Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische
June 14th, 2018
Das Ziel dieses Protokolls ist, hoher Integrität RNA-Proben von enterischen Ganglien isoliert von fixierten, frisch reseziert menschlichen Darmgewebe mit Laser Capture Microdissection (LCM) zu erhalten. Dieses Protokoll beinhaltet Probenvorbereitung Blitz eingefroren menschlichen Darmgewebe, Kryoschneiden, ethanolische Färbung und Dehydrierung, LCM, und RNA-Extraktion.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zum enterischen Nervensystem zu beantworten, wie z.B. das Expressionsprofil von enterischen Ganglien im Darm erwachsener Menschen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um hohe RNA-Ausbeuten aus menschlichen enterischen Ganglien zu erzielen und gleichzeitig die RNA-Qualität maximal zu erhalten. Beginnen Sie mit Darmgewebe, das in 20 Zentimeter Längen geschnitten wird.
Schneiden Sie zunächst das Fett- und Bindegewebe ab. Vermeiden Sie es, die Serosa einzukerben, da dies zu strukturellen Schäden am Plexus myentericus führen kann. Als nächstes wird ein Längsschnitt über die gesamte Länge der getrimmten Probe vorgenommen, vorzugsweise an der Stelle des mesenterialen Ansatzes.
Präparieren Sie dann die Taeniae coli aus dem Dickdarm, damit sich das Gewebe abflachen kann. Spreizen Sie nun den Darm mit der Schleimhautseite nach unten auf ein gekühltes Schneidebrett. Schneiden Sie dann 1,25 Zentimeter breite Streifen entlang der gesamten Länge des Gewebes.
Übertragen Sie jedes Stück während des Schneidens zur vorübergehenden Lagerung in eine gekühlte Gewebeaufbewahrungslösung. Schneiden Sie anschließend jeden Streifen in Segmente, die zwei bis 1,5 Zentimeter lang sind. Nachdem Sie einen Streifen in Segmente geschnitten haben, tupfen Sie die Segmente trocken.
Es ist wichtig, dass das Gewebe sehr trocken ist, damit sich beim Einfrieren keine Eiskristalle auf dem Gewebe bilden. Ordnen Sie nun die getrockneten Gewebestücke mit der Schleimhautseite nach oben auf einer kalten Einweg-Plastikform an. Glätten Sie dann jedes Stück mit einer gebogenen Pinzette, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
Das Gewebe dehnt sich aus, wenn es abgeflacht wird. Nachdem Sie die Gewebesegmente abgeflacht haben, beurteilen Sie ihre Dicke vor dem Einfrieren. Schieben Sie bei Bedarf die Ränder der Probe nach innen, bis sich die Darmprobe ihrer ursprünglichen Dicke annähert.
Übertragen Sie nun die beladene Grundform auf eine Aufschlämmung aus Trockeneis und 2-Methylbutan. Das Gewebe sollte innerhalb von 30 bis 60 Sekunden vollständig einfrieren. Trocknen Sie dann sofort den Boden der Form mit kalten Tüchern ab, die auf Trockeneis aufbewahrt wurden.
Überprüfen Sie nun die Probe. Achten Sie auf alle Proben, die nicht flach erscheinen. Wickeln Sie die Form anschließend in Aluminiumfolie ein, die vor der Verwendung voretikettiert und gekühlt wurde.
Decken Sie dann die Folie mit einer Schicht Plastikfolie ab, um die Austrocknung zu minimieren. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, bis sie bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden können. Nach der Vorbereitung der erforderlichen Materialien gießen Sie einen drei bis fünf Millimeter großen Haufen TFM auf einen großen Kryostaten-Probenhalter und überführen Sie die Darmprobe sofort mit der Seros-Seite nach oben auf das TFM.
Nach einigen Sekunden bei Raumtemperatur den Probenhalter auf Trockeneis umstellen und mit pulverisiertem Trockeneis bedecken. Stellen Sie vor dem Schneiden sicher, dass sich das TFM unterhalb der Ebene des Plexus myentericus befindet. Montieren Sie anschließend den Probenhalter in den Kryostaten-Probenkopf und richten Sie die Probe mit der Kryostat-Klinge aus.
Machen Sie die Ebene des Plexus myentericus parallel zur Schneidklinge. Machen Sie nun Acht-Mikrometer-Schnitte durch den Seros- und Längsmuskel, bis Sie den Plexus myentericus erreichen. Um den Plexus myentericus zu lokalisieren, montieren Sie eine Probe und färben Sie sie mit einem wässrigen Farbstoff, z. B. 1%Kristallviolett.
