Name: Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Lernen Sie eine Bisulfit-Sequenzierungsmethode zur präzisen Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Methylierung. Diese bioinformatische Pipeline ermöglicht Forschern zuverlässige Ergebnisse in der Mitoepigenetik.

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Die Novo Nordisk Stiftungszentrum für metabolische Grundlagenforschung ist ein unabhängiges Forschungsinstitut an der Universität Kopenhagen, teilweise durch eine freie Spende von Novo Nordisk Stiftung finanziert.

1. Einschränkung Enzymbehandlung
<ol><li>Linearisieren Sie MtDNA durch die Behandlung der gesamten menschlichen DNS mit dem Restriktionsenzym BamHI, das an Position 14258 in der menschlichen mitochondrialen DNA schneidet. Hinweis: Für Maus-DNA, verwenden Sie das Restriktionsenzym BglII unter identischen Bedingungen wie folgt.</li>
	<li>Für jede Probe wo MtDNA Methylierung soll beurteilt werden, bereiten ein 0,2 mL Reaktionsgefäß und fügen Sie die folgende Mischung: 3 μg genomischer DNA (gemessen durch Fluorometry), 15 μl Puffer 3, 3 μL BamHI und Wasser bis zu 150 μL</li>
	<li>Platz Rohre in einem Thermocycler für 4 h bei 37 ° C.</li>
</ol>(2) Bisulfit-Konvertierung
<ol><li>BamHI-behandelte DNA mit Natrium Bisulfit an anderer Stelle beschriebenen29zu konvertieren.</li>
	<li>Verwenden Sie 200-500 ng BamHI-behandelte DNA für jede Konvertierung Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Die DNA-Erholung ist 50-70 %.</li>
	<li>Eluieren Sie Bisulfit umgewandelt DNA in 10 μL Elution Puffer.</li>
	<li>Die einsträngige DNA durch Fluorometry zu quantifizieren.</li>
	<li>Optional: Speichern Sie bevor Sie fortfahren, die restlichen des Protokolls Bisulfit umgewandelt DNA bei-20 ° C. Für die langfristige Lagerung speichern Sie konvertiert Bisulfit DNA bei-80 ° C</li>
</ol>3. Gestaltung von Bisulfit Sequenzierung Primer
<ol><li>Primer für Bisulfit-Sequenzierung mit dem online-Tools Methprimer30 und BiSearch31,32zu entwerfen. Hinweis: Methprimer und BiSearch lassen sich Grundierung Bindung Sequenzen auf Genomsequenzen suchen wo Cytosines in Thymines, ähnlich wie bei Post-Bisulfit Behandlung umgewandelt.</li>
	<li>Für optimale und unvoreingenommene Verstärkung vermeiden CpG dinucleotid in die Primer und design der Amplifikate Größe zwischen 100-300 bp.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass gestaltete Primer für die mitochondriale DNA, die mit BiSearchs Funktion Primer Suchespezifisch sind. Legen Sie die bereits gestalteten Bisulfit konvertiert Primer, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bisulfit und gehören ein Referenz-Genom und PCR-Parameter. Hinweis: Es wird eine Liste der möglichen PCR-Produkte angezeigt.</li>
	<li>Kopieren Sie oben 1-5 Grundierung Sequenzen zu und fügen Sie sie in ein Bestellformular für Oligonukleotid-Synthese. Hinweis: Eine Liste von Mensch und Maus MtDNA-Primer-Sequenzen, die im Labor validiert wurde ist in Tabelle 1dargestellt.</li>
	<li>Test-Primer mit Bisulfit konvertiert PCR nach Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 4 beschrieben. Testen Sie und optimieren Sie alle Primer Paare getrennt und sicherzustellen Sie, dass die richtige Amplikons Größe auf dem Agarosegel angezeigt wird. Hinweis: Wenn multiplexing Primer benötigt werden, fügen Sie hinzu, mehrere Primer zu einem einzelnen PCR-Reaktion und visualisieren die PCR-Produkte auf Agarose-Gelelektrophorese oder eine mehr auflösenden Methode wie Polyacrylamid Gelelektrophorese, um ähnliche Produkte zu unterscheiden Größe.</li>
</ol>4. Bisulfit umgewandelt, PCR und Gel Extraction
<ol><li>Um die Regionen von Interesse zu verstärken, führen Sie durch PCR mit einem Heißstart Taq Polymerase. Kurz, Mix 100 ng umgewandelt DNA, 500 µM und Anti-Sinn Primer 1 µL dNTP-Mix (10 µM jedes dNTP) und Polymerase über 7,5 U/Reaktion in einem Gesamtvolumen von 50 µL. laufen PCR mit den folgenden Bedingungen: 5 min bei 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 Zyklen; 10 min 72 ° C. Primer verwenden, entweder separat oder Multiplex.</li>
	<li>Optional: Wenn Primer multiplexing, Einsatz 200 ng konvertiert, DNA und die folgenden Bedingungen, Radfahren: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 Zyklen; 10 min 72 ° C. Hinweis: Die Temperatur variieren je nach der Schmelztemperatur der Primer.</li>
	<li>Thema PCR-Produkte, gel-Elektrophorese auf 2 % Agarose bei 100 Volt.</li>
	<li>Unter sanften UV-Licht PCR-Produkte mit einem Skalpell zu extrahieren und mikroröhrchen hinzufügen. Setzen Sie nicht PCR-Produkte, übermäßige UV-Licht, DNA-Schäden zu vermeiden. Vermeiden Sie Belichtungszeit über 30 s.</li>
