Name: Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Untersuchung der Zellregeneration mit Stentor coeruleus. Dieses Protokoll zeigt Kultivierung, Induktion durch Fragmentierung und mikroskopische Analyse einzelner Zellen.

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Diese Arbeit wurde von NIH Grant R01 GM113602 (WFM) und NSF 1144247 (AL) unterstützt. Wir erkennen, Mark Slabodnick und Natalie Kirkland für die Entwicklung von der ersten Versionen von einigen dieser Protokolle und für informative Gespräche. Wir danken Karina Perlaza und Greyson Lewis für kritische Lektüre des Manuskripts.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Kultivierung von Stentor präsentiert eine Reihe von Herausforderungen. Erstens, um Experimente durchzuführen, die eine große Anzahl von Zellen erfordern, braucht man weiterhin eine große Anzahl von Stentor Kulturen, wie Kulturen werden ungesund, wenn Stentor Konzentration 20 Zellen/mL übersteigt. Zweitens die Organismen, die Stentor Kulturen oft kontaminieren können schneller als Stentor teilen und überwältigen die Kultur (eine gemeinsame Verunreinigung ist Rädertierchen). Daher ist es notwendig, die Kultur unter dem Mikroskop in regelmäßigen Abständen zu überprüfen und die Verunreinigungen zu entfernen. Gelegentlich muss eine neue Kultur von einer kleinen Anzahl von Zellen manuell aus einem kontaminierten Kultur gerettet gestartet werden. Dadurch erhöht sich den Zeitaufwand für gesunde Stentor Kulturen pflegen. Drittens erfordert die Expansion einer einzelnen Zelle in eine 400 mL-Kultur mindestens einen Monat, weil Stentor Zellzyklus 3-5 Tage. Viertens: im Gegensatz zu anderen Modell Ciliaten, Stentor selten eingehen Zyste Form und sie können nicht eingefroren werden.
Ein wichtiger Aspekt der Kultivierung von Stentor ist die Auswahl eines geeigneten Nahrungsmittel Organismus. Verschiedene Methoden zur Kultivierung von Stentor wurden bisher beschrieben. Einer von ihnen schlägt, Magermilch, Kultur Bakterien verwenden, die dann Stentorfüttern. Diese Technik ist wirksam bei der Kultivierung von Stentor; Anwendung der genomischen Techniken erfordert jedoch reine Proben um Verwechslungen aus genomischer liest aus undefinierten Essen Organismen. Über das aktuelle Protokoll, Stentor in Masse angebaut werden können und weil ihre Nahrung, Chlamydomonas, sequenziert wurde, das Vorhandensein von genomischen Kontamination von Lebensmitteln Organismus erkannt und für gesteuert werden kann. Aus unbekannten Gründen musste Zahnstein ergänzen seine Vorräte durch Rücksendung, wo er Stentor vor gefunden. Mit dem aktuellen Protokoll konnten wir Stentor für Jahre zu halten.
Regeneration-Experimente mit Stentor sind im Allgemeinen einfach, aber es gibt ein paar wichtige Details im Auge zu behalten. In Bezug auf Abschnitt 2 Schneiden Stentor Zellen in zwei Hälften in Minuten gemeistert werden können. Mastering erweiterte Mikrochirurgie-Verfahren von Stentor erfordern eine Woche Praxis. Während Durchführung einer Saccharose oder Harnstoff-Behandlung (Abschnitt 3), wenn zu Beginn der Bildgebung die meisten Zellen noch ihre Membranellar Bands haben, erhöhen Inkubationszeit von 10-30 s für als Saccharose Behandlung als nächstes ausgeführt wird. Erhöhen Sie die Zeit der Saccharose Behandlung über 3 min Inkubation nicht, weil es in Zelltod führen wird.
Imaging von Stentor muss Regeneration Methoden große Zellen über lange Zeiträume hinweg. Das bildgebende Verfahren, die in Abschnitt 4 beschriebenen kann nur mit einem aufrechten Mikroskop verwendet werden. Wenn einem inversen Mikroskop stattdessen verfügbar ist, können Zellen auf eine Folie oder ein Deckglas in kleinen Kammern platziert werden. Eine Methode ist die Schaffung eine Kammer aus Vaseline und Abdeckung mit einem anderen deckgläschen um Verdunstung zu verhindern. Alternativ kann eine Kammer für eine einzelne Zelle durch ein Loch mit einem Locher der gewünschten Größe in einem 1 x 1 cm-2 Quadratmeter Silizium Spacer gemacht werden (Tabelle der Materialien), Platzierung des Abstandhalters auf einem deckgläschen, indem Zellen in der Kammer , und die Kammer mit einem anderen Deckglas abdecken. Beim abbilden, wenn Stentor nicht in der richtigen Ausrichtung, die charakteristischen Merkmale der einzelnen Phasen der Regeneration zu beobachten sind, tippen Sie auf die Platte fest um den Handy-Vertrag zu machen. Sehen Sie sich die Zelle erweitert werden, um die Phase der Regeneration zu identifizieren (Vollauszug dauert etwa 45 s). Wenn die Zelle immer noch in der falschen Ausrichtung ist, wiederholen Sie das klopfen. Die in Abbildung 1 und Abbildung 6 gezeigten Bilder wurden von einem Stereo-Zoom-Mikroskop aufgenommen; jedoch können alle Experimente, die detailliert mit einer 5 X Stereo-Mikroskop sezieren durchgeführt werden.
Eine weitere Herausforderung neben Kultivierung und imaging- Stentor ist das Tracking der Regeneration, insbesondere die Höhe der Zeit notwendig, um Phasen identifizieren. Wenn die regenerierenden Zellen perfekt ausgerichtet mit der Region der mündlichen Primordium deutlich sichtbar ist, dauert Identifikation der Stufe wenige Sekunden. Manchmal ist jedoch die Stentor -Zelle in eine Orientierung verhindern klare Zuweisung der Regeneration Stufe, damit mehr Zeit nehmen, zu identifizieren. Die erhebliche Menge an Zeit benötigt, um Bühne einzelne regenerierende Zellen, die Quantifizierung aller regenerierenden Zellen verzögern, damit Verringerung der zeitlichen Präzisions Inszenierung und erfordern den Betrachter zu warten und Re-Imaging auf die Zelle danach umgezogen eine neue Ausrichtung. Infolgedessen ist dieses Experiment Zeit- und arbeitsintensiv. Aus diesen Gründen wäre es sehr wünschenswert, automatisierte Methoden zur Erkennung von Stentor Zellen und Phasen der Regeneration im Videomikroskopie Daten zuordnen zu entwickeln. Diese würde auch mehr reproduzierbare Experimente ermöglichen erhöht die Größe der Stichprobe und die Beseitigung der menschlichen Neigung.
Die Entstehung von hochsensiblen Genomik und Proteomik Methoden hat damit begonnen, Studien einzelner Zellen in Reichweite zu stellen. Für solche einzelligen Analysen macht die riesige Größe einer Stentor Zelle es wünschenswert Testperson für Proof-of-Concept-Experimente. Für solche Experimente möglich Kultivierung Stentor ist von grundlegender Bedeutung, und so sollten die hier beschriebenen Methoden eine Rolle in der weiteren Entwicklung von fortgeschrittenen Techniken der einzelligen.

