Name: Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Erfahren Sie die optimierte smFISH-Methode zur Quantifizierung einzelner RNA-Moleküle in Hefe während vegetativen Wachstums und Meiose. Diese Technik offenbart zelluläre Variabilität der Genexpression und subzelluläre RNA-Lokalisierung.

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Wir bedanken uns bei Anne Dodson und Stephanie Heinrich für Ratschläge, wie Sie das SmFISH-Protokoll zu optimieren, Xavier Darzacq für helfen bei der Analyseplattform, Haiyan Huang für Anregungen über die statistische Auswertung. Diese Arbeit wurde mit Mitteln der March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) und Glenn Foundation zu EÜ und NSF Graduate Research Fellowship Grant No unterstützt. DGE-1106400, JC.

Hinweis: Alle Puffer und in diesem Protokoll verwendeten Medien sind in Tabelle 1aufgeführt. Die Herstellerinformationen für Reagenzien wird in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
Tag 1/Tag 1-2:
Hinweis: Für die vegetative Kultur wachsen Sie Zellen zu einem OD-600 von 0,4 bis 0,6 in ein bevorzugtes Medium. Induzieren Sie für die meiotische Kultur Zellen Meiose eine bevorzugte Methode (in der Regel in einem OD-600 von 1,85 Kultivierung) zu unterziehen.
1. Probe Fixierung und Verdauung
<ol><li>Insgesamt ~3.5 OD600 Zellen in 3 % Formaldehyd zu beheben.<ol>
<li>Fügen Sie für vegetative Kultur 5,52 mL Kultur zu 480 µL 37 % Formaldehyd in 15 mL konische Röhrchen hinzu.</li>
		<li>Meiotische Kultur fügen Sie 1840 µL der Kultur zu 160 µL 37 % Formaldehyd in 2-mL Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Invertieren ~ 5 Mal zu mischen. Achtung: Formaldehyd ist giftig. Handhabung und Entsorgung nach institutionellen Regelungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eine Bandage bei Raumtemperatur für 20 min Rohre aufsetzen. Für meiotische Proben nach der Fixierung bei Raumtemperatur für 20 min Befestigung über Nacht bei 4 ° c weiter, drehen. Hinweis: Die Übernachtung Fixierung erhöht die Reproduzierbarkeit und die Qualität der SmFISH Daten für meiotische Proben. Fixierzeit sollte optimiert werden.</li>
	<li>Während der Proben beheben, tauen Sie 200 mM Vanadyl Ribonucleoside komplexe (VRC) bei 65 ° c für mindestens 10 min auf.</li>
	<li>Verdauung-master-Mix in einem 15-mL-Tube vorzubereiten: 425 µL Puffer B mix für 1 Probe mit 40 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c); 2125 µL Puffer B mix für 5 Proben mit 200 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c). Vortex ~ 5 s voll Aufschwemmen der VRC vor dem Hinzufügen zu den master-Mix, der leicht bräunlich grün nach VRC Zugabe erscheint. Hinweis: Zugabe von VRC während der Verdauung verbessert die Konsistenz der SmFISH Ergebnisse, möglicherweise durch Hemmung der Nuklease Verunreinigung durch die Zymolyase-Mischung, die aus Rohöl Extrakt gereinigt wird eingeführt. Die Höhe der VRC erforderlich bei diesem Schritt sollte optimiert werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für vegetative Proben Schläuche am ~ 1057 X g 3 Minuten lang. Für meiotische Proben (nach der Übernachtung Fixierung) Zentrifugieren bei 21.000 x g für 1,5 min. Dekantieren oder Aspirieren des Überstands zu Formaldehyd Verschwendung. Hinweis: Die Zentrifugation Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 1,5 mL kaltem Puffer B durch pipettieren rauf und runter oder durch Umkehrung der Rohre und streichen um zu mischen. Übertragen Sie vegetative Proben auf 2-mL-Tuben nach Wiederfreisetzung.</li>
