Name: Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Algen Konjugation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie klone Kulturen einzelliger Konjugatophyten aus natürlichen Gewässern etablieren. Diese Methode demonstriert die Isolierung einzelner Zellen und deren erfolgreiche Kultivierung für reine Algenstämme.

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Wir danken Hisayoshi Nozaki (Universität Tokio), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan Frauen Universität) und Hiroyuki Sekimoto (Japan Joshi Daigaku). Wir möchten die Kritiken für ihre Beiträge danken. Diese Studie wurde durch eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung (Nr. 26440223 und 15 H 04413) von der Japan Society for Promotion of Science, Japan, und durch einen Zuschuss von der neuen Technologie Development Foundation, Yuki Tsuchikane unterstützt.

1. Erhebung einer Wasserprobe mit Algen
Hinweis: Einzellige Conjugatophytes wachsen in stagnierenden Binnengewässern wie Seen, Sümpfe und Reisfelder. Eine Algen-haltigen Wasserprobe wird von einer dieser Umgebungen, eine Kultur-Sorte zu produzieren gesammelt. Die folgenden Elemente sind erforderlich, bevor der Prozess: net Plankton, einer Einweg-Pipette, und eine Flasche oder ein 50 mL-Tube für das Sammeln von Wasserproben.
<ol><li>Verwenden Sie net in einer See-Umgebung Plankton, um Algen aus dem Wasser zu sammeln. Verwenden Sie eine geeignete Netz, je nach Verwendungszweck. Hinweis: Der obere Teil des Netzes ist durchlässig für Wasser. Die Algen, die durch das Netz gefangen sind in den unteren Behälter zum Plankton net konzentriert. Ein grobes Netz ermöglicht kleine Algen zu durchqueren. Ein feines Netz bekommt leicht verstopft.</li>
	<li>Übertragen Sie das Wasser (ca. 50 mL) auf die 50 mL-Tube oder eine 100 mL PET-Flasche. Bringen Sie die konzentrierte Wasserprobe ins Labor.</li>
	<li>Einzelligen Conjugatophytes wachsen auch in Sümpfen oder Reisfelder. In diesen Bereichen Flachwasser kann Wasserprobe mit Algen mit einer Pipette direkt probieren. Übertragen Sie anschließend das Wasser (30-50 mL) 50 mL-Tube oder einer 50 mL Kunststoff-Flasche. Hinweis: Das Wasser wird sorgfältig über der Bodenoberfläche abgetastet, so dass die Probe keinem Boden enthält.</li>
</ol>2. Bestätigung der Algen
Hinweis: Die folgenden Elemente sind erforderlich: eine Lupe oder portable Mikroskop und eine 60 mm Schale zur Beobachtung.
<ol><li>Um zu bestätigen das Vorhandensein von Algen in der Probe, während es in der Einweg-Pipette ist, verwenden Sie die Lupe die Probe direkt zu beobachten. Hinweis: Größere Zellen von ca. 400-1.000 µm in der Länge (z.B. Closterium Ehrenbergii) können problemlos beobachteten mit dieser Methode.</li>
	<li>Um Algen unter dem portable Mikroskop bestätigen, Gießen Sie die Wasserprobe in einer Petrischale Kunststofflabor.<ol>
<li>Der innere Teil der oberen Hälfte die Probe (ca. 3 mL) aufsetzen (Deckel) der 60 mm Petrischale, dann legen Sie die untere Hälfte mit seinem Unterteil mit Blick auf den inneren Teil des Deckels an der Spitze. Hinweis: Diese Methode verhindert, dass die Probe bewegt und die Beobachtung erleichtert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung der Kapillare Glaspipette aus einer Pasteurpipette für die Isolierung
Hinweis: Bevor Sie beginnen, sind folgende Elemente erforderlich: Pasteur Pipetten, ein Ständer für das Pasteur-Pipetten, Handschuhe, ein Gummiball, ein Geist-Lampe, Methanol für den Geist-Lampe, ein Feuerzeug, Pinzette, einen Mülleimer für Glas, sterilisiert und ein sauberes Zimmer oder blätterig Flow-Haube (falls erforderlich).