Zellen sind nicht einfache Taschen von Enzymen, sondern eher hochkomplexen Maschinen, deren Komponenten sind sorgfältig auf die richtige Größe skaliert und in klar definierten Positionen angeordnet. Die Morphogenese einzelner Zellen stellt ein Schlüsselprozess in Zell- und Entwicklungsbiologie, aber seine molekulare Mechanismus ist unbekannt1,2. Während einige kultivierten Zellen Blobs ähneln, können einzellige Organismen extrem Architekturen, veranschaulicht durch die komplexe kortikale Muster gesehen in Ciliaten3,4erschwert.
Vielleicht ist das extremste Beispiel einer hochstrukturierten Zelle Stentor Coeruleus, eine riesige Heterotrichous ciliate im Zusammenhang mit weitläufig Tetrahymena und Paramecium. Stentor ist 1 mm lang und ist mit mehr als 100 Längsstreifen der blaue Pigment abwechselnd mit Reihen von Zilien organisiert durch parallele Stapel von Mikrotubuli-Bänder, die die Länge der gesamten Zelle ausgeführt. Die Zelle ist (Abbildung 1), Trompetenförmige mit einer Membranellar-Band und eine mündliche Vorrichtung (OA) an seinem vorderen Ende und einem Holdfast, die das Substrat an seinem hinteren Ende die Zelle beimisst. Neben der klaren anterior-posterioren Polarität zeigt die Zelle auch eine unverwechselbare chiralen Musterung so dass Abstand zwischen ciliary Reihen allmählich steigt im Uhrzeigersinn. Dies führt zu einer Diskontinuität, wo die schmalste Zeile die breiteste Zeile und dieser Region von der Zelloberfläche erfüllt, bekannt als der Ort der Streifen Kontrast, kann induzieren die Bildung des zweiten Satzes der vorderen Ende Strukturen, wenn auf eine andere Zelle5, gepfropft so dass es formal gleichwertig Spemann Veranstalter. Somit haben alle wesentlichen Prozesse der Entwicklungsbiologie ihre Analoga in Stentor: Axiation, Musterbildung und Induktion. In einem Embryo diese Prozesse werden angetrieben durch Schicksal Unterschiede zwischen verschiedenen Zellen, sondern in Stentor, sie müssen durch Schicksal Unterschiede zwischen verschiedenen Regionen innerhalb einer einzelnen Zelle getrieben werden. Was die Unterschiede zwischen den Regionen innerhalb von Stentor definiert, ist ein Rätsel.
Wenn ein Teil des Stentor abgeschnitten wird, kann das fehlende Stück der Zelle regenerieren, um eine normale Zelle in einer Angelegenheit von Stunden zu liefern. Wenn eine Zelle halbieren oder sogar in viel kleinere Stücke schneiden jedes Stück in eine Normal aussehende, aber kleinere Zelle reorganisiert und stellt richtige Proportionalität zwischen Zelle Teile6,7. Auch winzige Fragmente, 1/64th die Größe der ursprünglichen Zelle, sind in der Lage, in eine kleine, aber normal proportionierten Zelle regenerieren und wachsen dann zu voller Größe6. Stentor stellt somit eine einzigartige Gelegenheit zu untersuchen die Mechanismen der Organelle Größe skalieren und Zelle wachstumsregulation mit chirurgischen Methoden, die in der Regel auf der Ebene der Gewebe oder ganze Organismen angewendet werden.
Eine der Eigenschaften von Stentor , die es ermöglicht, aus einer breiten Palette von chirurgischen Eingriffen zu regenerieren ist, dass es einen einzigen Kugelgrafit Macronucleus (Abbildung 1) mit ca. 50.000 Kopien des gesamten Genoms8enthält. Solange eine Zelle Fragment mindestens ein macronuclear Knoten enthält, hat es die Fähigkeit, vollständig zu regenerieren. Eine weitere Eigenschaft, die zugrunde liegenden StentorRegenerationsfähigkeit ist seine ungeheure Wundheilung Fähigkeit. Obwohl viele Zelltypen, die Heilung ihrer Wunden9sind, ist Stentor in der Lage, eine außergewöhnliche Auswahl an physischen Störungen beheben. Ein Beispiel für Stentor Erholung von eine drastische Störung, zusammen mit den Methoden zur Visualisierung von zytoplasmatischen Strömung in Stentor10 wurden bisher gemeldet. Diese Methoden ermöglichen der Studie wie verletzte und die anschließende Regeneration beeinflussen den körperlichen Zustand des Zytoplasmas.
Stentorenorme Größe, außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit und die Tatsache, dass es viele der Entwicklungsbiologie Phänomene gesehen bei mehrzelligen Embryos (z. B. Veranstalter, Axiation und Musterung) manifestiert lockte viele Entwicklungs Biologen während die Wende des letzten Jahrhunderts, darunter Thomas Hunt Morgan7. Während der 50er und 60er Jahren gezeigt mikrochirurgische Ansätze eine überraschende Auswahl an regenerativen und morphogenetischen Prozesse in dieser einzelligen Organismus11. Jedoch hat Stentor als Modellsystem Molekularbiologie erst vor kurzem entwickelt worden. In den vergangenen Jahren das Genom des Stentor wurde sequenziert und8montiert, und die Methode, die Genexpression RNAi durch die Fütterung mit Radardetektoren war entwickelten12.
Vor kurzem war einer der Gründe, dass Stentor in ein Modellorganismus für die moderne Molekularbiologie nur entwickelt wurde die Schwierigkeit der wachsenden großen Kulturen aufgrund seiner langen Zellzyklus (3-5 Tage). Moderne genomische und Proteomik Methoden erfordern jedoch weniger Material als früher und das Volumen von einer Einzelzelle Stentor für diese Methoden reicht auch ohne Rückgriff auf Gromer Methoden, die entwickelt wurden, für die Analyse der einzelnen Zellen, die viel kleiner sind als Stentor. Abschnitt 1 des Protokolls beschreibt das Verfahren für den Aufbau einer großen Kultur aus einer einzigen Zelle Stentor . Der gleiche Ansatz lässt sich eine große Kultur aus einer Zelle Fragment erhalten durch Schneiden einer Zelle zu etablieren. Abschnitt 1 enthält auch die Richtlinien für die Aufrechterhaltung der gesunder Stentor Kulturen über lange Zeiträume hinweg. Abschnitt 2 des Protokolls bietet die Methodik zur Induktion Zellregeneration durch Schneiden die Zellen manuell mit einer glasnadel. Abschnitt 3 des Protokolls widmet sich zwei Methoden der Induktion der Regeneration der spezifischen Zellstrukturen (Membranellar Band und Oral Apparate): Behandlung der Zellen mit Saccharose oder Harnstoff führt bis zum Vergießen von diesen Strukturen, gefolgt von ihrer Regeneration. Abschnitt 4 des Protokolls beschreibt eine Methode für die Darstellung der einzelnen regenerierenden Zellen über lange Zeiträume hinweg. 4. Abschnitt endet mit der Beschreibung der Phasen der Regeneration und Tipps für die Analyse der Dynamik der Regeneration.