	<li>Zentrifuge bei 21.000 x g für 1,5 min. entfernen Sie den Großteil der Flüssigkeit durch Vakuum Aspiration oder pipettieren, ~ 100 µL hinterlässt.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen in 1,5 mL kaltem Puffer B.</li>
	<li>Zentrifuge bei 21.000 x g für 1,5 min. entfernen Sie den Großteil der Flüssigkeit durch Vakuum Aspiration oder pipettieren, ~ 100 µL hinterlässt.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie Zellen in 1,5 mL kaltem Puffer B. Zentrifuge bei 21.000 x g für 1,5 min. Absaugen der Flüssigkeit vollständig durch Vakuum oder pipettieren.</li>
	<li>Aufzuwirbeln Sie Zellen in 425 µL Verdauung master-Mix und kurz Vortex zu Aufschwemmen. Jedes Rohr 5 µL 100 t 10 mg/mL Zymolyase hinzufügen. Hinweis: Vortex Zymolyase jedes Mal, wenn die Rohre vor hinzufügen. Fügen Sie Zymolyase für jedes Rohr einzeln hinzu, anstatt zu den master-Mix. Beide Schritte helfen Verdauung Konsistenz unter den Röhren zu gewährleisten, weil Zymolyase schnell ausfällt.</li>
	<li>Vortex 2-3 s zu mischen. Legen Sie die Röhren auf eine Bandage, und bei 30 ° c für 15-30 min zu verdauen. Für vegetativen Zellen und meiotischen Anfangsphase in der Regel dauert es ca. 15 min und meiotischen Divisionen und meiotischen Prophase dauert in der Regel ~ 30 min. Hinweis: Überprüfen Sie auf dem Mikroskop alle 5 min nach 15 min und stoppen Sie die Verdauung zu, wenn ~ 80 % der Zellen nicht transparent und nicht-Refraktive erscheinen. Von diesem Zeitpunkt an Zellen sind sehr zerbrechlich. Handhaben Sie Zellen vorsichtig und vermeiden Sie die Verwendung von Vakuum Aspiration oder Vortexen.
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen die Flüssigkeit vollständig durch pipettieren.</li>
	<li>Sanft Aufschwemmen Zellen mit 1 mL Puffer B durch pipettieren oben und unten 1 - 2 Mal zu mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen Puffer B Flüssigkeit durch pipettieren. Aufschwemmen Sie sanft Zellen in 1 mL 70 % igem Ethanol (mit RNase-freies Wasser verdünnt).</li>
	<li>3,5-4 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
</ol>2. Hybridisierung
<ol><li>Formamid auf Raumtemperatur bringen (für 50-mL-aliquoten, dauert es ca. 30 min im Wasserbad). Hinweis: Öffnen Sie die Formamid-Flasche nicht, bis die Flasche Raumtemperatur zur Vermeidung von Oxidation von Formamid erreicht. Achtung: Formamid ist giftig. Handhabung und Entsorgung nach institutionellen Regelungen.</li>
	<li>10 % Formamid Waschpuffer in einem 15 mL konische Röhrchen vorzubereiten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen 500 µL 70 % Ethanol durch pipettieren. Sanft nach oben und unten zu Aufschwemmen der verbleibenden Zellen, und übertragen Sie dann die Zellen auf niedrigem Kraftschlußbeiwert Röhrchen pipettieren. Hinweis: Mit niedrigem Kraftschlußbeiwert Rohre stark Zellverlust reduziert, bei nachfolgenden Wäschen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre wieder bei ~ 376 X g für 3 min. entfernen das Ethanol durch pipettieren.</li>
	<li>Hinzufügen 1 mL 10 % Formamid Waschpuffer und sanft pipettieren rauf und runter 2-3mal Aufschwemmen der Zellen.</li>
	<li>Lassen Sie die Zellen, die bei Raumtemperatur für ~ 20 min sitzen, während der Vorbereitung der Hybridisierung-Lösung. Vermischen Sie für 1 Probe 50 µL der Hybridisierung Puffer (Raum Temp), 5 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c) und 1 µL jede Sonde (200 nM Final). Vermischen Sie für 5 Proben 250 µL Hybridisierung Puffer (Raum Temp), 25 µL 200 mM VRC (erwärmt auf 65 ° c) und 5 µL jede Sonde (200 nM Final).<ol>
<li>Tauen Sie Hybridisierung Puffer (bei-20 ° c eingefroren) auf Raumtemperatur vor dem Öffnen der Tube um Formamid Oxidation zu verhindern.</li>
