Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der glomerulären Erkrankungen bezüglich des funktionellen und strukturellen Phänotyps des Glomerulus zu beantworten und ermöglicht die mechanistische Analyse der Nierenpathologie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie an alle bewerteten Modelle der glomerulären Erkrankung angepasst werden kann. Zur Beurteilung des Albumin-Kreatinin-Verhältnisses im Urin setzen Sie eine sechs bis acht Wochen alte männliche Maus in einen metabolischen Mauskäfig mit Wasser und Anreicherungsfutter in einem ruhigen Raum.

Bringen Sie die Maus nach sechs Stunden wieder in ihr normales Gehäuse und entnehmen Sie mindestens 50 Mikroliter der Urinprobe aus jedem Käfig, wobei Sie die Urinentnahme von einmal wöchentlich bis einmal monatlich wiederholen. Am experimentellen Endpunkt entnehmen Sie die Nieren aus dem Bauch jedes Tieres und waschen Sie die Organe in eiskaltem PBS. Um die kortikalen Glomeruli zu untersuchen, entfernen und würfeln Sie einen Pol der Nierenrinde in ein Kubikmillimeter Stück.

Um die tiefen juxtamedullären Glomeruli zu untersuchen, entfernen und würfeln Sie einen kleinen Abschnitt der Medulla in ein Kubikmillimeter-Stück. Geben Sie dann die Fragmente aus jedem Gewebeabschnitt in einzelne Elektronenmikroskopie-Fläschchen mit fünf Millilitern 2,5%iger Glutaraldehydlösung und lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius. Für die Histologie der kortikalen und juxtamedullären Glomeruli wird das obere Drittel der Niere entnommen und 24 Stunden lang in fünf Millilitern 4%iger Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius fixiert.

Übertragen Sie dann das fixierte Gewebe 24 Stunden lang in fünf Milliliter 70%iges Ethanol, bevor Sie es in Paraffin einbetten. Für die immunfluorchemische Analyse der kortikalen und medullären Glomeruli legen Sie ein Drittel der Niere in eine Gewebeform und tauchen Sie das Gewebe in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur. Legen Sie dann die Form auf Trockeneis, bis die Verbindung gefroren ist, und lagern Sie die Proben bei 80 Grad Celsius, bis sie geschnitten werden.

Für die Proteinanalyse geben Sie drei mal zwei Kubikmillimeter große Stücke der Nierenrinde in 0,5-Milliliter-Plastikröhrchen und frieren die Proben in flüssigem Stickstoff ein, um sie bei 80 Grad Celsius zu lagern. Für die Langzeitlagerung von Gewebe für die RNA-Analyse fügen Sie nach dem soeben gezeigten Einfrieren von drei mal zwei Kubikmillimetern Nierenstücken fünf Volumen RNase-Stabilisierungslösung für eine Lagerung bei 80 Grad Celsius hinzu. Für die Glomeruli-Isolierung schneiden Sie das restliche Nierengewebe in Scheiben und legen Sie die Gewebestücke in fünf Milliliter Säugetierringerlösung, die mit 1 % Rinderserumalbumin oder BSA ergänzt ist, auf Eis, um sofort zu sieben.

Um die Glomeruli zu isolieren, stapeln Sie Siebe mit aufsteigender Porengröße im Mikrometerbereich auf ein Becherglas und legen Sie die Nierenscheiben auf das obere Sieb mit einer Porengröße von 425 Mikrometern. Verwenden Sie anschließend einen Spritzenkolben und eine frische, eiskalte Säugetierringerlösung, die mit 1% BSA ergänzt ist, um das Nierengewebe durch das erste Sieb zu zerdrücken. Während die Nierenstücke durchgedrückt sind, entfernen Sie das obere Sieb und schieben Sie die Nierenfragmente nacheinander durch jedes Sieb.

Wenn nur noch die 100- und 70-Mikron-Siebe übrig sind, wird die glomeruläre Ernte, die von den letzten beiden Sieben zurückgehalten wird, in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern frischer Säugetierringerlösung gegeben, die mit 1%BSA auf Eis ergänzt wird. Drei Milliliter der Glomeruli-Suspension werden auf zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt und die Glomeruli durch Zentrifugation pelletiert. Nach dem Entfernen des Überstands frieren Sie die Glomeruli in flüssigem Stickstoff ein, um sie bei 80 Grad Celsius für die spätere Protein- und RNA-Extraktion zu lagern.