<table><tbody><tr><td>Stentor coeruleus lebende Kultur</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii auf Agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurisiertes Quellwasser, 1-Liter-Flasche</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glas-Spotplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Weithalsglas mit Schraubverschluss, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-Tassen-Glasbehälter mit Glasdeckel</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell Silikonplattenmaterial</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Wachstumsmedien, optimiert für Chlamydomonas Kultur</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Abstandhalter, CultureWell Silikonfolie, 0,25 mm dick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline, Vaseline, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarrohre aus Borosilikatglas. Außendurchmesser: 1,2 mm, ID: 0,9 mm, Länge: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Nadelzieher P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, Stereozoom Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methoden für die untersuchung der regeneration im stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Zellen müssen in der Lage sein, ihre Teile wieder aus externen Störungen zu regenerieren. Die einzelligen ciliate Stentor Coeruleus ist eine ausgezeichnete Modellorganismus Wundheilung zu studieren und anschließende Zellregeneration. Das Stentor Genom wurde kürzlich, zusammen mit modernen molekularbiologischen Methoden, wie z. B. RNAi. Diese Tools machen es möglich, einzelne Zelle Regeneration auf molekularer Ebene zu untersuchen. Der erste Abschnitt des Protokolls umfasst Aufbau Stentor Zellkulturen aus einzelnen Zellen oder zellfragmente, zusammen mit allgemeinen Leitlinien für die Aufrechterhaltung der Stentor Kulturen. Kultivierung von Stentor in großen Mengen ermöglicht die Verwendung von wertvollen Tools wie Biochemie, Sequenzierung und Massenspektrometrie. Nachfolgende Abschnitten des Protokolls decken verschiedene Ansätze zur Regeneration bei Stentorinduzieren. Zellen mit einer glasnadel manuell schneiden ermöglicht die Regeneration der großen Zelle teilen, zu studieren, während Behandlung von Zellen mit Saccharose oder Harnstoff ermöglicht die Regeneration der spezifischen Strukturen befindet sich am vorderen Ende der Zelle zu studieren. Ein Verfahren zur Bildgebung regenerierende Einzelzellen sowie eine Rubrik für die Inszenierung und Analyse der Dynamik der Regeneration zur Verfügung gestellt. Der gesamte Prozess der Regeneration ist in drei Stufen unterteilt. Durch die Visualisierung der Dynamik der Entwicklung einer Bevölkerung der Zellen durch die Stadien, zeigt sich die Heterogenität in Regeneration Timing.