		<li>Nach Zugabe von 200 mM VRC, Wirbel für 5-10 s vor dem Hinzufügen der Sonden sind die entwickelt und kommerziell erworben und gemäß den Anweisungen des Herstellers rekonstituiert.</li>
		<li>Wenn zwei Sonden Co inkubierten sind, fügen Sie 1 µL der 01:10 Verdünnung der Sonde #1 bestand, sowie 1 µL der 01:10 Verdünnung der Sonde #2 Lager, zu einer Endverdünnung von ~ 1: 500 für jede Sonde. Die Konzentration für die beste Signal-Rausch-Verhältnis muss optimiert (siehe Diskussion für Details).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Entfernen des Überstands in Sondermüll durch pipettieren.</li>
	<li>Jedes Rohr mindestens 50 µL der Hybridisierung Lösung hinzufügen. Streichen Sie die Rohre zu mischen.</li>
	<li>Mindestens 16 Stunden im Dunkeln bei 30 ° c auf eine Bandage inkubieren.</li>
</ol>2/3 Tag
3. Waschen und imaging
<ol><li>Bringen Sie Formamid auf Raumtemperatur.</li>
	<li>10 % Formamid Waschpuffer (FWB) in einem 15 mL konische Röhrchen vorzubereiten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Röhren aus der Bandage und legen Sie sie in ein Feld Folie abgedeckt, um vor Licht zu schützen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Entfernen des Überstands in Sondermüll durch pipettieren.</li>
	<li>In 1 mL 10 % FWB durch sanft auf und ab pipettieren Aufschwemmen 2-3 Mal.</li>
	<li>Inkubation bei 30 ° c für 30 min (nicht rotierend) im Feld Folie abgedeckt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Überstands um gefährliche Abfälle durch pipettieren entfernen und verlassen Sie ~ 50 µL zu.</li>
	<li>Unterdessen bereiten DAPI/FWB in einem 15 mL konische Röhrchen: 1000 µL 10 % Formamid Waschpuffer mit 1 µL von 5 mg/mL DAPI für 1 Probe vermischen. Mischen Sie für 10 Proben 10 mL 10 % Formamid Waschpuffer mit 10 µL von 5 mg/mL DAPI. In 1 mL DAPI/FWB durch sanft auf und ab pipettieren Aufschwemmen 2-3 Mal.</li>
	<li>Inkubation bei 30 ° c für 30 min (nicht rotierend) im Feld Folie abgedeckt.</li>
	<li>Anti-Bleichmittel Reagenzien auf Eis Auftauen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben bei ~ 376 X g für 3 min. Entfernen des Überstands vollständig durch pipettieren. Bei Bedarf wieder entfernen Sie alle des Überstands Zentrifugieren.</li>
	<li>Für Proben, die nicht sofort abgebildet sind, erneut das Pellet in 50 µL GLOX-Puffer ohne Enzyme. Pipettieren rauf und runter 3-bis 4-Mal zu mischen.<ol>
<li>Halten Sie alle unimaged Proben im Feld Folie bedeckt bei 4 ° c bis bereit zu Bild. Wenn Sie bereit zum Bild, die Proben bei ~ 376 X g für 2 min zentrifugieren und überstand vollständig durch pipettieren entfernen. Aufschwemmen Sie in GLOX mit Enzymen wie unten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie für die Proben sofort abgebildet wird 15-20 µL GLOX-Puffer mit Enzymen. Pipettieren Sie sanft auf und ab zu mischen. Hinweis: Das Volume hinzugefügt kann variieren abhängig von der Größe des Pellet-Zelle. Wir empfehlen resuspending das Pellet in 15 µL GLOX-Puffer mit Enzymen und prüfen die Zelldichte am Mikroskop. Wenn Zellen sind zu dicht (Zellen verklumpen übereinander), fügen Sie zusätzliche GLOX-Puffer mit Enzymen. Wenn Zellen zu spärlich sind, Zentrifugieren der Probenmaterials und ~ 5 µL Puffer zu entfernen.</li>
	<li>Pipettieren 5 µL auf ein Deckglas (18 mm x 18 mm, Nr. 1), und setzen Sie das Deckglas auf einer Folie.</li>
	<li>Setzen Sie eine Labor wischen auf der Folie platziert das Deckglas. Drücken Sie vorsichtig auf das Labor-Tuch, Folie festlegen (siehe flüssige Abspringen von allen vier Rändern der das Deckglas sollte).</li>
