Name: Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Erfahren Sie die umfassende Nierenfunktionsanalyse bei Mausmodellen der glomerulären Erkrankung. Diese Methode ermöglicht funktionelle, strukturelle und mechanistische Untersuchungen der Glomerulus-Funktion.

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Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust und MRC unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick durchgeführt werden soll. Die entscheidenden Schritte in jeder Methode ermöglichen detaillierte funktionelle, strukturelle und mechanistischen Analyse der glomerulären Funktion, einschließlich der Beurteilung der Durchlässigkeit der Nieren als Ganzes (uACR und Plasma Kreatinin Messungen), die Durchlässigkeit der einzelne Glomeruli (glomerulären LpA / Vich), Prüfung der baulichen Veränderungen (PAS, Trichrome blau und EM), Protein-Lokalisierung (IF) und der glomerulären Genexpression (RT-PCR und Western blotting). Diese Methoden sind der Schlüssel für die vollständige Beurteilung der glomerulären Funktion in Mausmodellen Nierenerkrankung.
Bei der Beurteilung der Durchlässigkeit von der GFB haben viele Studien entschieden, um die herkömmliche uACR oder 24 h-Albumin Ausscheidung Rate als eine wirksame Maßnahme17,18zu verwenden. Obwohl diese Techniken der GFB Durchlässigkeit als Ganzes bewerten, erlaubt es nicht für einzelne glomeruläre Permeabilität Bewertung und Variation unter den Glomeruli. Frühere Studien haben gefunden, Messung der glomerulären LpA / V-i , ein empfindlicher Maß von Änderungen an der GFB Durchlässigkeit5,9. In der Tat in die repräsentativen Ergebnisse in diesem Beitrag gezeigt, bei 14 Wochen nach Induktion der VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b Mäuse haben einen deutlich geringeren uACR im Vergleich zu VEGF-A KO Mäusen; Dieses Ergebnis spiegelt sich jedoch nicht in der glomerulären LpA / Vich Messungen, wo VEGF-A165b deutlich verhinderte nicht erhöht in der GFB Durchlässigkeit (Abbildung 1 und Abbildung 2)5. Dies zeigt die Bedeutung des Einsatzes mehrerer Assays, um die Niere Durchlässigkeit und die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli zu beurteilen. Darüber hinaus die glomeruläre LpA / Vich Oncometric Assay deutet darauf hin, dass die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli aus der gleichen Niere kann stark variieren, insbesondere Krankheit Modelle5,10, 19. eine Einschränkung zur Messung der glomerulären LpA / Vich ist, dass es nur auf den experimentellen Endpunkt; durchgeführt werden kann So sind regelmäßige uACR Messungen erforderlich, um einen Hinweis auf den experimentellen Endpunkt geben.
Neben der Beurteilung des funktionellen Phänotyps, fördert das vorliegende Verfahren auch die Bewertung der strukturellen und Ultrastrukturforschung Phänotyp. Dies kann mit einer Auswahl an Flecken wie PAS, trichrome, und silbernen Flecken; jeweils zu verschiedene Aspekten der glomerulären Morphologie zu beurteilen. In akuten Modellen der glomeruläre Erkrankung, die oft in Maus-Modellen der Fall ist, ist schwierig sein kann, großen strukturelle Anomalien diese Flecken zu verwenden, es sei denn, du eine ausgebildete renal Pathologen bist zu erkennen. Daher wird EM Durchführung vorgeschlagen, um die Ultrastruktur der GFB ermöglicht die quantitative Messung von Parametern wie der GBM, endotheliale Augenhöhlen Größe und Anzahl und hemolytic Merkmale zu beurteilen. Solche Messungen erfordern minimale Schulung durchzuführen und ermöglicht die Ermittler zu bestimmen, die Zelle-Typen/Strukturen in ein Krankheitsmodell betroffen. Im Beispiel in die repräsentativen Ergebnisse die VEGF-A KO Maus fand ein mildes Modell der glomerulären Erkrankung sein waren somit keine großen strukturellen Anomalien auf PAS Färbung. Hemolytic-spezifische VEGF-A KO jedoch Änderungen an der GBM, Podocytes und Endothelzellen auslösen, bei der Prüfung der glomerulären Ultra-Struktur5. Die Vorbereitung der Niere für die EM in dem vorliegenden Verfahren beschrieben aktivieren leider nicht Erkennung von endothelialen Glycocalyx, die auch bekannt ist, mit erheblichen Auswirkungen auf die Durchlässigkeit des GFB19. Um die Glycocalyx Tiefe genau zu messen, sollte die Niere mit 2,5 % Glutaraldehyd mit 1 % Alcian blau zur Kennzeichnung von endothelialen Glycocalyx durchspülen-fixiert sein Oltean Et Al19beschrieben.