	<li>Reinigen Sie die PCR-Produkte mit Gel Reinigung wie oben beschrieben3.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die gereinigte DNA aus Schritt 4.5 mit Fluorometry. Fahren Sie mit Schritt 5 oder Shop-Proben bei-20 ° C.</li>
</ol>5. Bisulfit Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung
<ol><li>Durchführen Sie Bibliothek-Vorbereitung von Bisulfit-konvertiert PCR-Produkte. Optional: multiplex-PCR-Produkte in diesem Stadium.</li>
	<li>Führen Sie Ende-Reparatur mit bis zu 100 ng PCR-Produktes. 55.5 µL PCR-Produkt in einer 0,2 mL Tube 3 µL Ende Prep Enzym und 6,5 µL Ende Reparatur Reaktion Puffer (10 X) hinzufügen. Platzieren und Rohr in einem Thermocycler für 30 min bei 20 ° C, gefolgt von 30 min bei 65 ° c inkubieren</li>
	<li>Sequenzierung Adapter verbinden, durch das Mischen der Ende repariert DNS mit 15 µL Blunt/TA-Ligase Mix, 2,5 µL Adapter und 1 µL Ligation Enhancer. Wenn mit &lt; 100 ng PCR-Produkt als Eingabe, verdünnen Adapter 10-mal.</li>
	<li>Legen Sie die Mischung (Schritt 5.3) in einem Thermocycler und inkubieren Sie 15 min bei 20 ° C. Anhalten der Thermocycler und 3 µl Benutzer hinzufügen Enzym am Rohr. Mischen Sie und legen Sie das Rohr zurück in den Thermocycler und inkubieren 15 min bei 37 ° c</li>
	<li>Größe wählen Sie die Adapter ligiert DNA mittels Solid Phase Reversible Immobilisierung (SPRI) Perlen mit unterschiedlichen Verhältnissen von Perlen an DNA PCR Produkt abhängig.</li>
	<li>13.5 µL H2O Adapter ligiert DNA aus Schritt 5.4 und 55 µL Nukleinsäuretablette SPRI Perlen hinzufügen. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und Platz auf einem Magnetstativ. Wenn die Lösung klar ist, übertragen Sie den überstand zu, zu einem neuen Schlauch und verwerfen Sie Röhrchen mit den Perlen zu. Hinweis: Der Überstand enthält die Adapter ligiert DNA und große unerwünschte Fragmente sind verpflichtet, die ausrangierten Perlen.</li>
	<li>Der Überstand von Schritt 5.6 25 µL Nukleinsäuretablette SPRI Perlen hinzufügen, mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und verwerfen Sie den überstand zu, wenn die Lösung klar ist. Hinweis: Der ausrangierte überstand enthält unerwünschte DNA, während die Adapter ligiert DNA an Perlen gebunden ist.</li>
	<li>Während das Rohr auf die Magnetstativ ist, fügen Sie 200 µL 80 % Ethanol (frisch zubereitet) um die Perlen zu waschen. Inkubieren Sie 30 s und entfernen und entsorgen der Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 2 Wäschen.</li>
	<li>Luft trockenere Perlen für 5 min, während das Rohr auf Magnetstativ mit offenen Deckel.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnet, eluieren Sie DNA in 23 µL Elution Buffer und mischen. In 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und wenn die Lösung klar ist, übertragen Sie 2 µL auf einer 96-Well-PCR-Platte für die Pre-PCR-Amplifikation (Schritt 5.14).</li>
	<li>Der Rest ungefähr 21 µL auf eine neue 0,2 mL Tube für PCR-Amplifikation (Schritt 5.17) übertragen. Hinweis: Achten Sie nicht darauf, Perlen zu übertragen, wie Perlen enzymatische Reaktionen über die nächsten Schritte hemmen können.</li>
	<li>Fahren Sie mit Schritt 5.14 oder Shop-Proben bei-20 ° C.</li>
	<li>Führen Sie Pre-PCR Verstärkung durch RT-qPCR Schätzung die Anzahl der Zyklen erforderlich, um die Adapter ligiert DNA zu verstärken. Pro Reaktion, fügen Sie Folgendes in der 96-Well-PCR Platte mit 2 µL DNA (Schritt 5.11): 0.4 µL Index Grundierung, 0.4 µL universal PCR Primer, 7,2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR-master-Mix.</li>
	<li>Die Platte in einer Echtzeit-PCR-Maschine und die Platte mit den folgenden Bedingungen zu unterwerfen: 30 s bei 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 Zyklen; 5 min 65 ° C.</li>
	<li>Schätzen Sie die Anzahl der Verstärkung Zyklen benötigt für jede Probe durch Subtraktion eines Ct-Wert der Ct-Wert von der Vorverstärkung RT-qPCR entsprechend an das Ende der linearen Phase der PCR-Reaktion.</li>
	<li>Verstärken Sie die Adapter ligiert DNA aus Schritt 5.12 durch Mischen: 21 µL DNA, 25 µL PCR-master-Mix, 1 µL Index Grundierung, 1 µL Universal PCR Primer und 2 µL H2O. In einem Thermocycler unterziehen jede Probe mit den nachfolgenden Bedingungen: 30 s bei 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [berechnete Ct aus Schritt 5.16] Zyklen; 5 min 65 ° C. Hinweis: Denken Sie daran, nur eine Index-Grundierung pro Probe zu Multiplexen. Der Index ist während der PCR eingesetzt.</li>
	<li>Reinigen Sie die amplifizierten DNA SPRI-Perlen und eluieren in 22 µL Elution Puffer.</li>