	<li>Übertragen der Folie auf das Mikroskop-Zimmer in einer Box von Alu-Folie abgedeckt.</li>
	<li>Bild mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit starker Vergrößerung (60-100 X) und hoher numerischer Apertur. Hinweis: Um die maximale Anzahl der Photonen, die durch die SmFISH Sonden zu sammeln, sind konfokale Mikroskope nicht empfohlen, da sie die Menge des Lichtes zu erhebenden erheblich einschränken. Hier die Daten auf einem Mikroskop, ausgestattet mit einem 100 X 1,4 NA Ziel, Verwendung von Filtern CY5 (EX632/22, EM679/34) abgebildet bei 1,3 s, 100 % T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100 % T; und DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, 32-50 % T. Hellfeld Referenzbild sollte auch erworben werden. Erwerben von 15-25 Scheiben mit einer Schrittweite von 0,1-0,2 µm, von ganz unten im Mittelpunkt das Sichtfeld zu ganz oben, um sicherzustellen, dass alle die RNA-Spots entfallen.</li>
</ol>(4) Bildanalyse
<ol><li>Analysieren Sie die SmFISH-Daten mit veröffentlichten SmFISH Analyse-Tools wie Fisch-Quant17 und StarSearch2oder kundenspezifischen Programmen, je nach der genauen Anforderungen des Experiments. Hinweis: Eine gute Analyse-Pipeline soll erlauben den Benutzern, eine Schwelle, die wahre RNA-Spots vom Hintergrund zu trennen, und Ausgang Statistiken wie die X, Y und Z Koordinaten (optionalen) und die Intensität von jedem Fleck, die Anzahl der Plätze in jeder Zelle zu bestimmen , und eventuell Anpassung als ein Weg, um Fehlalarme herausfiltern.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt, offen zu legen.

Das Protokoll hier vorgestellten stammt von anderen veröffentlichten SmFISH Protokolle2,3,21,22,23, und ist speziell für den Hefe-Stamm Hintergrund SK1 optimiert. Die Parameter optimiert enthalten Zellzahl, Fixierung Dauer, Zentrifugation Geschwindigkeit und Dauer, Dauer der Verdauung, Verdauung Puffer, Sonde Konzentration und Hybridisierung Puffer. Andere Parameter wie Hybridisierung Temperatur und Dauer wurden nicht optimiert. In diesem Abschnitt haben wir ein paar Hinweise, die helfen würden, dieses Protokoll Hefe-Stamm-Hintergrund und die Wachstumsbedingungen von Interesse anzupassen.
Die Zellwand der angehende Hefe ist eine große Herausforderung gegen hochwertige SmFISH Bilder in der angehenden Hefe zu erhalten, weil die Zellwand Sonde Eindringen verhindert. Unvollständige Verdauung der Zellwand von Zymolyase führt zu ineffizienter Hybridisierung von Sonden und hohe Variabilität von Zelle zu Zelle im Signal. Aber können über Verdauung Zellen zu schwach zu machen, führt zu erheblichen Zell-Verlust während der Waschschritte und Zelle platzt während der Vorbereitung der Folie für die Bildgebung. Daher ist es entscheidend, die Dauer der Verdauung zu optimieren. Wir empfehlen die Durchführung eines pilot SmFISH Experiments durch Verdauung derselben Probe für unterschiedlich lange. In unserem Fall haben wir die besten SmFISH Daten Wenn wir die Verdauung hielten bei ~ 80 % der Zellen nicht Refraktive wurde. In der Regel können für dasselbe Wachstum, verschiedene genetische mutierte Stämme mit ähnlicher Timing verdaut werden. Allerdings unterscheidet sich die Dauer der Verdauung Vergleich unter verschiedenen Wachstumsbedingungen und verschiedenen Phasen der Meiose in der angehenden Hefe. Sobald der Zeitpunkt bestimmt ist, ist die Qualität der SmFISH reproduzierbar. Hinweis kann für mutierte Stämme mit defekten Zellwand-Synthese und/oder Zusammensetzung, Verdauung in weniger als 15 min. Einsatz verschiedener Chargen Zymolyase durchgeführt werden kann auch leicht die Verdauung Timing ändern.
