Quantifizierung von Vibrio Cholerae Kolonisation und Durchfall bei Erwachsenen Zebrafisch-Modell

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Vibrio cholerae zu beantworten, z. B. wie sich die Vibrio cholerae an der Quiet Coast ansiedelt und mit der Darmmikrobiota konkurriert, um eine Nische zu etablieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Fische ein natürlicher Wirt für Vibrio cholerae sind, so dass wir den gesamten Lebenszyklus von Vibrio cholerae untersuchen können. Das Verfahren wird von Dhrubajyoti Nag, einem Postdoc aus meinem Labor, und Paul Breen, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.

Nach der Vorbereitung der V.cholerae-Kulturen wird der Zebrafisch durch Eintauchen geimpft. Geben Sie zunächst vier oder fünf Zebrafische in ein 400-Milliliter-Becherglas mit 200 Millilitern sterilem Infektionswasser. Fügen Sie dann einen Milliliter V.cholerae-Kultur für die gewünschte Infektionskonzentration hinzu.

Decken Sie dann den Becher mit einem perforierten Deckel ab. Nachdem Sie alle Becher vorbereitet haben, stellen Sie sie in einen auf 28 Grad Celsius eingestellten Inkubator mit Glasfront. Für eine vorübergehende Exposition gießen Sie das Becherwasser nach etwa sechs Stunden durch ein Fischnetz aus, um den Fisch zu sammeln. Das infizierte Wasser muss in Bleichmittel entsorgt werden, um die Bakterien abzutöten.

Legen Sie den Fisch dann fünf Minuten lang in 200 Milliliter steriles Infektionswasser. Lassen Sie dieses Wasser nach fünf Minuten durch ein Netz laufen und entsorgen Sie das Wasser in Bleichmittel. Jetzt können die Fische in ein neues, sauberes Becherglas mit 200 Millilitern sterilem Infektionswasser kommen.

Wenn das Experiment den gewünschten Endpunkt erreicht hat, entnehmen Sie zu diagnostischen Zwecken eine 15-Milliliter-Probe des Infektionswassers. Sammeln Sie dann die Fische ein und entsorgen Sie das infizierte Wasser fachgerecht. Richten Sie die Bauchseite nach oben aus und befestigen Sie den Körper mit einer Nadel durch den Unterkiefer und einer weiteren Nadel direkt hinter dem Anus.

Winkeln Sie beide Stifte vom Körper weg an. Wischen Sie anschließend die Bauchfläche des Fisches mit 70%igem Ethanol ab. Sterilisieren Sie dann ein Skalpell und eine Vannas-Schere mit 70% Ethanol und einer Flamme.

Machen Sie nun mit dem Skalpell einen kleinen Längsschnitt in den Bauch, der die Schuppen durchdringt, aber nur so tief wie die Haut schneidet. Verlängern Sie dann mit der Schere den Schnitt vorsichtig entlang der Länge des Körpers und schneiden Sie nicht tiefer als auf Hauthöhe. Vermeide es, den Anus zu durchtrennen.

Machen Sie dann zwei seitliche Schnitte in Richtung Kopf, um die Öffnung zu erweitern. Stecken Sie dann die Haut auf jeder Seite der seitlichen Schnitte an die Präparierfläche und winkeln Sie die Stecknadeln vom Körper weg ab. Der Darmtrakt sollte nun als sehr dünne, blasse Röhre sichtbar sein.

Verwenden Sie nun zwei Paar flammsterilisierte Pinzetten, um vorsichtig den gesamten Darmtrakt zu entfernen, der ziemlich zerbrechlich sein kann. Übertragen Sie das Gewebe in ein Hominisierungsröhrchen, das Glasperlen und einen Milliliter kalten Puffer enthält. Als nächstes homogenisieren Sie das Gewebe, wie im Textprotokoll beschrieben, und quantifizieren den Grad der Darmbesiedlung.

Nehmen Sie als nächstes serielle Verdünnungen des Darmhomogenats und des Puffers vor. Bereiten Sie für jeden Fisch fünf- oder sechszehnfache Verdünnungen in einem Millilitervolumen vor. Wirbeln Sie die Röhren zum Mischen ein.