<ol><li>Einen Alkohol-Brenner zu zünden.<ol>
<li>Um eine feine Kapillare Glaspipette für die Isolierung zu produzieren, stellen Sie sicher, dass die Flamme nicht flackern ist. Schärfen Sie die Flamme und schmelzen Sie die Pasteurpipette an der Spitze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hitze eine sterile Glas Pasteurpipette auf der Flamme, gestützt auf der Seite der Gummiball von hand und auf der Seite der Spitze mit Pinzette.</li>
	<li>Nehmen Sie Pasteurpipette aus der Flamme und ziehen Sie es.<ol>
<li>Wenn das Glas schmelzen, der Pasteurpipette aus der Flamme schnell zu entfernen und dann ziehen. Hinweis: In diesem Experiment wurde die Pasteurpipette von 15-20 cm. machen sicher erweitert, die die Pipette aus der Flamme während der Zugkraft ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brechen Sie die Glas-Kapillare-Pipettenspitze auf die richtige Länge. Da die Verbeugung Teil vom feinsten ist, ist es ideal für den Tipp. Hinweis: In dieser Studie wurde eine Kapillare Glaspipette mit einer Spitze von 5-10 cm vorbereitet.<ol>
<li>Achten Sie darauf, die Kapillare nach schmilzt sie entsorgen, und bestätigen, dass die Flamme gelegt wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Luftblasen aus den Kapillaren Glaspipette entlassen geben die Größe der Spitze öffnen. Wählen Sie die richtige Größe für die Zelle isoliert werden. Ca. 1 mm der Bläschen eignet sich für die Isolierung von Closterium Arten, mit Zellenbreite von 10-20 µm.</li>
</ol>4. Single-Cell Isolation durch eine Kapillare Glaspipette
Hinweis: Die folgenden Elemente sind erforderlich, bevor Sie beginnen: ein umgekehrtes Lichtmikroskop, Uhrengläser, einer Plastikschale und steril Gewinde Reagenzgläser, enthält CA Medium (Tabelle 1) oder mittlere CA7konditioniert.
<ol><li>Bereiten Sie ein paar Uhrengläser (22 mm Durchmesser und 1 mm in der Tiefe), jeweils mit 1 mL steriles CA Medium.</li>
	<li>Isolieren einer Zielzelle aus der Wasserprobe im Bereich gesammelt.<ol>
<li>Gießen Sie die Wasserprobe (ca. 30-40 mL) mit den Zielzellen in die Plastikschale.</li>
		<li>Während der Beobachtung die Probe in die Plastikschale unter einem invertierten Lichtmikroskop abholen Einzelzellen mit Kapillare Glaspipette.</li>
		<li>Bringen Sie die Kapillare Glaspipette in der Nähe der Zelle das Streben der Zelle durch Kapillarwirkung zu erleichtern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in einem Uhrglas, enthält 1 mL steriles CA Medium (Abbildung 1a).</li>
	<li>Wählen Sie die Zellen wieder mit einer neuen Kapillare Glaspipette aus dem sterilen CA Medium und überträgt es auf ein zweites Uhrglas mit sterilen CA Medium (Abbildung 1 b). Hinweis: Dieser Vorgang wird wiederholt, bis eine einzelne Zelle in der spot Platte (Abbildung 1 c) isoliert ist.</li>
	<li>Die einzelne Zelle mit einem neuen Kapillare Glaspipette abholen, und schließlich in ein Reagenzglas mit 14 mL CA Medium oder konditionierten CA Medium (Abbildung 1 d) übertragen. Inkubation die Probe bei 23 ° C unter einem 16 h Licht: 8-h Dunkel-Zyklus für 2 Wochen. Hinweis: Die unbekannte wird für die Zellproliferation, die abgesondert sind, von der wachsenden Zellen in die Umgebung gehören konditionierten Mittel-und Zellteilung4zu erleichtern. Wenn eine klonale Kultur hergestellt wird, bereiten Sie die konditionierte CA Medium aus dem Kulturmedium4. Die Kultur wird im Erfolgsfall grün.</li>
</ol>