Stentor Kulturen wurden zuverlässig eingerichtet und gepflegt von Einzelzellen oder zellfragmente mit Abschnitt 1 des Protokolls. Video 1zeigt ein repräsentatives Beispiel für eine große gesunde Kultur.
Der zeitliche Verlauf der Regeneration wurde in Stentor mit Saccharose-Behandlungsmethode für die Initiierung der Regenerierung gemäß Schritt 3.1, kombiniert mit der Bildgebung und Analysemethode diskutiert in Abschnitt 4 (Abbildung 7) gemessen. Dieses Diagramm zeigt, dass gibt es eine eine-Stunde-langen Ausbreitung in die Zeit von der Bevölkerung der Zellen für eine bestimmte Stufe zu erreichen. Diese Art der Analyse ermöglicht die Untersuchung der zeitlichen Heterogenität in den Regenerationsprozess in einer Population von Zellen zu regenerieren.
Nachfolgend eine Zusammenfassung der Regeneration-Timing, die bisher nach Dutzenden von Saccharose Behandlungen (Abbildung 4 und Abbildung 6) beobachtet wurden. Phase 1 ist, wenn Tränen ohne jede Membranellar Band Stentor Zellen aussehen (diese Etappe beginnt unmittelbar nach der Saccharose Auswaschen). Diese Phase dauert ca. 3-6 h Stufe 2 ist, wenn eine Membranellar Band erscheint und wächst (3-6 h nach der Saccharose-Behandlung). Diese Phase dauert ca. 3-4 h. Phase 3 ist, wenn eine orale Primordium am hinteren Ende des Membranellar Bandes (6-8 h nach der Saccharose-Behandlung erscheint), und beide Strukturen sind am vorderen Ende der Zelle verschoben. Diese Phase dauert ca. 1-2 h. Wenn die Membranellar Band und der mündlichen Apparat am vordere Ende der Zelle erreicht, dies angegeben die Vollendung der Regeneration. Die Zelle hat charakteristische Stentor trompetenartige Form angenommen. Zellen wurden komplett regenerierte 8-9 h Saccharose Nachbehandlung.
<img alt="Pantoffeltierdiagramm mit markiertem Membranlärband, Mundapparat, Nahrungsvakuole, Makronukleus." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1. Snapshot von Stentor. Die Membranellar Band und der mündlichen Apparat sind am vorderen Ende der Zelle angezeigt. Die Holdfast ist am hinteren Ende der Zelle. Stentor Macronucleus ist Kugelgrafit. Eine gut genährte Stentor hat grüne Lebensmittel Vakuolen enthalten meist Chlamydomonas. Maßstabsleiste beträgt 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Aufbau des Präpariermikroskops; Objektträger mit Stentor-Exemplar zur Beobachtung in der biologischen Forschung." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Stentor schneiden Set-up. Zelle Schneiden erfolgt manuell bearbeiten einer glasnadel beim Betrachten der Zelle mit einem handelsüblichen sezierenden Stereo-Mikroskop. Das Seidenpapier dient den weißen Hintergrund um zu sehen, die Zellen besser angeben. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Mikroskopische Sequenz von sich teilenden Zellen, markiert mit A-F, zeigt Stadien des mitotischen Prozesses." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3. Schnappschüsse von Video 3 darstellen, wie ein Stentor mit einer glasnadel schneiden. (A) A Stentor unmittelbar vor die Nadel, die er berührt. (B) ein Stentor drückte sanft zwischen Nadel und Glas Folie. (C) A beauftragt Stentor als Reaktion auf die Kraft der Nadel. (D) A Stentor durch leichtes Drücken auf die Zelle mit der Seite der Nadel geschnitten. (E) A Stentor jetzt in zwei Teile geschnitten, aber nicht getrennt. (F) zwei Stentor Fragmente. Maßstabsleiste ist 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Prozessdiagramm der Stentor-Regeneration mit Saccharose-/Harnstoff-Schockschritten, Zentrifugenröhrchen, Zellstadien." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Abbildung 4. Schematische Darstellung von Abschnitt 3 und Abschnitt 4 des Protokolls. Dies ist eine illustrierte Protokoll zur Durchführung von Saccharose oder Harnstoff-Behandlung und Beobachtung der Zellregeneration. Die Zeitangabe im unteren Bereich wird von Anfang an die Wäsche 1 gemessen. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Aufbau eines Präpariermikroskops, 9-Well-Spotplatte, Analyse der Mikrotröpfchenreaktion, optische Studie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Abbildung 5. Das Setup für Bildgebung und/oder direkte Beobachtung der Regeneration mit einem aufrechten Mikroskop. In jeder 4 µL Tropfen von dem Deckglas hängen gibt es eine Zelle Regeneration unterzogen. Wasser in den Brunnen der Glasplatte vor Ort begrenzt Verdunstung der Tröpfchen. Dieses Setup ermöglicht nach der Regeneration von mehreren Zellen parallel. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Analyse der Zellstruktur von Pflanzen; Mikroskopbilder A-E; Betonung von Variationen der Zellmorphologie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Abbildung 6. Schnappschüsse von Stentor in den einzelnen Phasen der Membranellar Band und die mündliche Apparat Regeneration. (A) Stufe 1 zeichnet sich durch eine Träne-wie Zellform und das Fehlen der Membranellar Band. (B) Stufe 2 zeichnet sich durch die Darstellung der Membranellar Band, ein Zilien-basierte Struktur, die ständig schlägt. Membranellar Bänder sind gekennzeichnet mit weiße gestrichelte Linien in Platten B - D. (C und D) Stufe 3 zeichnet sich durch die Darstellung der mündlichen Primordium (mit einem Pfeil markiert). Mündliche Primordium sieht aus wie eine Einschnürung am hinteren Ende der Membranellar Band. Die mündliche Primordium wird dann in Richtung der vorderen Zelle Aufsteigen zu den mündlichen Apparat. (E) Regeneration ist abgeschlossen, wenn die Zelle das Merkmal Stentor trompetenartige Form angenommen hat, und die mündliche Vorrichtung (mit einem Pfeil markiert) hat am vorderen Ende der Zelle erweitert. Maßstabsleiste ist 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Balkendiagramm für die Verteilung der Zellstadien, Zeit nach Saccharoseschock, mit vier Stadien über 9 Stunden." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Abbildung 7. Box-Plot zeigt gestapelt wie Proportionen von Zellen in allen Phasen der Regeneration nach der Saccharose Behandlung über zeitliche Veränderungen. Die Grafik zeigt die Heterogenität des Zeitpunkts der Regeneration Phasen innerhalb einer Population von regenerierenden Zellen. "Reg End" zeigt die Fertigstellung der Regeneration. Die Anzahl der Zellen: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Becherglas mit Grünalgenkultur für Photosynthese-Studie im Laborexperiment." src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 1"> Video 1. Beispiel für eine gesunde Kultur Stentor . In der Regel, wenn eine Kultur das konzentriert ist, teilen der Kulturkreis empfiehlt. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Unter das Mikroskop fallen; Untersuchung der Oberflächenspannung von Flüssigkeiten; Mikroskopie-Methode; Pädagogische Analyse." src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 2"> Video 2. Verlangsamt sich Stentor mit Methylcellulose. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Mikroskopische Aufnahme eines mikrofluidischen Aufbaus, die die Positionierung der Tröpfchen auf einem dünnen Draht hervorhebt." src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 3"> Video 3. Schneiden Stentor. Einzelne Zellen können manuell in mehrere Stücke unter einem Stereo Mikroskop durch Drücken einer glasnadel durch die Zelle zu sezieren geschnitten werden. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problem mit Kultur</td>
			<td>Mögliche Abhilfe</td>
			<td>Mögliche Prävention</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kultur wird von Rädertierchen oder andere große Organismen überwältigt.</td>
			<td>Entfernen Sie so viele Stentor wie möglich in eine neue Kulturschale. Dann waschen Sie die Zellen dreimal.</td>
			<td>Waschen Sie Stentor gründlich, wenn sie, zu empfangen, selbst wenn sie von einem kommerziellen Anbieter zu kaufen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kultur ist durch Pilz oder andere kleinen Organismen überwältigt.</td>
			<td>Identifizieren eine Ecke wo gibt es die am wenigsten Stentor. Entfernen Sie in diesem Bereich, so viel Medien möglichst ohne viele Stentor und fügen Sie neue PSW. Mischen Sie sanft aber gründlich zu Jahrgangsstufe die eindringenden Organismen. Überspringen Sie die nächste Fütterung und Stentor Essen sie.</td>
			<td>Die Kultur regelmäßig beobachten und durch den Austausch von Medien für frische PSW kleine Verunreinigungen zu entfernen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor liegen übereinander.</td>
			<td>Teilen Sie die Kultur, so dass die Konzentration weniger als 20 Zellen/mL beträgt.</td>
			<td>Immer öfter Kulturen aufgeteilt.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor Zellen sind Paarung.</td>
			<td>Alle 4 Tage statt alle 5 Tage zu ernähren.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Kultur hat eine Menge von dunklen Abfallmaterial.</td>
			<td>Entfernen Sie so viel des dunklen Materials, Stentor Abfälle wie möglich ohne die Zellen zu entfernen. Wenn das dunkle Material Stentor zugeordnet sind, pipette rauf und runter um die Stentor Zellen aus ihrer Abfälle lösen und entfernen dann das Medium mit dem Abfall ohne die Zellen zu entfernen. Oder entfernen Sie die Stentor und entsprechend füttern weniger.</td>
			<td>Feed Stentor 1 mL weniger Nahrung pro 100 mL der Kultur.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Auf der Suche von fehlerhaft (vakuolisierten/aufgebläht oder gerundet) Stentor.
</td>
			<td>Entfernen Sie so viel Medien wie möglich ohne zu viele Stentor Zellen entfernen und fügen Sie neuer PSW hinzu.</td>
			<td>Tauschen Sie die Medien regelmäßig.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Handbuch zur Problembehandlung für die Kultivierung von Stentor.