Sobald der funktionelle und strukturelle Phänotyp beurteilt wurden, können der Ausdruck/Aktivierungsmuster von verschiedenen Genen und Wege dann gezielt in den Glomeruli beurteilt werden. Ultra-strukturellen Bewertung könnte einige Informationen über die Zelle Arten/glomeruläre Strukturen beteiligt, gibt an, ob hemolytic oder Endothel-spezifische Gene/Wege geprüft werden sollte. Beispielsweise wurde eine Verringerung der Zahl der endothelialen Augenhöhlen in die repräsentativen Ergebnisse von den VEGF-A KO-Mäusen (Abbildung 3D) beobachtet; Daher wurde der glomerulären Protein-Expression eine endotheliale Marker bekannt, in dem VEGF-A Weg einbezogen untersucht; VEGFR-2 (Abbildung 4 b)5. Neben der Expression von Proteinen in den Glomeruli kann ihre Lokalisierung auch mit wenn visualisiert werden. In einer Studie von Zhang Et Al20wurde hemolytic-spezifische Überexpression des GLUT1 in der Podocytes von bestätigt, wenn die erhöhte GLUT1 mit Podocin Co lokalisieren.
Im Vergleich zu alternativen Methoden in der Literatur zur Beurteilung der glomerulären Funktion vorgestellt ermöglicht den Einsatz der Methode skizziert in diesem Papier auf die Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung den glomerulären Phänotyp aus vollständig ausgewertet werden mehrere Aspekte. Mithilfe dieser Methode kann der Forscher den Niere Phänotyp des Modells ermittelt und bewertet den Mechanismus, warum der Phänotyp entwickelt. Diese wichtigen Informationen über den Mechanismus der Krankheit ist erforderlich, wenn mögliche therapeutische Wege in diesen Modellen untersucht. Diese Methode kann leicht auf zukünftige Untersuchungen glomerulären Funktion bei der Bewertung von Krankheit Phänotypen und mögliche Therapie angewendet werden.
Abschließend beschreibt diese generischen und anpassungsfähige Protokoll einen vollständige Niere Work-Up für Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick abgerufen werden. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

Die Verwendung von murinen Modellen um menschliche Nierenerkrankung zu imitieren ist immer häufiger. Solchen murinen Modellen gehören spontane Modelle wie spontan Hypertensive Ratten (SHR)1, Streptozocin (STZ)-induzierte diabetischen Ratten und Mäuse2und die Db/Db Typ II diabetischen Mäusen3, gentechnisch hergestellten Modelle wie primäre hemolytic-spezifische fokal segmentale glomeruläre Sklerose (FSGS) Modelle4, den hemolytic-spezifische vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF-A) Knock Out (VEGF-A KO) Modell5, und Alport-Syndrom6Modelle und erworben Modelle wie die 5/6 Nephrektomie7 und die einseitige Harnleiter Obstruktion (UUO) Modell8. Bei der Beurteilung der verschiedenen Aspekte der glomerulären Funktion in diesen Modellen stehen verschiedene Techniken zur Verfügung. Diese Methode Papier soll eine umfassende Aufarbeitung zu demonstrieren, die in Mausmodellen der Nierenerkrankung durchgeführt werden sollte, um der glomerulären Funktion umfassend zu bewerten.