	<li>Bibliothek-Qualitätskontrolle durch Gel-Elektrophorese oder Alternative Methode. Achten Sie auf richtige Bibliothek Peak Größen (PCR-Produkt (e) Größe plus Adapter).</li>
	<li>Schätzen Sie die durchschnittliche Basenpaar Größe der Bibliothek-Produkte durch Abstrich Analyse: im erweiterten globalen Einstellungen, doppelklicken Sie auf "Tabelle" unter Abstrich Analyse. Definieren der Region von 100-1000 bp und klicken Sie auf "OK". Unter Region-Tabelledie definierte Region erscheint und Bibliothek Durchschnittsgröße (bp) wird berechnet.</li>
	<li>Bibliotheken von Fluorometry zu quantifizieren. Fahren Sie mit Schritt 6 oder Shop-Bibliotheken bei-20 ° C.</li>
</ol>(6) next Generation Sequencing
<ol><li>Berechnen Sie die nM-Konzentration der Bibliotheken mit der Formel: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Verdünnen Sie Bibliotheken, die die gleichen nM Konzentration z.B. 2 nM (Wählen Sie 4 nM, 2 nM, 1 nM oder 0,5 nM je nach Bibliothek Konzentrationen). Bündeln Sie alle Bibliotheken um einen Pool von 2 nM Bibliotheken zu erreichen.</li>
	<li>Denaturieren und Bibliotheken nach der Sequenzierung Instrument Guide zu verdünnen. Kurz gesagt: 2 nM Pool durch Zugabe von 0,2 N NaOH denaturieren und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. verdünnt denaturierte Pool zu einer Endverdünnung von 22:00. Denaturieren Sie und verdünnen Sie eine handelsübliche Steuerelementbibliothek zu einer endgültigen Verdünnung der 12:05. Mischen Sie zu einem neuen Schlauch 22:00 Pool mit 20 % 12:05-Steuerelementbibliothek. Hinweis: Bisulfit Konvertierung führt sehr geringen Komplexität. Bessere Qualität der Sequenzierung führen Bibliothek Spike-in 20 % Kontrolle.</li>
	<li>Führen Sie ein 150 bp gepaart-End Sequenzierung mit einem tiefen Sequenzierung Instrument.</li>
</ol>(7) computergestützte Analyse - Schätzung Methylierung Ebenen
<ol><li>.Fastq Dateien (hier als sample1_R1.fastq.gz und sample1_R2.fastq.gz) zu erzeugen, erzeugen einen Bismark-Index des gesamten Genoms von Interesse (hier in einem Ordner namens BismarkIndex) und stellen Sie sicher, dass die genomische Sequenz ChrM in Fasta verfügbar ist Format (hier in einem Ordner namens ChrM).</li>
	<li>Vorverarbeitung von liest entfernen Sie Adapter und Bias eingeführt durch die Primer: Verwenden Sie das Tool Trim_galore33. Entfernen Sie zwei Nukleotide aus 5'-Ende der vorwärts und rückwärts liest. Trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o. /--trim1--gepaart sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Richten Sie vorbearbeitet liest, das gesamte Genom mit Bismark34 Bismark - Schwalbenschwanz - Bam -o. /. / BismarkIndex /-1-2./sample1_R1_val_1.fq.gz./sample1_R2_val_2.fq.gz Hinweis: Wenn eine andere Aligner verwendet wird, stellen Sie sicher, dass Lesevorgänge, die eindeutig ausgerichtet werden können nicht verworfen werden.</li>
	<li>Extrakt liest Mapping auf dem Chromosom M, hier mit Samtools35 Samtools sortieren -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM Samtools Index sample1_sorted.bam Samtools anzeigen -u sample1_sorted.bam ChrM | Samtools sortieren - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Die Methylierung Informationen extrahieren Bismark_methylation_extractor -p--CX--Cytosine_report--umfassende--Genome_folder. / ChrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>Verwenden Sie die .bedGraph, die .cov oder die CX_report.txt-Dateien für die weitere Analyse. Verwenden Sie die sample1_chrM.CX_report.txt-Datei für die Visualisierung und testen.</li>
	<li>Führen Sie weiter Ausschnitt in der Vorverarbeitung Schritt aus, wenn mehrere Regionen verhört und eine Grundierung Vorspannung möglicherweise sichtbar in den M-Bias Parzellen erzeugt beim Mapping. Finden Sie in der Bismark-Dokumentation für weitere Informationen.</li>
</ol>(8) computergestützte Analyse - Test Unterschiede
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die CX_report.txt-Datei für jedes C auf Chromosom M 7 Spalten, Chromosom (hier ChrM), Position, Ausrichtung, Anzahl der methylierten liest, unmethylated liest, C Kontext und umliegenden Sequenz enthält.</li>
	<li>Da die CX_report ChrM in seiner Gesamtheit erfasst, überprüfen Sie die Teilmenge, die Region(en), verstärkt wird.</li>
	<li>Verwenden Sie nicht-parametrischen Tests für Unterschiede zwischen den Proben, wie ein Fishers exakter Test für einzelne C oder ein Zeichen-Test für eine ganze Region. Hinweis: Quantifizierung werden oft in der Nähe von 0 % Methylierung, das ist der Grund, warum die Annahme von Normalität nicht angebracht ist.</li>
	<li>In ähnlicher Weise für die Visualisierung, Quantile zu visualisieren oder binomische Anteil Konfidenzintervall berechnen.</li>
</ol>