<ol><li>Wickett, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylotranscriptomic+analysis+of+the+origin+and+early+diversification+of+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).</li>
<li>Delwiche, C. F., Cooper, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+origin+of+a+terrestrial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolutionary origin of a terrestrial flora.</a> Current Biology. 25, R899-R910 (2015).</li>
<li>Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00071618300650011">A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms.</a> British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).</li>
<li>Pringsheim, E. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPringsheim%2C+EG+%22Pure+Cultures+of+Algae%3A+Their+Preparation+and+Maintenance%22">Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance</a>. , Cambridge University Press. London, UK. 119(1946).</li>
<li>Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/algal-culturing-techniques/andersen/978-0-12-088426-1">Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae</a>. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).</li>
<li>Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/algal-culturing-techniques/andersen/978-0-12-088426-1">Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques</a>. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).</li>
<li>Abe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+nuclear+transformation+of+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).</li>
<li>Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1440-1835.2010.00602.x">Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta).</a> Phycological Research. 59, 74-82 (2011).</li>
<li>Kanda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+knockouts+reveal+that+CpRLP1+is+a+negative+regulator+of+the+sex+pheromone+PR-IP+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Scientific Reports. 7, 17873(2017).</li>
<li>Ichimura, T. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02493393">Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini.</a> Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).</li>
<li>Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02411384">Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Planta. 182, 348-354 (1990).</li>
<li>Ichimura, T., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201302724192">The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems.</a> Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).</li>
<li>Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . <a target="_blank" href="https://archive.org/details/ecologyofalgaesy00tryo">The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959</a>. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).</li>
<li>Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. <a target="_blank" href="https://ci.nii.ac.jp/naid/10008776057/">Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan</a>. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).</li>
<li>Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/algal-culturing-techniques/andersen/978-0-12-088426-1">Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae</a>. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).</li>
</ol>

Mit der vorliegenden Methode entstanden 9 klonalen Kultur Stämme von Closterium SP. aus 15 Zellen isoliert von der Wasserprobe (Inba1), vertritt eine 60 % ige Erfolgsquote. Artenkenntnisse wird in Zukunft durch morphologische Beobachtung als auch DNA-Analysen, wie Molekulare phylogenetische Analyse8erfolgen.
In dem vorliegenden Verfahren ist die Frische der Wasserprobe wichtig, die Erfolgsquote. Es ist besser, die Zellen von Wasserproben so bald wie möglich nach der Feldauflistung zu isolieren. Obwohl die Zellen der Gattung Closterium (z. B. C. Ehrenbergii, C. Peracerosum-Strigosum-Littorale Komplex) in der Wasserprobe für ca. 7 d beibehalten werden können, indem es bei 4-8 ° C gespeichert, ist die Isolation der Zellen wünschenswert am Tag der Abholung oder am nächsten Tag. Es ist auch wichtig, sämtliche Verunreinigungen außer den Zielzellen, also die Zahl der Wiederholungen Waschen zu entfernen (d.h., > 3 X) kann eine Kontamination der Kulturen von Mikroorganismen im Boden und Zellen zu verhindern.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass die in diesem Protokoll (CA oder konditionierten CA Medium) verwendeten Nährmedien sind nicht immer geeignet für alle conjugating Algen. In einigen Fällen kann es notwendig zu prüfen, mit einem anderen Medium, sowie anderen Licht und Temperaturbedingungen sein. Auch, da es schwierig zu beweisen, ob eine Kultur von einer einzigen Zelle entwickelt hat, ist es notwendig nur 1 Zelle genau abholen, beim Übertragen von Zellen in einem Reagenzglas. Daher sollte die Übertragung mit einem neuen Kapillare Glaspipette jedes Mal durchgeführt werden.
Zur Gründung einer klonalen Kultur mit dieser Pipette waschen Methode ist eine klassische/Standard-Methode und ist die zuverlässigste Methode zu verwenden, um die gewünschten Zellen für eine Studie zu isolieren. Die klonalen Kulturen der Konjugation Algen verwendet in vielen Studien8,9,10,11 wurden gegründet, mit dem vorliegenden Verfahren. Es ist schwierig, Konjugation Algen ohne einer klonalen Kultur zu analysieren. Darüber hinaus in den letzten Jahren ganze Genomsequenzen de Novo wurde leicht zu beschaffen (z. B.durch die Verwendung des MinION Nanopore Sequencers) und zur Gründung klonaler Kulturen erleichtert weiter de Novo Sequenzierung. Das heißt, ist diese Methode der erste Schritt in die Zukunft studieren dieser Algen, ihre biologische Vielfalt besser zu verstehen.
Um eine stabile Kultur Belastung zu etablieren, ist es notwendig bestimmte kritische Schritte genau innerhalb des Protokolls. Der wichtigste Schritt ist die Vorbereitung der Kapillare Glaspipette mit eine optimale Blende um den Durchgang von nur einer einzigen Zelle zu ermöglichen. Die Öffnung der Kapillare Glaspipette muss etwas mehr als die Länge der Nebenachse der Zelle von Interesse sein. Die optimale Kapillare Glaspipette kann eine einzelne Zelle durch Kapillarwirkung Aspirieren. Wenn der Durchmesser der Öffnung zu groß ist, wird die Kapillare in unbelebter Verunreinigung Materialien oder auch (eine) andere besonders, neben der Zielzelle auch zeichnen.
Um eine Kapillare Glaspipette mit eine optimale Blende zu erhalten, sind folgende Punkte zu beachten. Erstens muss die Säule der Flamme schmal sein, beim Erhitzen von Kapillaren Glaspipette. Als nächstes beim Pasteurpipette ziehen, muss es aus der Flamme entfernt werden; Andernfalls wird die Blende von der Pasteurpipette zusammenbrechen.
Die Ausrüstung und Container gezeigt in diesem Protokoll sind einfach und können geändert werden. Beispielsweise kann mithilfe von Multi-well-Platten anstelle von uhrgläser mit einem Brunnen, der Zelle waschen effizienter gestaltet werden. Darüber hinaus können die Container für andere ähnliche ersetzt werden. Durch eine einzelne Zelle auf dem Kulturmedium im letzten Schritt zu übertragen, kann eine klonale Kultur aufgebaut werden.
Vorbereitung eines sterilisierten Containers und arbeiten in einer Kapuze werden axenic (unbelasteten) Stämme etablieren. Um Verunreinigungen zu vermeiden, ist es notwendig die Waschschritt mit frischen Aliquote mehr als 3 X wiederholen. Manchmal sind Bakterien auch durch Zugabe von Antibiotika15sterilisiert.
Diese Methode konzentriert sich auf Desmid (Zygnematales) isoliert, aber ändern Sie die Größe der Blende Glas Kapillare Pipette, um die Isolation der unterschiedlich großen Plankton angewendet werden.