Die Gründe für die Verwendung dieser Methode ist, dass es den glomerulären Phänotyp vollständig unter mehreren Gesichtspunkten ausgewertet werden kann. Dabei bewerten die glomeruläre Permeabilität, Protein und Wasser, die glomeruläre strukturelle Anomalien und Änderungen in den Ausdruck/Spleißen von mRNAs und Proteinen für normale glomerulären Funktion wesentlich. Mithilfe dieser Methode kann der Forscher den Niere Phänotyp des Modells ermittelt und bewertet den Mechanismus, warum der Phänotyp entwickelt. Dies ist wichtige Informationen über den Mechanismus der Krankheit, die erforderlich ist, wenn mögliche therapeutische Wege in diesen Modellen untersucht.
In der Literatur ist es ein gemeinsames Auftreten mit einem Maus-Modell der glomerulären Erkrankung vorgestellt werden wobei der Phänotyp durch ein erhöhtes Maß an Albumin im Urin bestimmt wird. Allerdings gibt es Hinweise darauf, dass eine einzelne Methode zur Bestimmung der glomerulären Funktion nicht immer wirksam ist; Messung der Harn Albumin-Ausscheidung Rate oder der Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis (uACR) informiert nur auf die gesamte Nierenfunktion, und nicht der einzelne Glomeruli. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Durchlässigkeit in verschiedenen Glomeruli aus den gleichen Niere5,9,10variieren kann. Darüber hinaus beurteilt die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli ein empfindlicher Weise zur Beurteilung der glomerulären Funktion; die Technik zur Messung der individuellen glomerulären Wasserdurchlässigkeit (LpA / Vich) hat gezeigt, dass empfindlicher auf Veränderungen in der glomerulären Funktion werden als bei der Messung der uACR9. Dieser Assay ist vorteilhaft in Mausmodellen, Proteinurie, wie Sie auf einem Hintergrund c57BL/611resistent sind. Der Vorteil des vorliegenden Papiers Methode ist, dass es sowohl die total renal Durchlässigkeit an Albumin als auch die einzelnen glomeruläre Permeabilität für Wasser untersucht.
Prüfung der glomerulären strukturelle Anomalien wird oft durch eine Batterie von Flecken wie Perjodsäure Schiff (PAS), trichrome, und Silber Flecken beurteilt. Diese ermöglichen eine ausgebildete renal Pathologe, das Niveau der Nierenerkrankung über ein scoring-Methode zu bewerten. Obwohl alle gute Methoden, Veränderungen der glomerulären Makro-Struktur in nicht immer eingehalten werden Modelle akuten Nierenversagens Verletzungen12. Diese Methode schlägt vor, dass neben der Durchführung der oben beschriebenen renal Histologie-Techniken, die glomeruläre Ultra-Struktur auch über Elektronenmikroskopie (EM) zu beurteilen. Gefärbten Glomerulus kann unter einem normalen Lichtmikroskop relativ normal aussehen; jedoch wird bei der Bewertung mit EM, kleine Änderungen in der glomerulären Basalmembran (GBM) Breite hemolytic Fuß Prozess Auslöschung, endotheliale Fenestrationen und die Sub-hemolytic Raum Berichterstattung analysiert. Daher ist es wichtig, dass die glomeruläre Ultra-Struktur und die Mikro-Struktur wird bewertet, um den Mechanismus der glomerulären Dysfunktion zu bestimmen.
Neben der Beurteilung der glomerulären struktureller Anomalien, sollten Änderungen in mRNA und Protein-Expression und Spleißen, sowie Protein-Aktivierung (z.B. Phosphorylierung), untersucht werden, um die Mechanismen der glomerulären Erkrankungen weiter aufzuklären. Bei der Betrachtung der glomerulären Erkrankung oder z. B. beim KO/over-expressing ein Gen gezielt in glomerulären Zellen, z. B. in der hemolytic-spezifische VEGF-A KO Maus5, es wichtig ist, dass die Protein- und mRNA-Änderungen nur innen geprüft werden die glomeruläre Zellen, und nicht die ganze Niere. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Glomeruli sind isoliert von der Maus Niere Kortex, und dann die Protein/RNA isoliert sind. Dadurch können spezifische Analyse von Protein/mRNA Dysregulation in der Glomeruli das Krankheitsmodell.
Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick durchgeführt werden soll. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>Metabolische Käfige</td><td>Harvard Apparatur</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Tris gepufferte Kochsalzlösung (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Mausalbumin ELISA Quantifizierungsset</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA Substratlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano oder gleichwertige</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater Stabilisierungslösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15% vorgefertigtes Proteingel</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli Probenpuffer</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Zelle</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris Laufpuffer</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue Farbstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Kreatinin Begleiter</td><td>Exocell</td><td>1012 Strip Plate</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacodylat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Blutentnahmeröhrchen</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G Nadel</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Glasfläschchen</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml Polypropylen-Röhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Röhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Gewebeformen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr> Maus <tr><td>Chirurgisches Dissektionsset</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>Optimales Schneidmedium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillarrohre</td><td>Harvard Apparatus</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>Glomerular Permeability</td><td>Rig Built at the University of Bristol - nicht kommerziell erhältlich</td><td>Zitation des LpA-Rigs: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlsiebe</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>Periodisches Säure-Schiff (PAS) Färbesystem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Objektträger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxidlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Aradite Resin</td><td>Agar Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Bleicitrat</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>z.B. 957000H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophober Stift</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin (1243-1256) Antikörper</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Podocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Sekundärer Antikörper</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40 Zelllysepuffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease und Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x Transfer Puffer</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>HRP-konjugierte Sekundärantikörper</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>ECF-Substrat für Western Blotting</td><td>Fisher</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transkriptase</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuklease-Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Wasser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzlicht-Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J Analysesoftware</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Mikroskop</td><td>Britannica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beurteilung der nierenfunktion in mausmodellen der glomerulären erkrankung

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Die Verwendung von murinen Modellen um menschliche Nierenerkrankung zu imitieren ist immer häufiger. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Beurteilung der glomerulären Funktion bei diabetischer Nephropathie und hemolytic-spezifische VEGF-A Knock-out-Mäusen; Dieses Protokoll beschreibt daher die vollständige Niere Aufarbeitung in unserem Labor verwendet werden, um diese Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick zu bewerten. Im Vergleich zu alternativen Methoden in der Literatur zur Beurteilung der glomerulären Funktion vorgestellt ermöglicht die Nutzung der in diesem Artikel beschriebene Methode den glomerulären Phänotyp vollständig unter mehreren Gesichtspunkten ausgewertet werden. Mithilfe dieser Methode kann der Forscher den Niere Phänotyp des Modells ermitteln und bewerten den Mechanismus, warum der Phänotyp entwickelt. Diese wichtigen Informationen über den Mechanismus der Krankheit ist erforderlich, wenn mögliche therapeutische Wege in diesen Modellen untersucht. Die Methoden können detaillierte funktionale Bewertung der glomerulären Filtration Barriere durch Messung der Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis und individuelle glomerulären Wasserdurchlässigkeit sowie Struktur- und Ultra-strukturelle Prüfung mit Hilfe der Perjodsäure Schiff Fleck und Elektronenmikroskopie. Darüber hinaus ermöglicht die Analyse von Genen Dysregulated Ebene der mRNA und Protein mechanistischen Analyse der glomerulären Funktion. Dieses Protokoll beschreibt die generische aber anpassungsfähigeren Methoden, die alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden können.

