Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Das übergeordnete Ziel dieser optimierten Einzelmolekül-RNA-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist es, einzelne RNA-Moleküle während des vegetativen Wachstums und der Meiose von knospenden Hefen pro Zelle zu detektieren und zu quantifizieren. Diese Methode zeigt die Variabilität der Genexpression von Zelle zu Zelle bei der subzellulären RNA-Lokalisierung auf und ist daher eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der Genregulation. Abgesehen von den einzigartigen Informationen, die durch smFISH preisgegeben werden können, besteht der Hauptvorteil der Technik darin, dass sie, sobald sie optimiert ist, robust und hochgradig reproduzierbar ist.

Für die Demonstration dieses Protokolls wird eine meiotische Kultur verwendet. Um die Kultur in 3 % Formaldehyd zu fixieren, fügen Sie 1840 Mikroliter der Kultur zu 160 Mikrolitern 37 % Formaldehyd in einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Zum Mischen etwa fünfmal umkehren.

Legen Sie das Rohr 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf eine Rolltrommel. Nach 20 Minuten bei vier Grad Celsius mit Rotation über Nacht weiter fixieren. Bereiten Sie sich am nächsten Tag auf den Aufschluss vor, indem Sie zunächst 200 millimolare Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe (VRC) mindestens 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius auftauen.

Zur Herstellung des Aufschlussmastermixes pipettieren Sie zunächst 2125 Mikroliter Puffer B in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Wirbeln Sie dann das warme VRC fünf Sekunden lang vortexen, um es vollständig zu resuspendieren, und fügen Sie dem 15-Milliliter-Röhrchen 200 Mikroliter VRC hinzu. Die Mischung sollte eine hellbräunlich-grüne Farbe haben.

Die meiotische Probe wird bei 21.000 x g eineinhalb Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und platzieren Sie die Vakuumspitze auf der gegenüberliegenden Seite des Pellets, um das Pellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen in eineinhalb Millilitern kaltem Puffer B, indem Sie zum Mischen auf und ab pipettieren.

Bei 21.000 x g eineinhalb Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie den Großteil der Flüssigkeit durch Vakuumaspiration, so dass etwa 100 Mikroliter zurückbleiben. Resuspendieren Sie die Zellen in eineinhalb Millilitern Kaltpuffer B. Zentrifugieren Sie die Proben, entfernen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren Sie die Zellen erneut in eineinhalb Millilitern Kaltpuffer B.

Bei 21.000 x g eineinhalb Minuten zentrifugieren. Saugen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren vollständig ab. Die Zellen in 425 Mikrolitern Verdauungsmastermix resuspendieren und kurz vortexen.

Geben Sie fünf Mikroliter Zymolyase in das Röhrchen und wirbeln Sie es zwei bis drei Sekunden lang, um es zu mischen. Stellen Sie das Röhrchen auf eine Rolltrommel und verdauen Sie es 15 bis 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Nach 15 Minuten kontrollieren Sie die Zellen alle fünf Minuten mikroskopisch und stoppen die Verdauung, wenn etwa 80% der Zellen undurchsichtig und nicht refraktiv erscheinen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 376 x g für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand vollständig. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter Puffer B, indem Sie ein- bis zweimal auf und ab pipettieren, um zu mischen.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen und entfernen Sie den Puffer. Die Zellen werden vorsichtig in einem Milliliter 70%igem Ethanol resuspendiert und dreieinhalb bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Um das Hybridisierungsverfahren zu beginnen, zentrifugieren Sie das Zellröhrchen bei 376 x g für drei Minuten.

Entfernen Sie 500 Mikroliter des 70%igen Ethanols aus der Tube. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die verbleibenden Zellen wieder zu resuspendieren, und übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen mit geringer Adhäsion. Das Überführen der Probe in ein Röhrchen mit geringer Adhäsion ist entscheidend, um einen übermäßigen Zellverlust während der nachfolgenden Formamid-Waschungen zu verhindern.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit geringer Haftung und entfernen Sie das gesamte Ethanol. Geben Sie einen Milliliter 10%igen Formamid-Waschpuffer in das Röhrchen und pipettieren Sie vorsichtig zwei- bis dreimal auf und ab, um die Zellen wieder zu resuspendieren. Lassen Sie die Zellen etwa 20 Minuten lang bei Raumtemperatur aushärten, während Sie die Hybridisierungslösungen vorbereiten, wie im Textprotokoll beschrieben.