Konjugation von Algen (des Ordens Zygnematales), besetzen auch bekannt als Conjugatophytes, eine phylogenetische Schlüsselposition als die nächsten lebenden Verwandten der unmittelbaren Vorfahren des Land Pflanzen1,2. Etablierten klonale Kulturen von Algen führten zu einer Vielzahl von taxonomischen, physiologischen und genetischen Studien in den vergangenen Jahren. Die ISOLIERUNGSTECHNIKEN von Mikroorganismen aus einer natürlichen Wiese haben eine lange Tradition-3,-4. In den letzten Jahren etablierte automatisierte Isolierung, die Techniken mit Durchflusszytometrie auch gewesen5. Die am häufigsten verwendete Methode verwendet, um eine einzelne Zelle für die Errichtung einer klonalen Kultur zu erhalten ist die einzellige Isolierung mit einer Glas-Kapillare Pipette-6. Diese traditionelle Methode erfordert Geschick und eine präzise experimentelles Protokoll.
In diesem Artikel zeigen wir die Probenahme von Algen aus Feldproben und die Einrichtung von klonalen Kulturen von einzelligen Algen Konjugation, wie Gattung Closterium mit Hilfe einer Kapillare Glaspipette. Eine Wasserprobe mit vegetativen Zellen wird von der Wiese (z.B., ein See, Teich oder Reisfeld) gesammelt. Die Zellen sind von der Wasserprobe mit Hilfe einer Kapillare Glaspipette isoliert und dann gewaschen. Die Zellen sind in einem Reagenzglas mit Stickstoff ergänzt Medium (CA Medium) kultiviert, bei 24 ° C unter einem 16 h Licht: 8-h dunkel Regime. Diese Methode eignet sich auch zur Isolierung von anderen Mikroalgen zur klonale Kulturen zu generieren.