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Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt zu erklären.

Hier bieten wir ein Bisulfit-Sequenzierung-Protokoll, das speziell für die MtDNA-Methylierung zu befragen. Die Unterschiede mit Bisulfit-Sequenzierung Protokolle für genomische DNA liegt bei der Verwertung von eine vorherige Beschränkung Enzym Verdauung Schritt und eine bioinformatische Analyse Urteil, falsche positive aus NUMT Sequenzen.
Wir bieten ein Protokoll zur Bisulfit-Sequenzierung Artefakte zu vermeiden, bei der Untersuchung von MtDNA-Methylierung. Bisulfit Sequenzierung Artefakte zu ...

Das mitochondriale Genom ist eine kreisförmige, doppelsträngige Struktur von rund 16,5 Kilo Base (kb) lang, bilden eine schwere und eine leichte Faser. Das mitochondriale Genom ist in mehrere Kopien in jeder Zelle, mütterlich vererbt, und wesentliche Bestandteile der Atmungskette komplexe1kodiert. Ähnlich wie bei bakteriellen Genome und anders als das Kerngenom, des mitochondrialen Genoms in zahlreichen sekundären und tertiären Strukturen, wie z. B. gewickelten und supercoiled Strukturen2, gliedert sich in die Zugang schwierig, während der Sequenzierung machen können Experimente-3.
Im Zellkern ist Methylierung der DNA ein ausgiebig studierte epigenetische Markierung, die in zahlreiche Prozesse, vor allem in der Regulation der Genexpression eine Rolle spielt. In Säugetier-Genome tritt DNA-Methylierung in erster Linie auf der 5-Position der Pyrimidine Ring der Deoxycytidines, meistens auf CG dinucleotid (oder CpG). Cytosin Methylierung findet sich bei 70 % von allen CpG im Erbgut von Körperzellen und Konten für ~ 1 % der gesamten DNA4Basen. DNA-Methylations ist auch in nicht-CpG zusammenhängen, wie CpA, CpT und CpC beschrieben worden und existieren in verschiedenen Mengen in Kern-DNA, mit Werten bis zu 25 % von allen methylierte Cytosines in embryonale Stammzellen5,6,7.
Während Cytosin Methylierung von das Kerngenom weithin anerkannt ist, ist die Existenz der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung noch umstritten. Die erste Studie untersucht MtDNA Methylierung erfolgte in kultivierten Zellen wo MtDNA Methylierung bereitwillig erkannt wurde, obwohl auf einem niedrigeren Niveau im Vergleich zu nuklearen DNA-8. In menschlichen und murinen Zellen wurde MtDNA Methylierung auch auf einem niedrigen Niveau (2-5 %) festgestellt. Mit Berufung auf 5 Methylcytosine erfassen wie METHYLIERTE DNA Immunopräzipitation (MeDIP) gefolgt von quantitativen PCR Assays, MtDNA Methylierung wurde auch in verschiedenen Maus und Mensch erkannt und Zellen Linien9,10, 11,12. Mit Antikörpern gegen 5 Methylcytosine in einem ELISA-Test oder Massenspektrometrie, waren wesentliche Ebenen der DNA-Methylierung von gereinigten mitochondriale Fraktionen13,14,15, erkannt. 16. jedoch der Großteil der Assays in den genannten Studien verwendet Techniken, die nicht entworfen waren, um absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung in der einzigen Basis-Auflösung bieten.
Quantitative und auflösenden DNA-Methylierung Analyse durch eine Technik namens "Bisulfit Sequenzierung", lässt sich die Vorteile des Eigentums von Natrium Bisulfit unmethylated Cytosin in Uracil in einzelsträngiger DNA Kontext17 konvertieren . Eine Konstellation von Studien erkannt mit Bisulfit-Sequenzierung, die Anwesenheit von Cytosin Methylierung auf verschiedenen Ebenen. Im menschlichen18,19,20,21,22,23 und Maus24 wurde bereitwillig Methylierung MtDNA in der D-Loop-Region, der 12 s oder 16 s Region erkannt. Geweben und Zellen, jedoch mit einer faszinierenden Variabilität, von 1-20 % des gesamten Cytosines in Studien.
Im Vergleich zu diesen zahlreichen Studien haben nur wenige Studien, unter anderem von unserer Fraktion bestritten die Anwesenheit von MtDNA Methylierung3,25,26,27 oder in Frage gestellt die biologische Relevanz der sehr niedrige Niveaus von MtDNA (unter 2 %)28. Vor kurzem berichteten wir die Beobachtung eines potenziellen Bisulfit-Sequenzierung Artefakts in ganzen mitochondriale Bisulfit Sequenzierung3. Wir haben nachgewiesen, die die Sekundärstruktur der mitochondrialen DNA zu Fehlalarmen in Bisulfit-Sequenzierung, könnte damit überschätzen Methylierung Ebenen. Wir bieten hier ein Protokoll um ein Artefakt der Bisulfit-Umwandlung von MtDNA zu verhindern. Dieses Protokoll verwendet eine einfache enzymatische Verdauung von DNA zu stören MtDNA Sekundärstrukturen und vollen Zugriff auf Bisulfit nach einem Bisulfit-Sequenzierung-Protokolls zu ermöglichen. Darüber hinaus bieten wir eine begleitende Bioinformatik-Pipeline für die Analyse von Bisulfit-Sequenzierung.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA-Methylierungs-Blitz-Kit</td><td>Zymo Research</td><td># D5030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA-Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay-Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq plus DNA-Polymerase-Kit</td><td>Qiagen</td><td># 203603&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit für Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex-Oligoe für Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>Hochempfindlicher DNA-Chip</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit hochempfindlicher dsDNA-Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reagenzienkit v2 300 Zyklen</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX control v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR Nachweissystem</td><td>Biorad</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalysator 2100</td><td>Agilent</td><td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Instrument</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