Die Probe zentrifugieren und den Überstand in den Sondermüll entfernen. Geben Sie mindestens 50 Mikroliter jeder Hybridisierungslösung in das Röhrchen und schnippen Sie das Röhrchen zum Mischen. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius auf einer Walzentrommel für mindestens 16 Stunden im Dunkeln.

Wenn die Hybridisierung abgeschlossen ist, legen Sie die Röhre mit den Zellen in eine mit Folie abgedeckte Box, um sie vor Licht zu schützen. Die Probe wird bei 376 x g drei Minuten lang zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren in den Sondermüll.

Resuspendieren Sie die Probe in einem Milliliter 10%iger Formamid-Waschpuffer, indem Sie zwei- bis dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren. Legen Sie das Röhrchen mit den Zellen zum Schutz vor Licht wieder in eine mit Folie bedeckte Box und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die Probe.

Entfernen Sie den Überstand zu Sonderabfällen durch Pipettieren, wobei etwa 50 Mikroliter übrig bleiben. Resuspendieren Sie die Probe in einem Milliliter DAPI-Lösung, indem Sie zwei- bis dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren. Legen Sie das Röhrchen mit den Zellen erneut in die mit Folie bedeckte Box und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius.

Die Probe zentrifugieren und den Überstand durch Pipettieren vollständig entfernen. Bei Proben, die nicht sofort abgebildet werden, resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern GLOX-Puffer ohne Enzyme. Pipettieren Sie drei- bis viermal auf und ab, um zu mischen.

In der mit Folie abgedeckten Schachtel bei vier Grad Celsius aufbewahren, bis das Bild fertig ist. Für Proben, die sofort abgebildet werden, fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter GLOX-Puffer mit Enzymen hinzu. Pipettieren Sie fünf Mikroliter auf ein Deckglas und legen Sie das Deckglas auf einen Objektträger.

Legen Sie ein Labortuch auf den Objektträger, auf dem sich der Deckglas befindet. Drücken Sie vorsichtig auf das Tuch, um den Schieber einzustellen. Legen Sie den Objektträger in eine mit Aluminiumfolie bedeckte Schachtel, um ihn in den Mikroskopraum zu bringen.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Expression des NDC80-Gens zu untersuchen, das zwei mRNA-Isoformen exprimiert. Die lange, undekodierte Transkript-Isoform hat im Vergleich zur kurzen Isoform eine Ausdehnung von 400 Basenpaaren mit fünf Primzahlen. Es wurden zwei Sondensätze entwickelt.

Die CF 590-Menge bindet an die einzigartige Fünf-Primzahl-Region der langen Isoform, und die Q 670-Menge bindet an die gemeinsame Region beider Isoformen. Unter optimierten Bedingungen wurden für beide Sondensätze unterschiedliche smFISH-Spots eindeutig identifiziert. Die beiden Sondensets wurden verwendet, um die NDC80-Expression während des vegetativen Wachstums und der Meiose zu untersuchen.

In vegetativen Zellen wurde ein robustes Signal vom Sondenset Q 670 detektiert, nicht jedoch vom Sondenset CF 590. Im Gegensatz dazu wurde ein robustes Signal von beiden Sondensätzen in der meiotischen Prophase detektiert, und die Mehrzahl der Spots hatte ein co-lokalisiertes Signal. Die Northern-Blot-Analyse bestätigte, dass die lange Isoform spezifisch in der Meiose exprimiert wurde.

Es wurde festgestellt, dass vegetative Zellen einen Median von fünf kurzen Isoform-Transkripten pro Zelle aufwiesen, während in meiotischen Prophase-Zellen der Median signifikant auf vier Transkripte pro Zelle sank. In der meiotischen Prophase betrug die mediane Anzahl langer Isoform-Transkripte pro Zelle 21 und 100% der Zellen exprimierten das Transkript. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 72 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, zunächst die Aufschlussdauer und die Konzentration der smFISH-Sonden zu optimieren, die erforderlich sind, um das optimale Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Denken Sie außerdem daran, VRC während der Verdauung und der Hybridisierung über Nacht hinzuzufügen, um die Nukleaseaktivität zu verhindern. Mit dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die dynamische Genregulation und die Lokalisierung subzellulärer RNA zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelmolekulare RNA-FISH bei knospenden Hefemeiosen durchführt.