Dann werden 100 bis 200 Mikroliter jeder Verdünnung auf LB-Agarplatten aufgefüllt, die Streptomycin und X-Gal enthalten. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 16 bis 18 Stunden. Nach der Inkubation über Nacht zählen Sie die V.cholerae-Kolonien auf den Tellern.

Diese Bakterien produzieren typischerweise blassblaue Kolonien auf LB-Medium mit X-Gal. Wenn mehrere Koloniemorphologien beobachtet werden, patchen Sie einige Kolonien jeder unterschiedlichen Morphologie auf eine andere TCBS-Platte. Auf TCBS produziert V. cholerae große, leicht abgeflachte gelbe Kolonien mit undurchsichtigen Zentren und durchscheinenden Peripherien.

Um den Muzingehalt bei Fischdurchfall zu bestimmen, führen Sie einen Assay auf einer 96-Well-Platte durch. Laden Sie in dreifacher Ausfertigung 100 Mikroliter Infektionswasser für jede Testbedingung, einschließlich einer Leerprobe, in die Vertiefungen. Mischen Sie dann 50 Mikroliter frische, 0,1%ige Säurelösung in jede Testvertiefung.

Verwenden Sie zum Mischen Pipettieren. Wickeln Sie die Platte anschließend fest in Plastik ein und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für ein bis eineinhalb Stunden. Kühlen Sie die Platte nach der Inkubation auf Raumtemperatur ab.

jede Vertiefung 100 Mikroliter Fuchsinlösung geben und durch Pipettieren mischen. Wickeln Sie nun den Teller wieder ein und legen Sie ihn bei Raumtemperatur auf eine Wippe. In etwa 20 Minuten lesen Sie die Platte mit einem Plattenlesegerät bei 560 Nanometern ab.

Zur Quantifizierung der Reaktion, die durch Muzin in Lösung verursacht wird. Um den Proteingehalt bei Fischdurchfall zu messen, verwenden Sie den Bradford-Assay. Mischen Sie 66 Mikroliter eines der BSA-Standards oder 66 Mikroliter Infektionswasser mit 1.000 Mikrolitern Bradford-Assay-Reagenz in einer Einwegküvette.

Inkubieren Sie nun die Proben zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Und dann die Extinktion bei 660 Nanometern auf einem Spektralphotometer ablesen. Eine einfache Metrik für die Menge an Durchfall ist die Trübung im Wasser, gemessen bei 600 Nanometern.

Mischen Sie das Wasser gut, geben Sie einen Milliliter in eine Einwegküvette und messen Sie. Verwenden Sie für eine Blindmessung ein sauberes Infektionswasser. Auch die ausgeschiedenen V.cholerae-Bakterien können gemessen werden.

Dies kann mit Fischen geschehen, die nach der Impfung in sauberes Wasser gebracht wurden. Führen Sie serielle Verdünnungen eines Aliquats von Aquarienwasser durch, wie zuvor beschrieben. Dann plattieren Sie die Verdünnungen auf selektiven Medien und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius.

Später zählen Sie die Kolonien wie zuvor beschrieben und bestimmen dann die KBE. Gruppen von Zebrafischen, die in 200 Millilitern Wasser gehalten wurden, wurden mit fünf Millionen KBE einer pandemischen Cholerae geimpft. Nach sechs Stunden in dem von Bakterien befallenen Wasser ziehen die Fische für 18 Stunden in sauberes Wasser.

Anschließend wurden die Luftdärme entnommen. Jeder Fisch beherbergte schätzungsweise 100.000 bis 1.000.000 V.cholerae-Zellen. Das Infektionswasser wurde für andere Assays verwendet.

Die Mucinspiegel waren höher, wenn die infektiösen Dosen höher waren. Die OD600 des Wassers war signifikant höher, wenn Fische mit V. cholerae infiziert waren. Schließlich war der Gesamtproteingehalt im Wasser der infizierten Fische fast doppelt so hoch wie im Wasser der nicht infizierten Fische.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man erwachsene Zebrafische mit Vibrio cholerae infiziert und den durch die Infektion verursachten Durchfall quantifiziert. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z. B. Transmissionsassays, durchgeführt werden, um die Infektion naiver Fische durch zuvor infizierte Fische zu beurteilen.