<table><tbody><tr><td>Sampling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Planktonnetz</td><td>RIGO, Japan</td><td>N-NO380T</td><td>Maschenweite: 32 &micro; m</td></tr><tr><td>Tragbares Mikroskop (z. B. Nature Scope FABRE)</td><td>Nikon, Japan</td><td>JAN: 4960759 206725</td><td>Vergrößerung: 20-fach;</td></tr><tr><td>Lupe (z.B. Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td><td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan</td><td>1985-20</td><td>Vergrößerung: 20x;</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan</td><td>Steriles Spuit No.4</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen (50 mL Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss)</td><td>Labcon, USA</td><td>3181-345-008</td><td></td></tr><tr><td>Flasche (100 mL Polycarbonat Flasche)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>1-7403-01</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Schale</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>1010-060</td><td>&nbsp; Zur Beobachtung von Algen. 60 mm/unbehandelte Schale</td></tr><tr><td><stark>Vorbereitung einer Mikropipette</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten (Baumwollstecker 9" Pasteurpipetten)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>13-678-8B</td><td>7 & 225 mm</td></tr><tr><td>Gummibirne (SPOID SILICONE, 1 cc)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>5-5669-01</td><td>10 & 40 mm</td></tr><tr><td>Edelstahl Pinzette</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>PT-09</td><td>110 mm</td></tr><tr><td><stark>Einzelzellisolierung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uhrenglas (Blutreaktionsplatte)</td><td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japan</td><td>F14-155-030 zum</td><td>Spülen von Zellen während der Isolierung. 22 mm Durchmesser und 1 mm Tiefe</td></tr><tr><td>Reagenzgläser mit Gewinde&nbsp;</td><td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japan</td><td>XX142</td><td>18 &Oslash; &times 170 mm</td></tr><tr><td>Inverses Lichtmikroskop</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>CKX41N</td><td>zur Isolierung von Algen.</td></tr><tr><td>Kunststoffschale</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>SH90-15E&nbsp;</td><td>&nbsp; 90 & mal; ca. 15 mm</td></tr></tbody></table>

einrichtung einer klonalen kultur der einzelligen algen konjugation

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Es ist unentbehrlich, klonale Kulturen von Mikroalgen für den Einsatz in Studien mit verschiedenen Themen, wie Physiologie, Genetik, Taxonomie und Mikrobiologie. Daher ist es äußerst wichtig, die Entwicklung von Techniken zur klonale Kulturen zu schaffen. In diesem Artikel zeigen wir die Einrichtung einer klonalen Kultur der conjugating Alge. Wasserproben werden aus dem Bereich gesammelt. Anschließend werden Zellen isoliert mit einer Kapillare Glaspipette, in Medien und Bedingungen geeignet zur Erzeugung einer klonalen Kultur angebaut.