Die riesigen Ciliate Stentor Coeruleus, ist ein ausgezeichnetes System zu studieren Regeneration und Wundheilung. Wir stellen Verfahren zur Einrichtung Stentor Zellkulturen aus einzelnen Zellen oder zellfragmente, Regenerierung durch Schneiden Zellen induzieren, chemisch induziert die Regeneration von Membranellar Band und mündliche Apparatur, Bildverarbeitung und Analyse der Zelle Regeneration.

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Stentor für die Verwendung als Modellorganismus zur Untersuchung der Regeneration auf Einzelzellebene zu züchten. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, z. B. wie Zellen Strukturen aus diskreten Teilen aufbauen. Die Hauptvorteile von Stentor sind, dass es sich um einzelne Zellen handelt, die sich regenerieren können und dass sie groß genug sind, um sie zu operieren.Im Allgemeinen besteht die Herausforderung dieses Protokolls darin, dass die Menschen daran gewöhnt sind, mit Zellen als Kulturen und nicht als Individuen zu arbeiten. Beginnen Sie mit der Suche nach einer Petrischale mit Stentor-Probe unter einem Stereomikroskop unter Verwendung von Schräglicht bei 5-facher Vergrößerung. Beachten Sie, dass Stentorzellen eine trompetenartige Form aufweisen, wenn sie an ein Substrat gebunden sind.Obwohl sie nicht gebunden sind, haben schwimmende Stentorzellen ein weniger ausgedehntes Aussehen. Übertragen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette einzelne Stentorzellen in die Vertiefung einer Glasspotplatte, die mindestens 100 Mikroliter im Handel erhältliches pasteurisiertes Quellwasser enthält. Entfernen Sie dann etwa 90 % des Wassers aus dem Brunnen, ohne die Stentorzellen zu entfernen, und geben Sie dreimal 500 Mikroliter frisches pasteurisiertes Quellwasser in den Brunnen, um die Zellen zu waschen.Um die Zellen zu füttern, wird zunächst ein Ein-Milliliter-Aliquot aus einer Chlamydomonas-Kultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, um es bei 2.095 g für drei Minuten bei Raumtemperatur zu zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter pasteurisiertem Quellwasser für eine zweite Zentrifugation, gefolgt von einer Resuspension in 500 Mikrolitern pasteurisiertem Quellwasser. Wenn eine klonale Stentorkultur benötigt wird, werden 500 Mikroliter konditioniertes Medium pro Kultur in einzelne Vertiefungen einer Glasspotplatte überführt und in jede Vertiefung des Mediums eine Stentorzelle übertragen.Füttern Sie jede Stentorkultur alle 48 Stunden mit fünf Mikrolitern der vorbereiteten Chlamydomonas und bewahren Sie die Kulturen an einem schattigen Ort auf. Zählen Sie die Anzahl der neuen Stentorzellen vor jeder Fütterung und passen Sie das Volumen der abgegebenen Chlamydomonas entsprechend an. Pipettieren Sie das Nährmedium alle 96 Stunden einige Male vorsichtig, um den Stentor vom Meniskus jeder Vertiefung zu lösen, und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen zu aspirieren, ohne Zellen zu entfernen.Geben Sie dann 500 Mikroliter frisches konditioniertes Medium in jede Vertiefung. Wenn die Anzahl der Zellen in mindestens einer Vertiefung 20 überschreitet, geben Sie 20 Milliliter pasteurisiertes Quellwasser in ein autoklaviertes sterilisiertes Weithalsglas und lösen Sie die Stentorzellen vorsichtig vom Boden jeder Vertiefung, wie gezeigt. Sammeln Sie alle Stentorzellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette und geben Sie die Zellen vorsichtig in das Glasgefäß.Geben Sie alle 48 Stunden frisches pasteurisiertes Quellwasser in das Glas, um die Stentordichte auf etwa 20 Zellen pro Milliliter zu halten, und füttern Sie die Stentorzellen mit 200 bis 1.000 Mikrolitern vorbereiteten Chlamydomonas. Wenn das Kulturvolumen etwa 90 % des Fassungsvermögens des Glases erreicht, geben Sie den gesamten Inhalt des Glases in einen Glasbehälter mit zwei Tassen, füttern Sie die Stentorkulturen mit hohem Volumen mit zwei Millilitern vorbereiteter Chlamydomonas pro 100 Milliliter Kultur und fügen Sie der Kultur alle vier bis fünf Tage pasteurisiertes Quellwasser hinzu, um die Stentordichte bei etwa 20 Zellen pro Milliliter zu halten. Untersuchen Sie die Kulturen einmal pro Woche unter einem 5-fachen Präpariermikroskop mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf Rädertierchen, Pilze und anderes Wachstum, um kontaminierende Mikroorganismen sowie abnormal geformte und farblose