die Brunnen einer 96-Well-Gewebekulturplatte.Bewahren Sie die Klonplatte auf, bis Parasiten in den Brunnen nachweisbar sind. Alle 48 Stunden das Medium in der 96-Well-Platte durch frisches Medium ersetzen. Einmal pro Woche, beginnend fünf Tage nach Beginn der Klonplatte, entfernen Sie 100 Mikroliter aus jedem Brunnen und fügen Sie 100 Mikroliter frisches Medium plus Blut hinzu.Um parasitenhaltige Brunnen zu identifizieren, legen Sie die 96-Well-Platte etwa 20 Minuten lang in einem 45-Grad-Winkel, damit sich das Blut in einem Winkel innerhalb der Platte absetzen kann. Dann legen Sie die 96-Well-Platte auf einen Leuchtkasten. Beachten Sie, dass die Brunnen, die Parasiten enthalten, Medien enthalten, die gelb sind, im Vergleich zu den rosa Medien von parasitenfreien Brunnen, aufgrund der Versauerung des Mediums durch die Parasiten.Mit einer serologischen Pipette bewegen Sie den Inhalt der parasitenhaltigen Brunnen auf eine 24-Well-Gewebekulturplatte, um eine Ausdehnung der Parasitenzulage zu ermöglichen. Überprüfen Sie mithilfe der PCR-Analyse diese klonalen Parasitenlinien auf eine korrekte Integration. Die Ergebnisse eines Immunfluoreszenz-Assays werden hier gezeigt, was die erfolgreiche HA-Kennzeichnung von PfH-sp70x zeigt.PfH-sp70x glmS Parasiten wurden fixiert und mit DAPI als Kernmarker sowie Antikörpern gegen HA gefärbt. Membranassoziiertes Histidin reiches Protein eins, ein Marker des Proteinexports zum Wirt RBC. Eine Western Blot-Analyse des PfH-sp70x-Proteinspiegels nach der Behandlung mit Glucosamin wird hier gezeigt. Wie erwartet sinkt der Proteinspiegel während der Behandlungsdauer.Diese Technik ebnet forschern auf dem Gebiet der Parasitologie den Weg, grundlegende Fragen in der Biologie des Malariaparasiten zu untersuchen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass P.Falciparum ein blutübertragener Erreger ist und geeignete persönliche Schutzausrüstung während der Durchführung dieses Verfahrens getragen werden sollte.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Details werden dargelegt, wie die QTL-Kartierung mit einer genomalen Genomsequenz auf genetischer Weise zur Identifizierung eines Arzneimittelresistenzgens in Toxoplasma gondii verwendet werden kann und wie dies mit dem CRISPR / Cas9-System verifiziert werden kann, das ein genomisches Ziel effizient bearbeitet, in diesem Fall die Arzneimittelresistenzgen...

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Gezielte gen bearbeiten CRISPR/Cas9 hat das Verständnis der biologischen Funktionen der Gene erheblich erleichtert. Hier nutzen wir die CRISPR/Cas9-Methodik zu Modell Calreticulin Mutationen in hämatopoetischen Zellen Zytokin-abhängige um ihre onkogenen Aktivität zu studieren.

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Einführung eines Genknockouts in den extrazellulären Amastigot von Trypanosoma cruzi, mit dem CRISPR/Cas9-System. Dem Wachstumsphänotyp kann entweder durch Zellzählung der axtischen Amastigotenkultur oder durch Proliferation intrazellulärer Amastigoten nach der Invasion der Wirtszelle gefolgt werden.

Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von Trypanosoma cruzi mit dem CRISPR/Cas9-System

CRISPR/Cas9 wird zunehmend zur Charakterisierung der Genfunktion in Nicht-Modellorganismen eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt, wie Man Knock-out-Linien von Culex pipienserzeugt, von der Vorbereitung von Injektionsmischungen über die Gewinnung und Injektion von Moskitoembryonen bis hin zur Aufzucht, Kreuzung und dem Screening injizierter Moskitos und ihrer Nachkommen auf gewünschte Mutationen.

Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Moskitos zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.

Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Das Protokoll beschreibt, wie mit dem φC31-System ortsgerichtete Modifikationen im Genom von Anopheles-Malariamücken erreicht werden können. Zu den beschriebenen Modifikationen gehören sowohl die Integration als auch der Austausch transgener Kassetten im Genom von attP-tragenden Andockleitungen.

Ortsgerichtete φC31-vermittelte Integration und Kassettenaustausch in Anopheles-Vektoren der Malaria

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Indeln, die durch CRISPR/Cas9 induziert werden, und zur Auswahl von Mutantenlinien in der Mücke Aedes aegypti unter Verwendung einer hochauflösenden Schmelzanalyse.

Indel-Nachweis nach CRISPR/Cas9-Mutagenese mittels hochauflösender Schmelzeanalyse in der Mücke Aedes aegypti

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine effiziente Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Beschränkung durchgeführt werden kann, um ein präzises Zebrafisch-Krankheitsmodell mit zSpRY-ABE8e zu konstruieren.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

Die chemische Genetik beinhaltet die Substitution eines Gatekeeper-Rests durch eine Aminosäure, die eine andere Seitenkette am Zielort enthält. In dieser Arbeit haben wir einen mutierten Parasiten generiert, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, und kompensatorische Signalwege identifiziert, die der Parasit im mutierten Hintergrund einnimmt.

Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Genom-Editierung durch embryonale Mikroinjektion in der Mücke A. aegypti unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie.

Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

Erfahren Sie die CRISPR/Cas9-Genomeditierung zur Erzeugung bedingter glmS-Knockdown-Mutanten in Plasmodium falciparum. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinfunktionen beim menschlichen Malaria-Parasiten.

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

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