Urin wurde gesammelt, mit metabolischen Käfige aus Wildtyp (WT), induzierbaren hemolytic-spezifische VEGF-A Knock-out (VEGF-A KO) und VEGF-A KO X Neph-VEGF165b Mäuse (VEGF-A KO Mäusen, die die menschlichen VEGF-A165b Isoform in der Podocytes in over Ausdrücken ein konstitutiven Weise). Bei der Messung der Harn Albumin Kreatinin Ratio 0, 4, 10 und 14 Wochen nach Doxycyclin Induktion der VEGF-A KO entwickelt VEGF-A KO Mäusen progressive Albuminurie von 10 Wochen im Vergleich zum WT stellt Steuerelemente. Die absoluten Werte sehen in Abbildung 2Aund normalisierte die Grundlinie jeder Maus-Werte in Abbildung 2 b. Albuminurie in beobachtet nicht in die VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäuse (Abbildung 2), ist jedoch darauf hinweist, dass VEGF-A165b schützende im Modell der Albuminurie5.
Die glomeruläre LpAVich wurde in einzelne Glomeruli gesiebt von WT VEGF-A KO und VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Nieren gemessen. Ein Beispiel dafür wie ein Glomerulus gefangen ist und die Schrumpfung beobachtet, wenn Perifused mit 8 % BSA in Abbildung 3Aangezeigt wird. Diese Schrumpfung dient dann zur Bestimmung der glomerulären LpA / Vich für jedes Glomerulus (Abb. 3 b). VEGF-A KO Mäuse hatten eine signifikant erhöhte glomeruläre LpA / Vich bei 14 Wochen post VEGF-KO Induktion im Vergleich zu WT Kontrolle Glomeruli. Obwohl niedriger in VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäuse, die erhöhte glomeruläre LpA / Vich nicht durch Überexpression des VEGF-A165b bei 14 Wochen5verhindert wurde.
PAS Färbung der Niere Kortex Abschnitte 14 Wochen nach Induktion der VEGF-A KO ergab glomerulären strukturelle Anomalien in der VEGF-A KO oder VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäuse (Abb. 4A). Jedoch bei der Analyse der glomerulären Ultra-Struktur über EM VEGF-A KO Mäusen hatte entwickelt eine erhöhte GBM-Breite, verringerte Zahl der endothelialen Augenhöhlen SPS Abdeckung abgenommen und erhöhte durchschnittliche hemolytic Schnittbreite (Abbildung 4-4F ). Die durchschnittliche hemolytic Fuß verarbeiten Breite und Anzahl der Schlitze blieb unverändert (Abb. 3 b und 3 G). Überexpression des VEGF-A165b in den VEGF-A KO-Mäusen verhinderte die Änderungen an der GBM und Schnittbreite (Abbildung 4 und 4F). VEGF-A165b hatte jedoch keinen Einfluss auf die veränderten Augenhöhlen Anzahl und SPS Abdeckung (Abbildung 4 und 4E)5.
RT-PCR durchgeführt auf RNA aus gesiebten Glomeruli extrahiert ergab, dass die menschliche VEGF-A165b mRNA nur in die VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b Mäuse (Abbildung 5A) vorhanden ist. Beim Extrahieren von Protein aus gesiebten Glomeruli und Beurteilung der Ebenen von Proteinen über westliche Beflecken, der glomerulären Protein-Expression des VEGFR-2 erwies sich als VEGF-A KO Mäusen verringert werden die Überexpression des VEGF-A165b ( verhinderte Abbildung 5 b 5 c)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Abbildung 1. Schematische Aufbau die glomeruläre Permeabilität (LpA) Rig. (A) der Glomerulus ist gefangen auf (B) die Mikropipette in einem Halter mit Absaugung, die auf eine Halterung für Stabilität aufgespannt ist. (C) rechteckige Objektträger. (D) 4 X Objektiv des Mikroskops mit einer Videokamera. (E) 1 % BSA Lösung auf 37 ° c erwärmt (F) 8 % BSA Lösung auf 37 ° c erwärmt (G) Fernbedienung, tippen Sie auf Lager Perifusate-haltigen zweizeilig, schnelle Perifusate Austausch ermöglicht. (H) Route des Perifusate in Richtung der Objektträger, die dann den Glomerulus badet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Abbildung 2: Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis. (A) die uACR Werte