methodik für die präzise erkennung der mitochondrialen dna-methylierung

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantifizierung der DNA-Methylierung kann erreicht werden mit Bisulfit-Sequenzierung, die Vorteile des Eigentums von Natrium Bisulfit unmethylated Cytosin in Uracil in einem einzelsträngigen DNA-Kontext zu konvertieren. Bisulfit-Sequenzierung können gezielt (mittels PCR) oder auf das gesamte Genom durchgeführt und bietet absolute Quantifizierung von Cytosin Methylierung in der einzigen Basis-Auflösung. Angesichts der deutlichen der nuklearen und mitochondriale DNA, vor allem in der Sekundärstruktur, sollten Anpassungen von Bisulfit Sequenzierung Methoden für die Untersuchung von Cytosin Methylierung in MtDNA erfolgen. Sekundäre und tertiäre Struktur der MtDNA führt in der Tat zu Bisulfit Artefakte zu Fehlalarme aufgrund von unvollständigen Denaturierung schlechte Anbindung von Bisulfit einzelsträngigen DNA-Sequenzierung. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einer enzymatischen Verdauung der DNA mit BamHI gepaart mit bioinformatische Analyse Pipeline ermöglichen genaue Quantifizierung von Cytosin Methylierung Ebenen in MtDNA. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien für die Gestaltung von Bisulfit Sequenzierung Primer spezifisch für MtDNA, zur Vermeidung von unerwünschten nuklearen mitochondriale Segmente gezielt (NUMTs) in das Kerngenom eingesetzt.