Stentorzellen zu entfernen.Teilen Sie die Kultur, wenn der Glasbehälter zu etwa 90 % gefüllt ist, fügen Sie der Kultur 25 Milliliter pasteurisiertes Quellwasser hinzu und lösen Sie den Stentor mit einer 50-Milliliter-Pipette vom Glas, wie gezeigt. Füllen Sie dann etwa 50 % der Kultur in einen neuen Glasbehälter mit zwei Tassen. Um die Regeneration durch Zellfragmentierung zu induzieren, verwenden Sie zunächst einen Nadelzieher, um mehrere Nadeln aus Kapillarröhrchen herzustellen.Sammeln Sie als Nächstes einen gesunden Stentor mit einer definierten Trompetenform, einer leuchtend blaugrünen Farbe und ohne große Vakuolen in einem Zwei-Mikroliter-Tröpfchen. Legen Sie den Tropfen auf einen Objektträger und verlangsamen Sie die Bewegung des Stentors mit zwei Mikrolitern 4%iger Methylcellulose. Legen Sie das Tröpfchen unter ein Präpariermikroskop und halten Sie die Glasnadel so parallel wie möglich zur Schnittfläche, um einen Nadelbruch zu verhindern.Drücken Sie vorsichtig mit der Seite der Nadel auf den kontrahierten Stentor, um das vordere Ende der Zelle vom hinteren Ende der Zelle zu trennen. Vergewissern Sie sich, dass beide Fragmente mindestens einen makronuklearen Knoten aufweisen, und verschieben Sie die Fragmente in einzelne Vertiefungen einer Glaspunktplatte. Um die Regeneration der Membranbande und des Mundapparates zu induzieren, übertragen Sie 30 bis 60 Stentorzellen in einem Milliliter Kulturmedium in ein Mikrozentrifugenröhrchen und verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um alle Zellen aus dem Röhrchen in einem einzigen 125-Mikroliter-Volumenzug zu sammeln.Geben Sie die Zellen in ein Röhrchen mit 500 Mikrolitern frisch zubereiteter 25%iger Saccharose und starten Sie eine Stoppuhr. Nachdem Sie die Zellen in der Tube im Gestell eine Minute lang gedreht haben, sammeln Sie alle Zellen in einer einzigen 200-Mikroliter-Entnahme und halten Sie die Zellen in der Pipettenspitze, bis die Stoppuhr zwei Minuten Saccharosebehandlung anzeigt. Werfen Sie dann den Stentor in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter pasteurisiertem Quellwasser für drei Schleudergänge.Um die Regeneration abzubilden, geben Sie 100 Mikroliter pasteurisiertes Quellwasser in eine Vertiefung einer Glasspotplatte und verwenden Sie eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze, um eine Stentorzelle in vier Mikrolitern Nährmedium zu sammeln. Geben Sie das Tröpfchen in die Mitte eines 22 x 22 Quadratmillimeter großen Deckglases und legen Sie vier weitere Tröpfchen um das vorherige Tröpfchen. Drehen Sie das Deckglas um und legen Sie es vorsichtig mit pasteurisiertem Quellwasser über die Mulde.Anschließend bilden Sie die regenerierenden Zellen unter einem Lichtmikroskop mit der entsprechenden Zeitauflösung ab. Im ersten Stadium der Regeneration, das unmittelbar nach der Saccharoseauswaschung stattfindet, sehen die Stentorzellen aus wie Tränen ohne Membranband. Nach drei bis sechs Stunden erscheint ein Membranllarband.Diese Phase, die zweite Etappe, dauert weitere drei bis vier Stunden. Das dritte Stadium tritt auf, wenn ein orales Primordium am hinteren Ende des Membranlalband erscheint und beide Strukturen beginnen, sich in Richtung des vorderen Endes der Zelle zu bewegen. Diese Phase dauert ein bis zwei Stunden.Wenn sowohl das Membranlärband als auch der Mundapparat das vordere Ende der Zelle erreichen, ist die Regeneration abgeschlossen und die Zelle hat die charakteristische Stentor-Trompetenform angenommen. Plotten Sie den Prozentsatz der Zellen in den einzelnen Regenerationsphasen zu jedem Zeitpunkt in einem gestapelten Boxplot. Die Messung der Regenerationszeit nach dem Zellschnitt und der Saccharosebehandlung zeigt eine einstündige Streuung der Zeit, die die Zellpopulation benötigt, um ein bestimmtes Stadium zu erreichen, was die zeitliche Heterogenität des Regenerationsprozesses innerhalb einer gegebenen Population regenerierender Zellen zeigt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Stentor kultiviert und seine Regeneration einleitet und quantifiziert. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, geduldig zu sein. Stentor braucht drei bis fünf Tage, um sich in der Kultur zu teilen, und die Identifizierung der Stentor-Regenerationsstadien erfordert Übung.Diese Technik wird Zellbiologieforschern den Weg ebnen, die Regeneration im Stentor zu erforschen.