Geben Sie dann die restliche Glomeruli-Lösung in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und injizieren Sie sie in ein glomeruläres Wasserdurchlässigkeitsrigg auf einem Lichtmikroskoptisch. Nach der Erfassung eines intakten, individuellen Glomerulus befreien Sie eine Bowman-Kapsel und röhrenförmige Fragmente mit einer Mikropipette, beginnen Sie mit der Aufzeichnung und perfundieren Sie den Glomerulus mit frischer Ringerlösung, die mit 1 % BSA ergänzt wird. Schalten Sie das Perfusat nach 30 Sekunden auf eine konzentrierte 8%ige BSA-Ringerlösung um.

Schalten Sie das Perfusat nach 10 Sekunden Perfusion wieder auf 1%BSA-Klingellösung um und stoppen Sie die Aufnahme. Für eine detaillierte Visualisierung der glomerulären Zellen und der Restmatrix trocknen Sie die fixierten, in Paraffin eingebetteten Nierenrindenproben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer Entparaffinisierung mit aufeinanderfolgenden Xylol- und absteigenden Ethanol-Immersionen. Rehydrieren Sie die Proben fünf Minuten lang in destilliertem Wasser und inkubieren Sie die Objektträger in periodischer saurer Lösung in einem Abzug.

Spülen Sie die Objektträger nach fünf Minuten mit drei fünfminütigen Wäschen in 100 Millilitern destilliertem Wasser, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation in Schiff's Reagenz. Waschen Sie die Objektträger am Ende der Inkubation fünf Minuten lang in fließendem Leitungswasser und behandeln Sie sie drei Sekunden lang mit Hämatoxylin, bevor Sie sie weitere 15 Minuten lang gründlich unter fließendem Leitungswasser abspülen. Dehydrieren Sie dann die Objektträger mit aufsteigenden Ethanol-Immersionen und zwei aufeinanderfolgenden dreiminütigen Xylol-Immersionen.

Nach der Lufttrocknung können die Objektträger mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis montiert werden, um ihre glomeruläre Struktur auf einem Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung zu beurteilen. Knockout-Mäuse mit vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF-A) entwickeln im Vergleich zu Wildtyp-Wurfgattenkontrollen eine progressive Albuminurie um 10 Wochen, während VEGF165b-überexprimierende Knockout-Tiere vor dieser Erkrankung geschützt sind. VEGF-A-Knockout-Mäuse haben im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen eine signifikant erhöhte glomeruläre Wasserpermeabilität, die teilweise durch VEGF-A165b-Überexpression gerettet wird.

Die periodische saure Schiff-Färbung von Nierenrindenschnitten in VEGF-A-Knockout-Mäusen zeigt in der lichtmikroskopischen Analyse keine glomerulären strukturellen Anomalien. Bei elektronenmikroskopischer Analyse zeigten die Knockout-Mäuse jedoch eine erhöhte Breite der glomerulären Basalmembran, eine verringerte Anzahl von endothelialen Fenestren, eine verringerte Subpodozytenraumabdeckung und eine erhöhte durchschnittliche Podozytenspaltbreite, während die durchschnittliche Anzahl der Schlitze unverändert blieb. Die Überexpression von VEGF165b in den VEGF-A-Knockout-Tieren rettet die Veränderungen der glomerulären Basalmembran und der Schlitzbreite.

Die Überexpression von VEGF165b hat jedoch keinen Einfluss auf die veränderten Fenestralzahlen oder die Subpodozytenraumabdeckung. RNA, die aus gesiebten Glomeruli extrahiert wurde, bestätigt die humane VEGF165b-mRNA-Expression in den VEGF165b-überexprimierenden Knockout-Mäusen, was mit einer verminderten Expression von VEGFR2 in den VEGF-A-Knockout-Mäusen korreliert, die durch die VEGF165b-Überexpression im Knock-Tier gerettet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine vollständige Nierenuntersuchung für die Bewertung eines Mausmodells der glomerulären Erkrankung durchführen können, einschließlich einer Beurteilung der glomerulären Permeabilität sowohl für Albumin als auch für Wasser.