Zwei Schritte in diesem Protokoll sind von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung von MtDNA-Methylierung. (1) die Eröffnung der Sekundärstruktur und (2) die Gestaltung der mitochondrialen DNA-spezifischen Primer.
Durch Verdauung menschliche genomische DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Abbildung 1), die mitochondriale DNA-Struktur wird an Nukleotid Position 14.258 geschnitten werden und die...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung. In diesem Protokoll beschreiben wir eine enzymatische Verdauung von DNA mit BamHI gepaart mit einem bioinformatische Analyse Pipeline die Überschätzung der MtDNA Methylierung Ebenen verursacht durch die Sekundärstruktur des MtDNA zu vermeiden verwendet werden können.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Das übergeordnete Ziel dieses Bisulfit-Sequenzierungsprotokolls und der bioinformatischen Pipeline ist es, eine genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Methylierung zu erreichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im mitoepigenetischen Bereich zu beantworten, wie z. B. ob die mitochondriale DNA-Methylierung die menschliche Krankheit verändert? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Methylierung ermöglicht.Ein entscheidender Schritt bei der Untersuchung der mitochondrialen DNA-Methylierung ist die Linearisierung der mitochondrialen DNA durch BamH1-Verdau vor der Behandlung mit Natriumbisulfit. Die Stelle des BamH1-Restriktionsenzyms ist in dieser Karte des menschlichen mitochondrialen Genoms dargestellt. Ebenfalls dargestellt sind die fünf Regionen des mitochondrialen Genoms, die durch Bisulfit-Sequenzierung untersucht werden.Verdrängungsschleife, tRNA-Phenylalanin und 12S-Ribosom, 16S-Ribosom, NADH-Dehydrogenase 5, Cytochrom-B-mRNA-kodierendes Gen. Nach dem Design der Primer für die Bisulfit-Sequenzierung unter Verwendung von Online-Tools, wie im Textprotokoll beschrieben, wird die Primerspezifität gegenüber dem mitochondrialen Genom mit BiSearch überprüft. Primer-Sequenzen werden der BiSearch-Funktion Primer-Suche hinzugefügt.Das Bisulfit-Kästchen ist angekreuzt und ein Referenzgenom wird ausgewählt. Die Suchergebnisse zeigen potenzielle PCR-Produkte, die auf Sense- und Antisense-Ketten generiert wurden. Um die interessierenden Regionen aus dem Bisulfit-umgewandelten mitochondrialen Genom zu amplifizieren, führen Sie eine PCR mit einer Hot-Start-Taq-Polymerase durch.Bei separater Verwendung von Primern werden 100 Nanogramm umgewandelte DNA, 500 Mikromolare Sense- und Antisense-Primer, ein Mikroliter dNTP-Mix und Polymerase in einer Menge von 7,5 Einheiten pro Reaktion in einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern gemischt. Führen Sie die PCR unter folgenden Bedingungen durch: fünf Minuten bei 95 Grad Celsius, eine Minute bei 94 Grad Celsius, eine Minute bei 55 Grad Celsius, eine Minute bei 72 Grad Celsius für 35 Zyklen, gefolgt von 10 Minuten bei 72 Grad Celsius. Verwenden Sie zum Multiplexen von Primern 200 Nanogramm umgewandelter DNA unter den folgenden Zyklusbedingungen: fünf Minuten bei 95 Grad Celsius, eine Minute bei 94 Grad Celsius, 1,5 Minuten bei 55 Grad Celsius und 1,5 Minuten bei 72 Grad Celsius für 35 Zyklen, gefolgt von 10 Minuten bei 72 Grad Celsius.Wenn die PCR abgeschlossen ist, führen Sie eine Gelelektrophorese an den PCR-Produkten mit einer 2%Agarose bei 100 Volt durch. Die Extraktion der PCR-Produkte aus dem Agarosegel muss so erfolgen, dass die UV-Belastung und das Risiko von DNA-Schäden minimiert werden. Machen Sie ein Foto des Gels unter UV-Licht.Markieren Sie dann sehr schnell das PCR-Produkt mit einem Skalpell und schalten Sie das UV-Licht aus. Schneiden Sie anschließend das PCR-Produkt langsam ohne UV-Licht zu reinigen. Legen Sie die Gelscheiben in Mikrozentrifugenröhrchen und reinigen Sie die PCR-Produkte mittels Gelaufreinigung, wie im Textprotokoll beschrieben.Quantifizieren Sie die gereinigte DNA mittels Fluorometrie. Lagern Sie die Proben bei 20 Grad Celsius, wenn nicht sofort, fahren Sie mit der Vorbereitung der Bisulfit-Sequenzierungsbibliothek fort. Beginnen Sie mit der Bibliotheksvorbereitung von Bisulfit-konvertierten PCR-Produkten, indem Sie eine Endreparatur mit bis zu 100 Nanogramm PCR-Produkt durchführen.Zu jedem 0,2-Milliliter-Röhrchen fügen Sie 55,5 Mikroliter PCR-Produkt, drei Mikroliter Endvorbereitungsenzym und 6,5 Mikroliter 10-fachen Endreparaturreaktionspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Röhrchen in einem Thermocycler bei 20 Grad Celsius für 30 Minuten, gefolgt von 65 Grad Celsius für 30 Minuten. Als nächstes ligieren Sie Sequenzierungsadapter, indem Sie die am Ende reparierte DNA mit 15 Mikrolitern Blunt/TA-Ligasemischung, 2,5 Mikrolitern Adapter und einem Mikroliter Ligationsverstärker mischen.Geben Sie die Mischung in einen Thermocycler und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Halten Sie den Thermocycler an und geben Sie 3 Mikroliter USER-Enzym in jedes Röhrchen. Mischen Sie die Röhrchen, legen Sie sie zurück in den Thermocycler und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Wählen Sie die Adapter-ligierte DNA mittels reversibler Festphasen-Immobilisierung oder SPRI aus. Füge der adapterligierten DNA 13,5 Mikroliter Wasser und 55 Mikroliter resuspendierte SPRI-Kügelchen hinzu. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Stellen Sie die Röhren auf einen Magnetständer. Wenn die Lösung klar ist, übertrage den Überstand, der die adapterligierte DNA enthält, in ein neues Röhrchen und entsorge das Röhrchen mit den Kügelchen. Geben Sie 25 Mikroliter resuspendierte SPRI-Kügelchen in den Überstand; Mischen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Legen Sie die Röhrchen auf den Magnetständer und entsorgen Sie den Überstand, wenn die Lösung klar ist. Die adapterligierte DNA ist nun an die Kügelchen gebunden. Während sich die Röhrchen auf dem Magnetständer befinden, geben Sie 200 Mikroliter frisch zubereitetes 80%iges Ethanol in jedes Röhrchen und inkubieren Sie es 30 Sekunden lang, um die Kügelchen zu waschen.Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Ethanol-Waschschritt für insgesamt zwei Wäschen. Entfernen Sie das Ethanol aus der zweiten Wäsche und trocknen Sie die Kügelchen an der Luft, indem Sie die Tuben bei geöffnetem Deckel fünf Minuten lang auf dem Magnetständer lassen.Entfernen Sie nach fünf Minuten die Röhrchen vom Magnetständer, geben Sie 23 Mikroliter DNA-Elutionspuffer zu den Kügelchen und mischen Sie. Zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Röhrchen auf den Magnetständer, bis die Lösung klar ist.Übertragen Sie dann zwei Mikroliter der Lösung auf eine 96-Well-PCR-Platte für die Prä-PCR-Amplifikation. Vermeiden Sie die Kügelchen vorsichtig und geben Sie den Rest der Lösung für die PCR-Amplifikation in ein neues 0,2-Milliliter-Röhrchen. Führen Sie eine Prä-PCR-Amplifikation durch RT-qPCR durch, um die Anzahl der Zyklen abzuschätzen, die für die Amplifikation der adapterligierten DNA erforderlich sind.Stellen Sie einen Mastermix aus den folgenden Elementen pro verwendeter Reaktion her: 0,4 Mikroliter Index-Primer, 0,4 Mikroliter Universal-PCR-Primer, 7,2 Mikroliter Wasser und 10 Mikroliter RT-qPCR-Mastermix. Mischen Sie dann den Mastermix und fügen Sie 18 Mikroliter Mastermix zu den zwei Mikrolitern DNA in der 96-Well-PCR-Platte hinzu.Legen Sie die Platte in ein Echtzeit-PCR-Gerät und führen Sie die Amplifikation unter den folgenden Bedingungen durch: 30 Sekunden bei 98 Grad Celsius, 10 Sekunden bei 98 Grad Celsius und 75 Sekunden bei 65 Grad Celsius für 20 Zyklen, gefolgt von fünf Minuten bei 65 Grad Celsius. Nach Schätzung der Anzahl der für jede Probe erforderlichen Amplifikationszyklen, wie im Textprotokoll beschrieben, amplifiziert die adapterligierte DNA. Mischen Sie für jede Probe 21 Mikroliter DNA, 25 Mikroliter PCR-Mastermix, einen Mikroliter Index-Primer, einen Mikroliter Universal-PCR-Primer und zwei Mikroliter Wasser.Im Thermocycler wird jede Probe den folgenden Bedingungen ausgesetzt: 30 Sekunden bei 98 Grad Celsius, 10 Sekunden bei 98 Grad Celsius und 75 Sekunden bei 65 Grad Celsius für die berechnete Anzahl von Zyklen, gefolgt von fünf Minuten bei 65 Grad Celsius. Reinigen Sie die amplifizierte DNA mit SPRI-Kügelchen, wie zuvor gezeigt, und eluieren Sie sie in 22 Mikrolitern Elutionspuffer. Kontrollieren Sie die Bibliotheksqualität mit einem Bioanalysator.Achten Sie auf die richtigen Peakgrößen der Bibliothek. Schätzen Sie die durchschnittliche Basenpaargröße der Bibliotheksprodukte durch Abstrichanalyse. Doppelklicken Sie in den erweiterten globalen Einstellungen unter Abstrichanalyse auf Tabelle.Suchen Sie den Bereich zwischen 100 und 1000 Basispaar und klicken Sie auf OK. Unter Bereichstabelle wird der definierte Bereich angezeigt und die durchschnittliche Größe der Bibliothek wird berechnet. Quantifizieren Sie die Bibliothek durch Fluorometrie. Lagern Sie die Bibliothek bei 20 Grad Celsius, bis sie für Next Generation Sequencing und computergestützte Analysen bereit ist.Mittels Bisulfit-Sequenzierung wurde die mitochondriale DNA-Methylierung in unverdauter und verdauter Gesamt-DNA aus menschlichen Skelettmuskelzellen in fünf verschiedenen Regionen des mitochondrialen Genoms untersucht. Ein volles Quadrat stellt die Cytosin-Guanin-Dinukleotidstellen dar. Das offene Quadrat stellt Nicht-Cytosin-Guanin-Dinukleotidstellen dar.Bei unverdauter mitochondrialer DNA lagen die Methylierungsniveaus in allen untersuchten Regionen zwischen 0 und 15,1 %. Wenn die DNA jedoch vor der Bisulfit-Umwandlung verdaut wurde, sank die Unkoversionsrate in allen Regionen auf maximal 1 %. Dies verdeutlicht, wie wichtig der BamH1-Verdau vor der Bisulfit-Umwandlung ist, um eine Überschätzung der mitochondrialen DNA-Methylierungsniveaus zu vermeiden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine mitochondriale Bisulfit-Sequenzierung durchführen, und indem Sie unserer bioinformatischen Pipeline folgen, können Sie eine genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Methylierung erreichen.