Um fortzufahren, identifizieren Sie die Verbindung zwischen der longitudinalen und der kreisförmigen Muskelschicht. Zu Beginn der Schnittung wird die Serosa durch das Vorhandensein von Bindegewebe gekennzeichnet. Entlang der Serosa kann auch etwas verbleibendes Mesenterialfett vorhanden sein.
Dann wird die Schicht der äußeren Längsmuskelschicht sichtbar. Ist die Grenze zwischen Längs- und Zirkularmuskulatur erreicht, wird ein Teil der enterischen Ganglien betrachtet. In den nächsten Abschnitten wird der Plexus myentericus sehr deutlich werden, wobei große Streifen von Ganglien in einem einzigen Abschnitt vorhanden sind. Sammeln Sie nun serielle Schnitte für die Laser-Capture-Mikrodissektion.
Kühlen Sie die PEN-Objektträger fünf bis 10 Sekunden lang im Kryostaten ab und verwenden Sie sie, um die Sektionen zu montieren. Die besten Abschnitte haben viele Neuronen und Glia. Fahren Sie nun mit dem Färben und Dehydrieren der Abschnitte fort, wie im Textprotokoll beschrieben.
Setzen Sie zur Vorbereitung eine Kartusche mit LCM-Kappen in den LCM-Mikroskoptisch ein. Laden Sie dann die Beispielfolie auf den Tisch und nehmen Sie ein Übersichtsbild der Folie auf. Identifizieren Sie die gewünschte Position für LCM und laden Sie eine Kappe auf den Objektträger.
Richten Sie dann den Infrarotlaser aus und stellen Sie die Leistung und Dauer des Lasers für einen Erfassungspunkt mit einem Durchmesser von 20 bis 30 Mikrometern ein. Skizzieren Sie als Nächstes die gewünschten Ganglien, die entnommen werden sollen. Achten Sie darauf, dass Sie innerhalb der Begrenzung des Sammelbereichs auf der Kappe bleiben, der als grüner Kreis angezeigt wird.
Für jedes der Ganglien, die durch eine UV-Schnittspur umrandet sind, stellen Sie die IR-Spots so ein, dass mindestens alle 100 bis 500 Mikrometer ein IR-Spot vorhanden ist, um sicherzustellen, dass alle Ganglien gesammelt werden, wenn die Kappe von der Probe abgenommen wird. Drücken Sie dann die Taste IR-UV-Schnitt, um mit der Sammlung aller markierten Ganglien fortzufahren. Sobald die Entnahme abgeschlossen ist, verschieben Sie die Kappe an einen neuen Ort und wiederholen Sie den Entnahmevorgang.
Dies kann 60 bis 80 Minuten lang wiederholt werden. Wenn die LCM-Kappe mit genügend Ganglien beladen ist, bringen Sie sie zu einer Qualitätskontrollstation. Wenn sich Schmutz auf der Kappe befindet, wischen Sie ihn mit einem feinen Pinsel ab, der für die Verwendung von RNA vorbereitet wurde.
Verwenden Sie eine Pipettenspitze für schwer zu entfernende Ablagerungen. Befestigen Sie dann die Kappe auf einem 0,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen, das mit 230 Mikrolitern RNA-Lysepuffer gefüllt ist. Drehen Sie die Kappe um, wirbeln Sie sie kurz vor und inkubieren Sie die Probe dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Später zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 5.000 g oder schneller und überführen Sie das Mikrofugenröhrchen dann in Trockeneis. Die Probe ist nun bereit für die RNA-Extraktion. Beim Ziehen von zwei Kappen enterischer Ganglien pro Probe wurde mehr als ein Nanogramm RNA erhalten, genug für RNA-Seq, und die RNA war von ausgezeichneter Qualität.
Die RNA-Integrität der gezeigten Probe beträgt 8,3. Es wurden auch Proben mit Integritätszahlen von 7,5 und 6,9 entnommen. Insgesamt waren mehr als 95% aller vorbereiteten Proben gut genug für RNA-Seq.
Die Qualität der RNA-Seq-Datensätze wurde mit Hilfe einer bioinformatischen Pipeline bewertet. Die Endverzerrung zeigt an, dass die Proben erfolgreich sequenziert wurden und nur eine bescheidene Vorspannung von drei Primzahlen aufwiesen. Ein Gen-Biotyp-Diagramm zeigt, dass die Sequenzierungsergebnisse weitgehend konsistent waren.
Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um biologische Replikate von RNA aus enterischen Ganglien von ausreichender Qualität und Quantität für RNA-Seq in nur acht bis 12 Stunden zu sammeln. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass die menschlichen Darmproben so flach wie möglich eingefroren werden. Dadurch wird sichergestellt, dass Sie sehr große Querschnitte von menschlichen enterischen Ganglien sammeln können, die schnell und einfach mit der Laser-Capture-Mikrodissektion bearbeitet werden können.