auf 0, 4, 10 und 14 Wochen nach Induktion der VEGF-A KO bei WT, VEGF-A KO und VEGF-A X Neph-VEGF-A165b-Mäusen. (B) die gleichen uACR Werte normiert auf den Ausgangswert (Woche 0) von jedem einzelnen Mausklick. Die uACR deutlich erhöht bei VEGF-A KO Mäusen in den Wochen 10 und 14 im Vergleich zur WT stellt Steuerelemente, die in den VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäusen verhindert wurde (* p &lt; 0,05; Zwei-Wege-ANOVA, Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 4-12 Mäuse pro Zeitpunkt; Fehlerindikatoren: Standardfehler des Mittelwerts [SEM]). Diese Zahl wurde von Stevens Et al.5geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Abbildung 3. Messung der glomerulären Wasserdurchlässigkeit. (A) der Glomerulus ist gefangen auf die Mikropipette über Absaugung; die Perifusate von 1 % BSA (Ai), 8 % BSA (Aii) umgeschaltet, und glomerulären Schrumpfung wird beobachtet. (B) Messungen vor und nach dem 8 % BSA Schalter sind zur Ermittlung der glomerulären LpA / Vich. (C) VEGF-A KO Mäuse entwickeln eine erhöhte glomeruläre LpA / Vich bei 14 Wochen post Induktion von VEGF-A KO im Vergleich zu WT Kontrollen. Dies verhinderte nicht deutlich in VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäuse (* p &lt; 0,05; One way ANOVA, Bonferroni-Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 4-9 Mäuse, 15-30 Glomeruli; Fehlerindikatoren: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Abbildung 4. Glomeruläre Strukturanalyse. (A) PAS Färbung der Rinde der Niere keinen Hinweis auf eine strukturellen Anomalien in den Glomeruli von WT, VEGF-A KO und VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäusen (Ai - Iii). EM offenbart Ultra-strukturelle Anomalien in der VEGF-A KO Glomeruli (Aiv - vi). (B) die durchschnittliche FPW änderte sich nicht zwischen den Gruppen. (C) der GBM erhöht in der VEGF-A KO Glomeruli, die verhinderte VEGF-A165b (D) , die die Anzahl der Augenhöhlen in VEGF-A KO Glomeruli zurückgegangen war die von VEGF-A165B. (E) der SPS Abdeckung unverändert war in VEGF-A KO Glomeruli, die auch von VEGF-A165b. (F) unverändert die durchschnittliche Schnittbreite im VEGF-A KO Glomeruli erhöht blieb wurde verringert, die durch VEGF-A165b. (G) die Schlitz-Nummer verhindert wurde blieb unverändert zwischen den drei Gruppen (* p &lt; 0,05; One way ANOVA, Bonferroni-Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 3 Mäuse, 9 Glomeruli; Fehlerindikatoren: SEM). Diese Zahl wurde von Stevens Et al.5geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Abbildung 5. mRNA und Protein-Expression von Markern. (A) RT-PCR ergab, dass menschliche VEGF-A165b mRNA Ausdruck nur in den gesiebten Glomeruli von VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b Mäusen zeigte. (B) Western blotting darauf hingewiesen, dass VEGFR-2-Protein-Expression in VEGF-A KO Glomeruli nach unten geregelt war, wurde in VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b Glomeruli verhindert (* p &lt; 0,05; One way ANOVA, Bonferroni-Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 3 - 6 Mäuse; Fehlerindikatoren: SEM). Diese Zahl wurde von Stevens Et al.5geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung durchgeführt werden soll. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der glomerulären Erkrankungen bezüglich des funktionellen und strukturellen Phänotyps des Glomerulus zu beantworten und ermöglicht die mechanistische Analyse der Nierenpathologie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie an alle bewerteten Modelle der glomerulären Erkrankung angepasst werden kann. Zur Beurteilung des Albumin-Kreatinin-Verhältnisses im Urin setzen Sie eine sechs bis acht Wochen alte männliche Maus in einen metabolischen Mauskäfig mit Wasser und Anreicherungsfutter in einem ruhigen Raum.Bringen Sie die Maus nach sechs Stunden wieder in ihr normales Gehäuse und entnehmen Sie mindestens 50 Mikroliter der Urinprobe aus jedem Käfig, wobei Sie die Urinentnahme von einmal wöchentlich bis einmal monatlich wiederholen. Am experimentellen Endpunkt entnehmen Sie die Nieren aus dem Bauch jedes Tieres und waschen Sie die Organe in eiskaltem PBS. Um die kortikalen Glomeruli zu untersuchen, entfernen und würfeln Sie einen Pol der Nierenrinde in ein Kubikmillimeter Stück.Um die tiefen juxtamedullären Glomeruli zu untersuchen, entfernen und würfeln Sie einen kleinen Abschnitt der Medulla in ein Kubikmillimeter-Stück. Geben Sie dann die Fragmente aus jedem Gewebeabschnitt in einzelne Elektronenmikroskopie-Fläschchen mit fünf Millilitern 2,5%iger Glutaraldehydlösung und lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius. Für die Histologie der kortikalen und juxtamedullären Glomeruli wird das obere Drittel der Niere entnommen und 24 Stunden lang in fünf Millilitern 4%iger Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius fixiert.Übertragen Sie dann das fixierte Gewebe 24 Stunden lang in fünf Milliliter 70%iges Ethanol, bevor Sie es in Paraffin einbetten. Für die immunfluorchemische Analyse der kortikalen und medullären Glomeruli legen Sie ein Drittel der Niere in eine Gewebeform und tauchen Sie das Gewebe in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur. Legen Sie dann die Form auf Trockeneis, bis die Verbindung gefroren ist, und lagern Sie die Proben bei 80 Grad Celsius, bis sie geschnitten werden.Für die Proteinanalyse geben Sie drei mal zwei Kubikmillimeter große Stücke der Nierenrinde in 0,5-Milliliter-Plastikröhrchen und frieren die Proben in flüssigem Stickstoff ein, um sie bei 80 Grad Celsius zu lagern. Für die Langzeitlagerung von Gewebe für die RNA-Analyse fügen Sie nach dem soeben gezeigten Einfrieren von drei mal zwei Kubikmillimetern Nierenstücken fünf Volumen RNase-Stabilisierungslösung für eine Lagerung bei 80 Grad Celsius hinzu. Für die Glomeruli-Isolierung schneiden Sie das restliche Nierengewebe in Scheiben und legen Sie die Gewebestücke in fünf Milliliter Säugetierringerlösung, die mit 1 % Rinderserumalbumin oder BSA ergänzt ist, auf Eis, um sofort zu sieben.Um die Glomeruli zu isolieren, stapeln Sie Siebe mit aufsteigender Porengröße im Mikrometerbereich auf ein Becherglas und legen Sie die Nierenscheiben auf das obere Sieb mit einer Porengröße von 425 Mikrometern. Verwenden Sie anschließend einen Spritzenkolben und eine frische, eiskalte Säugetierringerlösung, die mit 1% BSA ergänzt ist, um das Nierengewebe durch das erste Sieb zu zerdrücken. Während die Nierenstücke durchgedrückt sind, entfernen Sie das obere Sieb und schieben Sie die Nierenfragmente nacheinander durch jedes Sieb.Wenn nur noch die 100- und 70-Mikron-Siebe übrig sind, wird die glomeruläre Ernte, die von den letzten beiden Sieben zurückgehalten wird, in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern frischer Säugetierringerlösung gegeben, die mit 1%BSA auf Eis ergänzt wird. Drei Milliliter der Glomeruli-Suspension werden auf zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt und die Glomeruli durch Zentrifugation pelletiert. Nach dem Entfernen des Überstands frieren Sie die Glomeruli in flüssigem Stickstoff ein, um sie bei 80 Grad Celsius für die spätere Protein- und RNA-Extraktion zu lagern.Geben Sie dann die restliche Glomeruli-Lösung in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und injizieren Sie sie in ein glomeruläres Wasserdurchlässigkeitsrigg