Analyse der AtHIRD11 inneren Unordnung und Bindung in Richtung Metallionen durch Kapillare Gelelektrophorese und Affinität Kapillarelektrophorese

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in Bezug auf die Tektonik von intrinsischen Unordnungsproteinen zu beantworten, wie z.B. Konformationsänderungen aufgrund von Metall-Eisen-Bindungen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sehr wenig Ausrüstung erfordert und die Ergebnisse sehr schnell erzielt werden können. Das Verfahren wird von Matthias Stein, einem Doktoranden aus meinem Labor, vorgeführt.

Schneiden Sie zunächst mit einem Glasschneider auf einer Glasplatte eine blanke Quarzglaskapillare mit einer Polyamid-Außenbeschichtung und einem Innendurchmesser von 50 Mikrometern in Längen von 33 und 30 Zentimetern. Markieren Sie mit einem Stift die Mitte eines einen Zentimeter breiten Nachweisfensters in einem Abstand von 24,5 Zentimetern von einem Ende der Kapillare für das CGE-Experiment und in einem Abstand von 21,5 Zentimetern von einem Ende der Kapillare für das ACE-Experiment. Brennen Sie die Polyamid-Außenbeschichtung mit einer Lötlampe 0,5 Zentimeter vor und nach jeder Markierung ab.

Verwenden Sie auf ähnliche Weise die Lötlampe, um einen Zentimeter der Beschichtung an beiden Enden der Kapillaren zu entfernen. Verwenden Sie dann Ethanol und ein weiches Tuch, um die Enden der Kapillaren und die Nachweisfenster zu reinigen. Installieren Sie eine Kapillare in das CE-System, wobei sich das Erfassungsfenster in der Nähe des Auslasses befindet.

Nach der Herstellung von Lösungen gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie 250 mikromolare Calciumchloridlösung, um eine 10-Milliliter-Spritze zu füllen. Befestigen Sie dann einen 0,2-Mikron-PVDF-Filter an der Spritze und drücken Sie 2 Milliliter der Lösung durch den Filter, um sie zu entsorgen. Verwenden Sie das restliche Calciumchlorid in der Spritze, um 10 Durchstechflaschen bis zum maximal zulässigen Volumen zu füllen.

Beschriften Sie jede Durchstechflasche als Einlassfläschchen mit 250 mikromolaren Calciumchlorid-Lösungen. Füllen Sie anschließend mit der Calciumchloridlösung 10 Durchstechflaschen zur Hälfte. Markieren Sie jedes Fläschchen als 250 mikromolare Durchstechflasche mit Calciumchloridlösung.

Füllen Sie dann die Durchstechflaschen mit anderen metallsalzhaltigen Lösungen auf ähnliche Weise. Verwenden Sie außerdem für jedes Paar Einlass- und Auslassfläschchen 30 mikromolare Tris-Puffer, um einen ähnlichen Satz Einlass- und Auslassfläschchen vorzubereiten. Füllen Sie mit 60 mikromolaren Acetanilid-EOF-Markern 10 Fläschchen.

Verwenden Sie dann die Probenlösung von einem Milligramm pro Milliliter, um ein Fläschchen zu füllen. Nach der Vorbereitung der Analyse gemäß dem Textprotokoll wird die Trennung durchgeführt, indem die Probenlösung für die CGE-Experimente hydrodynamisch injiziert und vier Minuten lang 0,1 bar am Einlass angewendet wird. Wenden Sie dann 25 Minuten lang negative 16,5 Kilovolt und einen Druck von 2,0 bar an beiden Enden der Kapillare an.

Nachdem Sie die Methode für die Messungen ohne Liganden vorbereitet haben, bereiten Sie die Methode für die Messungen mit Liganden vor, indem Sie zuerst die Kapillare mit 0,1 molaren EDTA-Lösung 1 Minute lang bei 2,5 bar spülen. Verwenden Sie dann deionisiertes Wasser, um die Kapillare zu spülen. Als nächstes äquilibrieren Sie die Kapillare, indem Sie sie mit Ligandenlösung 1,5 Minuten lang bei 2,5 bar spülen.

Injizieren Sie dann die Acetanilidlösung 6 Sekunden lang bei 0,05 bar und wechseln Sie die Einlass- und Auslassfläschchen gegen die Liganden, die Pufferfläschchen enthalten. Tragen Sie 0,05 bar für 2,4 Sekunden auf, um die Acetanilidlösung von der Spitze der Kapillare weiter nach innen zu drücken. Wenden Sie 10,0 Kilovolt für 6 Minuten an und detektieren Sie den Acetanilid-Peak des Assets bei einer Wellenlänge von 200 Nanometern.

Nachdem Sie die Kapillare wie zuvor mit deionisiertem EDTA-Wasser und der Ligandenlösung gespült haben, injizieren Sie die Proteinprobe und tauschen Sie die Einlass- und Auslassfläschchen gegen frische ligandenhaltige Pufferfläschchen aus. Wiederholen Sie alternativ die Messungen mit und ohne Liganden. Wiederholen Sie dann die Methode mit den Erdalkali-Ligandenlösungen.

Verwenden Sie abschließend die folgenden Lösungen, um die gleiche Methode durchzuführen. Berechnen Sie dann die Änderung der Ladungsgrößenverhältnisse für die verschiedenen Protein-Metallionen-Wechselwirkungen. Hier ist das Elektropherogramm für die AtHIRD11-Probe zu sehen, das während der CGE-Experimente gewonnen wurde.

Die Peptidgröße nimmt von links nach rechts zu. Peak Nummer vier hat die größte Masse und zeigt das intakte Protein an. Die kleineren Peaks, zwei und drei, stellen kleinere Verunreinigungen dar.

Diese Abbildung stellt das Elektropherogramm für Acetanilid während der ACE-Experimente dar. Die Acetanilidlösung weist nur einen hohen Peak auf, da sie keine Verunreinigungen aufweisen sollte. Die Detektionszeit für das Peakmaximum gibt die Migrationszeit der elektroosmotischen Strömung an und wird für die Berechnung der Wechselwirkung verwendet.

Dieses Elektropherogramm der AtHIRD11-Probe während des ACE-Experiments wurde in Abwesenheit von SDS und Metallionen durchgeführt. Neben den beiden Verunreinigungen aus dem CGE-Elektropherogramm sind mindestens fünf Peaks vorhanden, die mit dem Protein selbst in Verbindung stehen. Eine grafische Auswertung der gemessenen Migrationszeitverschiebungen in Gegenwart der verschiedenen Metallionen für den sechsten Peak ist hier dargestellt.

Er wird durch den berechneten Wert Delta R über RF dargestellt. Jedes Ergebnis gibt an, wie stark eine Verschiebung durch seinen Wert und sein Vorzeichen aufgetreten ist, was durch die Gesamtänderung der Ladung der Protein-Metallionen-Komplexe angezeigt wird. Sobald die Technik gemeistert ist, kann sie für einen Interaktionspartner in acht Stunden durchgeführt werden, einschließlich der CGE-Interaktion, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Proteinlösungen für Langzeitmessungen zu wechseln, da die Abbauprodukte im Laufe der Zeit zunehmen können, und die Tris-Pufferlösungen zu wechseln, um genauere Ergebnisse zu erhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Kapillare schneidet und reinigt, sowie eine Affinitätskapillarelektrophorese-Methode einrichten, um das Bindungsverhalten von intrinsisch ungeordneten Proteinen zu bewerten.