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Übersicht
Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Extraktion von RNA hoher Integrität aus enterischen Ganglien, die durch Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) aus frischreseziertem humanem Darmgewebe isoliert wurden. Die Methode zielt darauf ab, die Expressionsprofile des enterischen Nervensystems im menschlichen Darm zu untersuchen und unser Verständnis der neuralen Funktionen im Gastrointestinaltrakt zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Molekularbiologie
- Gastroenterologie
Hintergrund
- Das enterische Nervensystem spielt eine kritische Rolle für die Magen-Darm-Funktion.
- Hochwertige RNA ist für die Untersuchung von Genexpressionsprofilen unerlässlich.
- Die Laser-Capture-Mikrodissektion ermöglicht die präzise Isolation von Zellstrukturen.
- Diese Technik erleichtert detaillierte molekulare Analysen aus intaktem Gewebe.
Ziel der Studie
- Erzielung hoher Ausbeuten an RNA aus menschlichen enterischen Ganglien.
- Erhaltung der RNA-Qualität bei gleichzeitiger Minimierung von Gewebeschäden.
- Bewertung der Genexpressionsprofile im menschlichen enterischen Nervensystem.
Verwendete Methoden
- Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) von enterischen Ganglien aus menschlichen Gewebeproben.
- Frischreseziertes Darmgewebe wurde verarbeitet, um Ganglien zu isolieren.
- Kritische Schritte umfassten Kryoschnitte, Färbung und Dehydrierung.
- Die RNA-Extraktion folgte den LCM-Techniken, um eine hohe RNA-Integrität zu erzielen.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll lieferte über 1 Nanogramm hochwertige RNA für die Sequenzierung.
- Die RNA-Integritätszahlen wiesen auf eine ausgezeichnete RNA-Qualität hin, die für RNA-Seq geeignet ist.
- Mehr als 95% der Proben waren für Sequenzierungsanalysen ausreichend.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert eine effektive Methode zur Isolierung von RNA aus menschlichen enterischen Ganglien.
- Die Ergebnisse ermöglichen tiefere Einblicke in die molekularen Mechanismen des enterischen Nervensystems.
- Diese Methode hat Auswirkungen auf die Forschung zu gastrointestinalen Störungen und neuralen Funktionen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Laser-capture microdissection (LCM) enables precise isolation of enteric ganglia from human intestinal tissue, providing high-integrity RNA for transcriptomic analysis. This approach supports target validation in gastrointestinal neuroscience by delivering disease-relevant molecular data from primary human tissue. The method reduces biological noise and enhances predictive confidence in early discovery workflows focused on enteric nervous system pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure populations of enteric ganglia for RNA-seq analysis.
- Operational Value: Preserves RNA integrity while minimizing contamination from surrounding tissue layers.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through direct measurement of gene expression in disease-relevant human neural tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-quality RNA inputs suitable for reproducible transcriptomic assays.
- Operational Value: Uses PEN-membrane slides and ethanol-compatible dyes to improve capture efficiency and RNA yield.
- Scientific Value: Enables quantitative dependent variable measurements (e.g., RNA integrity number) for assay qualification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human tissue data that bridges discovery and preclinical validation.
- Operational Value: Yields sufficient RNA quantity (>1 ng per sample) for downstream sequencing applications.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by enabling profiling of enteric nervous system targets in human tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The LCM workflow fits within the discovery biology phase, enabling hypothesis testing and pathway clarification prior to lead identification. It generates quantitative molecular readouts that inform go/no-go decisions in target selection. The method produces reusable, standardized tissue preparations that support enterprise-scale screening campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by isolating pure neuronal populations for molecular profiling.
- Screening: Delivers standardized, high-integrity RNA samples enabling reliable compound effect measurements.
- Analytics: Provides RNA integrity number (RIN) and yield metrics to assess sample quality before sequencing.
- Translational Research: Connects human tissue data to preclinical models through conserved gene expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable protocol for isolating neural tissue across multiple tissue blocks and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, staining, and LCM parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid acquisition of human-validated molecular data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on human enteric nervous system expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cryosectioning, and laser-capture microdissection.
- Dependent on cryostat, LCM system, and RNA-compatible staining reagents (e.g., Cresyl Violet).
- Necessitates standardized protocols for tissue flattening, freezing, and section orientation.
- Must account for tissue variability across donors and intestinal regions when scaling.
- Limited by RNA degradation risks if samples are not processed rapidly or kept sufficiently dry.