auf einem Lichtmikroskoptisch. Nach der Erfassung eines intakten, individuellen Glomerulus befreien Sie eine Bowman-Kapsel und röhrenförmige Fragmente mit einer Mikropipette, beginnen Sie mit der Aufzeichnung und perfundieren Sie den Glomerulus mit frischer Ringerlösung, die mit 1 % BSA ergänzt wird. Schalten Sie das Perfusat nach 30 Sekunden auf eine konzentrierte 8%ige BSA-Ringerlösung um.Schalten Sie das Perfusat nach 10 Sekunden Perfusion wieder auf 1%BSA-Klingellösung um und stoppen Sie die Aufnahme. Für eine detaillierte Visualisierung der glomerulären Zellen und der Restmatrix trocknen Sie die fixierten, in Paraffin eingebetteten Nierenrindenproben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer Entparaffinisierung mit aufeinanderfolgenden Xylol- und absteigenden Ethanol-Immersionen. Rehydrieren Sie die Proben fünf Minuten lang in destilliertem Wasser und inkubieren Sie die Objektträger in periodischer saurer Lösung in einem Abzug.Spülen Sie die Objektträger nach fünf Minuten mit drei fünfminütigen Wäschen in 100 Millilitern destilliertem Wasser, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation in Schiff's Reagenz. Waschen Sie die Objektträger am Ende der Inkubation fünf Minuten lang in fließendem Leitungswasser und behandeln Sie sie drei Sekunden lang mit Hämatoxylin, bevor Sie sie weitere 15 Minuten lang gründlich unter fließendem Leitungswasser abspülen. Dehydrieren Sie dann die Objektträger mit aufsteigenden Ethanol-Immersionen und zwei aufeinanderfolgenden dreiminütigen Xylol-Immersionen.Nach der Lufttrocknung können die Objektträger mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis montiert werden, um ihre glomeruläre Struktur auf einem Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung zu beurteilen. Knockout-Mäuse mit vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF-A) entwickeln im Vergleich zu Wildtyp-Wurfgattenkontrollen eine progressive Albuminurie um 10 Wochen, während VEGF165b-überexprimierende Knockout-Tiere vor dieser Erkrankung geschützt sind. VEGF-A-Knockout-Mäuse haben im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen eine signifikant erhöhte glomeruläre Wasserpermeabilität, die teilweise durch VEGF-A165b-Überexpression gerettet wird.Die periodische saure Schiff-Färbung von Nierenrindenschnitten in VEGF-A-Knockout-Mäusen zeigt in der lichtmikroskopischen Analyse keine glomerulären strukturellen Anomalien. Bei elektronenmikroskopischer Analyse zeigten die Knockout-Mäuse jedoch eine erhöhte Breite der glomerulären Basalmembran, eine verringerte Anzahl von endothelialen Fenestren, eine verringerte Subpodozytenraumabdeckung und eine erhöhte durchschnittliche Podozytenspaltbreite, während die durchschnittliche Anzahl der Schlitze unverändert blieb. Die Überexpression von VEGF165b in den VEGF-A-Knockout-Tieren rettet die Veränderungen der glomerulären Basalmembran und der Schlitzbreite.Die Überexpression von VEGF165b hat jedoch keinen Einfluss auf die veränderten Fenestralzahlen oder die Subpodozytenraumabdeckung. RNA, die aus gesiebten Glomeruli extrahiert wurde, bestätigt die humane VEGF165b-mRNA-Expression in den VEGF165b-überexprimierenden Knockout-Mäusen, was mit einer verminderten Expression von VEGFR2 in den VEGF-A-Knockout-Mäusen korreliert, die durch die VEGF165b-Überexpression im Knock-Tier gerettet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine vollständige Nierenuntersuchung für die Bewertung eines Mausmodells der glomerulären Erkrankung durchführen können, einschließlich einer Beurteilung der glomerulären Permeabilität sowohl für Albumin als auch für Wasser.

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