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieses Video zeigt das Protokoll für die methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP). MeDIP ist eine zweitägige Verfahren, die selektiv extrahiert methylierte DNA-Fragmente aus einer genomischen DNA-Probe unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität für 5-Methylcytosin (anti-5 mC).

Methylierte DNA Immunpräzipitation

Der Goldstandard für die DNA-Methylierung ist genomische Sequenzierung von Bisulfit-konvertierter DNA. Diese Methode nutzt die erhöhte Empfindlichkeit von Cytosin verglichen mit 5-Methylcytosin (5-MeC) zu Desaminierung unter sauren Bedingungen Bisulfit. Unmethylierte Cytosine kann von methylierter Cytosine nach PCR-Amplifikation der Ziel-genomischer DNA unterschieden werden.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Ein optimierter Workflow, um DNA-Methylierung und Veränderungen der Genexpression auf Early-Stress Leben zu studieren gezeigt wird. Ausgehend von mütterlicher Trennung von neugeborenen Mäusen und Isolierung von diskreten Hirngewebe, vertreten wir ein Protokoll, um gleichzeitig zu isolieren DNA und RNA aus Hirngewebe Schläge für nachfolgende Bisulfit-Sequenzierung und RT-PCR-Analyse.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Dieses Video beschreibt die Technik des Dot-Blots zur Bestimmung des Grades der DNA-Methylierung in menschlichen Chondrozyten in vitro durch das Blotten von DNA-Proben auf einer Nylonmembran und die anschließende Visualisierung mit monoklonalen Antikörpern. Dies hilft, den Phänotyp der Chondrozyten in verschiedenen Stadien der Kultur zu bestimmen.

5-Methylcytosin-Dot-Blot zur Bestimmung des Ausmaßes der DNA-Methylierung

Enhanced Reduced Representation Bisulfit Sequencing ist eine Methode zur Erstellung von Sequenzierungsbibliotheken für die DNA-Methylierungsanalyse, die auf dem Verdau von Restriktionsenzymen in Kombination mit der Umwandlung von Cytosin-Bisulfit basiert. Dieses Protokoll erfordert 50 ng Ausgangsmaterial und liefert Daten zur Auflösung von Basenpaaren in GC-reichen genomischen Regionen.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

Bisulfit-Amplikon-Sequenzierung (BSAS) ist eine Methode zur Quantifizierung der Cytosin-Methylierung in bestimmten genomischen Regionen von Interesse. Bei dieser Methode wird die Bisulfit-Umwandlung in Kombination mit der PCR-Amplifikation von Zielregionen vor der Next-Generation-Sequenzierung verwendet, um eine absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung auf basenspezifischer Ebene zu erzielen.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

DNA-Methyltransferasen sind potenzielle Ziele für Krebsmedikamente. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um kleine Moleküle auf DNA-Methyltransferase-Hemmung zu untersuchen. Dieser Assay verwendet eine Endonuklease, um die DNA-Methylierung an die Fluoreszenzerzeugung zu koppeln und ermöglicht die Überwachung der Enzymaktivität in Echtzeit.

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der absoluten mitochondrialen (mt)DNA-Kopienzahl und der mtDNA-Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen vor.

Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Pyrosequenzierungsassays ermöglichen die robuste und schnelle Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen der mitochondrialen DNA in heteroplasmatischen Zellen oder Geweben.

Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen im mitochondrialen Genom durch Pyrosequenzierung

Es wird ein Verfahren zur Untersuchung der Dynamik des mitochondrialen DNA-Stoffwechsels (mtDNA) in Zellen unter Verwendung eines Multi-Well-Plattenformats und automatisierter Immunfluoreszenzbildgebung zum Nachweis und zur Quantifizierung der mtDNA-Synthese und -Verteilung beschrieben. Dies kann weiter genutzt werden, um die Auswirkungen verschiedener Inhibitoren, zellulärer Belastungen und Genstilllegung auf den mtDNA-Stoffwechsel zu untersuchen.

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

Lernen Sie eine Bisulfit-Sequenzierungsmethode zur präzisen Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Methylierung. Diese bioinformatische Pipeline ermöglicht Forschern zuverlässige Ergebnisse in der Mitoepigenetik.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

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