Eine Wasserprobe (Inba1) von 50 mL wurden von einer Entnahmestelle in See Inba-Numa (pH 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) im Sakura-Shi, Chiba, Japan, am 25. Juni 2016. Die Wasserprobe wurde bei 4-8 ° c gelagert. Am nächste Tag nach der Sammlung, ein Exemplar von Closterium SP. wurde von der Wasserprobe mit vegetativen Zellen isoliert. Fünfzehn vegetativen Zellen der identische Morphologie (Inba1-1,-2-3-4,-5,-6, -7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, und-15) wurden isoliert von der Probe und dann mit der Pipette waschen Methode gewaschen. Fünfzehn isolierte Einzelzellen wurden in unabhängigen Reagenzgläser mit 15 mL konditionierten CA Medium kultiviert. Nach 2 Wochen Inkubation, Zellproliferation wurde in 9 Reagenzgläsern beobachtet [Inba1-1, -3,-4-5 (Abbildung 2a),-6,-9,-10,-12 (Abb. 2 b) und-13; Tabelle 2]. Neun klonale Kulturen entstanden aus der Inba1 Probe Isolate (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> Abbildung 1 : Der Fluss der einzelligen Isolation. (ein) Übertragung der einzelnen Zielzelle Algen aus der ursprünglichen Wasserprobe auf der sterilen Medium in das erste Uhrglas. (b, c) Übertragen der Zelle wieder auf das nächste Uhrglas zu waschen. Dieses Verfahren sollte wiederholt werden, bis es keine anderen Zellen/Verunreinigungen als das Ziel in der Mitte gibt; drei Uhrengläser sind im Diagramm hier exemplarisch dargestellt. (d) schließlich übertragen die gewaschene Zelle in einem Teströhrchen das geeignete Medium für Wachstum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> Abbildung 2 : Fotos von vegetativen Zellen des Closterium SP. (ein) Inba1-5) und (b) Inba1-12 werden hier gezeigt. Die Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> Abbildung 3 : Einrichtung einer klonalen Kultur aus der Probe Inba1. Die Reagenzgläser für 2 Wochen kultiviert wurden von unten fotografiert. Ein Sternchen gibt Zellproliferation. Die Maßstabsleiste = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Name des Mediums</td>
			<td>Referenz</td>
			<td colspan="2">Kommentare</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">Bakumatsu und Watanabe12
</td>
			<td>Ca (NO3)2·4H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>KNO3
</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Nr.3
</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-Na2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vitamin B12</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thiamin-HCl</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>PIV-Metalle</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (als EDTA; 1:1 Molar)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fügen Sie Wasser auf 100 mL zu machen</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">pH mit NaOH auf 7,2 einstellen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">P IV Metalle</td>
			<td rowspan="7">Provasoli und Pintner13
</td>
			<td>Na2EDTA·2H2O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>19,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2· 4H2O</td>
			<td>3,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1,04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>0,4 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2MoO4·2H2O</td>
			<td>0,25 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fügen Sie Wasser auf 100 mL zu machen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (als EDTA; 1:1 Molar)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(also4)2·6H2O,</td>
			<td>70,2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O,</td>
			<td>66 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fügen Sie Wasser auf 100 mL zu machen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Konditionierte CA medium</td>
			<td>Abe Et Al.7
</td>
			<td colspan="2">14 – 20 Tage inkubieren Sie Zellen in frischen CA Medium. Sammeln der kultivierten Mediums durch Filtration mit qualitativen Filterpapier und Sterilisieren Sie die gefilterten Medium durch Autoklavieren (121 ° C für 15 min).</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* In den NIES ist 2,2 mg ZnSO4·7H2O. 1,04 mg ZnCl2 abgelöst.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Formulierungen der in dieser Studie verwendeten Medien.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Wasserprobe</td>
			<td>Name der Zelle</td>
			<td>Status nach Kultur</td>
			<td>Stamm-name</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
<tr>
<td>-10</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Die Isolierung Studie Zusammenfassung.

In diesem Artikel zeigen wir die Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Konjugation Algenarten aus einer natürlichen Wiese gesammelt.

Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Algen Konjugation

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Wir werden unsere Methode vorstellen, mit der eine Reihe von Algen, insbesondere einzelligen Konjugatophyten, etabliert werden kann. Für die Etablierung eines Stammes ist die Entnahme von Wasserproben, die Algen enthalten, durch Feldarbeit erforderlich. Die Wasserprobe enthält andere Fremdstoffe als Algen.Aus dieser Probe wird nur eine einzelne Zelle isoliert. Das THIL wird auf ein sauberes Medium überführt und wiederholt gereinigt. Die Isolierung wird durch diesen Prozess durchgeführt.Eine Sterilisation ist möglich, wenn sie sorgfältig durchgeführt wird. Schließlich wird die isolierte Zelle in ein Reagenzglas überführt und durch Kultivierung ein Stamm etabliert. Hier konzentrieren wir uns auf einzellige Konjugatophyten, bei denen verschiedene Formen identifiziert werden.Einzellige Konjugatophyten wachsen in stehenden Süßwassergebieten wie Seen, Sümpfen und Reisfeldern. Aus diesen Umgebungen werden Algen mit Wasserproben entnommen, um einen Kulturstamm herzustellen. Wir werden eine Methode zur Entnahme von Wasserproben aus der Seeumgebung vorstellen.Für die Umgebung des Sees wird ein Planktonnetz verwendet. Der obere Netzteil ist wasserdurchlässig. Die vom Netz gefangenen Algen werden im Bodenbehälter konzentriert.Ein Kreuzgitter lässt kleine Algen passieren. Ein feines Netz verstopft leicht. Je nach Verwendungszweck sollte ein richtiges Netz verwendet werden.Bringen Sie die konzentrierte Wasserprobe ins Labor. Einzellige Konjugatophyten wachsen auch in Sumpf- oder Reisfeldern. Im Flachwasserbereich wird es direkt mit einer Pipette beprobt.Das Wasser wird sorgfältig von der Bodenoberfläche entnommen, um den Boden nicht einzudämmen. Vergewissern Sie sich, dass die Wasserprobe Algen enthält. Die Algen, etwa 400 Mikrometer und mehr, werden direkt durch eine Schleife beobachtet.Bei kleinen Algen wird ein tragbares Mikroskop verwendet. Die Wasserprobe wird auf den Deckel einer Petrischale montiert und mit dem Körper bedeckt. Diese Methode verhindert, dass sich die Probe bewegt, und erleichtert die Beobachtung.An dieser Wasserprobe wird eine Isolierung von Algen durchgeführt. Wir stellen die Methode zur Herstellung einer Pipette vor, die für die Isolierung von einzelligen Algen aus Wasserproben verwendet wird. Wie man eine Pipette zur Isolierung herstellt.Zünde einen Alkoholbrenner an. Eine sterile Pasteur-Pipette auf der Flamme erhitzen. Nehmen Sie die Pipette von der Flamme und dehnen Sie sie.Schneiden Sie die Spitze der Pipette auf die richtige Länge ab. Achten Sie darauf, die Kapillare des Schmelzens zu entsorgen. Überprüfen Sie, ob die Flamme gelöscht ist.Um eine feine Pipette zur Isolierung herzustellen, sollten Sie darauf achten, dass die Flamme nicht flackert. Schärfen Sie die Flamme und schmelzen Sie die Pipette an der Spitze. Beim Dehnen solltest du darauf achten, dass die Pipette nicht auf der Flamme ist.Seht, der Bogenteil ist der feinste. Es ist ideal für die Spitze. Die Blasen der Pipette zeigen die Größe der Spitze an.Wählen Sie die richtige Größe für die zu isolierende Zelle aus. Gezeigt ist für die Zellbreite von 10 bis 20 Mikrometern. Es wird eine ausreichende Anzahl von Uhrengläsern vorbereitet, die zum Wiegen benötigt werden.Legen Sie das Medium auf ein Uhrglas. Isolieren Sie eine Zielzelle aus einer Wasserprobe, die vor Ort gesammelt wurde. Ein sehr feines Glasrohr nimmt durch Kapillarreaktion Wasser auf.Legen Sie das Glasrohr neben die Zelle, um es aufzunehmen. Isolieren Sie die Zelle vom Medium auf dem Uhrglas und übertragen Sie sie auf ein neues Uhrglas. Verwenden Sie eine neue Pipette, um die Zelle vom ersten Uhrglas in das zweite zu übertragen.Und noch eine Pipette zur dritten. Schließlich wird die isolierte Zelle in ein Reagenzglas überführt. Durch die Kultivierung dieses Reagenzglases wird die Zellvermehrung gefördert und ein Stamm etabliert.Die Kultur kann bei Erfolg in zwei Wochen grün werden. In dieser Studie isolierten wir 15 Zellen aus der Wasserprobe, die am See in Biwa, Japan, gesammelt wurde. Zwei Wochen später wurde in neun Reagenzgläsern grünes Sediment beobachtet, das mit einem roten Rahmen markiert war, was darauf hindeutete, dass die Zellreinigung der Algen im Gange war.Das Sediment wurde nur für die isolierten Zellen beobachtet, was zeigt, dass die Zellisolierung erfolgreich war. Dies ist unsere Methode, um einen einzigartigen Algenkulturstamm zu etablieren. Es ist möglich, einen axenischen Kulturstamm zu etablieren, wenn Sie eine Isolierung unter akzeptierten Bedingungen durchführen, z. B. in einem Lebensmittel.

establishment-of-a-clonal-culture-of-unicellular-conjugating-algae

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Algen Konjugation

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