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Ein attraktives Modell zur Untersuchung Stammzell-Differenzierung innerhalb eines lebenden Tieres ist der Planarie flatworm. Die Regeneration wird durch einfache Amputation Experimente, die leicht in einem der Grundlagenforschung im Labor durchgeführt werden untersucht und sind zugänglich für pharmakologische und genetische...

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Eine effektive Methode für die Transplantation von Gewebe definierte und einheitliche Größe zwischen Planarien beschrieben wird. Ebenfalls enthalten ist eine Beschreibung, wie die Immobilisierung Technik zur Transplantation verwendet werden ausgebildet, in Verbindung mit Blei Schilde, für die partielle Bestrahlung von lebenden Tieren werden.

Planarien Immobilisierung, partielle Bestrahlung, und Gewebetransplantation

Ein Modell der Stent-Implantation in Maus Halsschlagader beschrieben. Im Vergleich zu anderen ähnlichen Methoden ist dieses Verfahren sehr schnell, einfach und zugänglich, bietet die Möglichkeit, auf bequeme Weise die Gefäßwand Reaktion auf verschiedene Medikamente-freisetzende Stents und die molekularen Mechanismen der Restenose zu studieren.

Ein Mausmodell der Stentimplantation in der Arteria carotis für das Studium der Restenose

Der Riesenciliaten Stentor coeruleus ist ein klassisches System zur Untersuchung der Regeneration und Wundheilung in Einzelzellen. Durch die gleichzeitige Abbildung von Stentorzellen bei niedriger und hoher Vergrößerung ist es möglich, zytoplasmatische Flüsse vor, während und nach der Verwundung zu messen.

Visualisierung des zytoplasmatischen Flusses während der Einzelzell-Wundheilung bei Stentor coeruleus

Da viele Zebrafisch-Modellen der neurologischen und nicht-neurologischen Erkrankungen sind in der erwachsenen Fischen nicht der Embryo / Larven untersucht, entwickelten wir eine quantitative Seitenlinie regenerative Assay, die erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle angewendet werden können. Der Test beteiligt Beschluss der 1) Neuromasten und 2) einzelne Haarzelle Ebenen.

Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das am Rückenmark Scheiben auf Multielektrodenarrays kultiviert, um funktionelle Regeneration propriospinale Verbindungen in vitro-Studie basiert.

Untersuchung funktionelle Regeneration im Organotypische Spinal Cord Co-Kulturen auf Multi-Elektroden-Arrays Grown

In dieser Studie wird ein Schritt-für-Schritt-Videoprotokoll der apikalen Resektion demonstriert. Die apikale Resektion ist ein kürzlich vorgestellter chirurgischer Ansatz in der Forschung zur Herzregeneration von Säugetieren. Diese Studie kann die Anwendung der apikalen Resektion als Standardmethode in der Erforschung des Mechanismus, der der Herzregeneration zugrunde liegt, fördern.

Wurzelspitzenresektion Mausmodell zur frühen Säugetierherzregeneration Studieren

Hier zeigen wir, wie man die Regeneration in der Sternseeanemone Nematostella vectensis, einem Modell-Nesseltierchen, induziert und überwacht.  Wir zeigen, wie die Regeneration mit Hilfe eines morphologischen Staging-Systems amputiert und kategorisiert werden kann, und wir verwenden dieses System, um die Notwendigkeit der Autophagie in regenerierenden Polypenstrukturen aufzudecken.

Induzierende komplette Polyp Regeneration von aboraler Physa des Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Wir stellen ein Protokoll zur Charakterisierung der Motilität und des Verhaltens einer Population von hundert Mikro- bis Millimeterzellen mittels Hellfeldmikroskopie und Zellverfolgung vor. Dieser Assay zeigt, dass Stentor coeruleus bei der Regeneration eines verlorenen oralen Apparates vier verhaltensunterschiedene Phasen durchläuft.

Analyse von Motilitätsmustern von Stentor während und nach der oralen Apparateregeneration mittels Zellverfolgung

Hier skizzieren wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

Erfahren Sie Methoden zur Untersuchung der Zellregeneration mit Stentor coeruleus. Dieses Protokoll zeigt Kultivierung, Induktion durch Fragmentierung und mikroskopische Analyse einzelner Zellen.

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

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