Optimale Sonde Konzentration ist erforderlich, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Wir entwarfen und unsere SmFISH Sonden im Handel gekauft. Gute Sonden (oft 20-Mers) sollte einen Prozentsatz von GC von 35 % bis 45 %, ein Mindestabstand von 2 Basenpaare zwischen Fühler und geringe Kreuzreaktivität haben. Wir einen Web-basiertes Sonde Designer vom Hersteller verwendet, um eine Liste der Sonden generieren, und gäbe es genügend Sonden zur Auswahl, wir würde Nutzen des BLAST-Algorithmus in der Saccharomyces-Genom-Datenbank die Sonden mit mehr als 17 Basenpaaren überlappt zu beseitigen mit anderen genomischen Regionen. Wir entschieden uns für mehr photostabilen Fluoreszenzfarbstoff (CAL-Fluor-590) für die Sonde gesetzt, die die einzigartige Region NDC80Luti (CF 590) glüht, weil in dieser Reihe, die Anzahl der Sonden, die alle der oben genannten Kriterien (20 Proben) zufrieden niedriger als war die minimale Anzahl der vom Hersteller empfohlenen (~ 25-Sonden). Nach dem Neuaufbau der Sonde Lösung nach den Anweisungen des Herstellers, wir machten eine 01:10 Verdünnung der Stammlösung und die verdünnte Lösung in 5 µL Aliquots bei-20 ° c gelagert. Jedes aliquoten wurde nur ein einziges Mal verwendet. Für die Optimierung sollte man serielle Verdünnungen ab dem 01:10 verdünnt, Lösung und testen, welche Konzentration das beste Signal-Rausch-Verhältnis ergibt. Wir empfehlen, dass eine Verdünnungsreihe 1: 250, 1: 500, 1: 1000 und 1: 2000 aus dem ursprünglichen bestand. In unserem Fall führte ein Verdünnungsfaktor von 1: 500 das beste Signal-Rausch-Verhältnis für die CF-590 und Q-670-Sonde-Sets.
Optimale Fixierung ist auch entscheidend für erfolgreiche SmFISH in der angehenden Hefe. Wir fanden, dass über Nacht Fixierung bei 4 ° c, anstatt Befestigung bei Raumtemperatur für 20 min, verbessert die Konsistenz und Qualität der SmFISH Ergebnisse für meiotische Proben. Obwohl wir nicht getestet haben, wie über Nacht Fixierung vegetative Proben auswirken könnten, Fixierung bei Raumtemperatur gut für dieses Wachstum Zustand gearbeitet. Also, um das SmFISH-Protokoll für neue Stämme oder Wachstumsbedingungen zu optimieren, empfehlen wir beginnend mit kurze Fixierzeit bei Raumtemperatur und Erhöhung der Fixierzeit, wenn hohe Variabilität des Signals aufgetreten ist.
Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Protokollen3,22,23, nutzt unser Protokoll die RNase-Inhibitor VRC während der Verdauung und eine höhere Konzentration von VRC während Hybridisierung. Ergänzung der VRC in diesen zwei Schritten verbessert die Konsistenz der SmFISH Ergebnisse, möglicherweise durch eine bessere Erhaltung der RNA-Moleküle gegen Nuklease Aktivität, die durch die Zymolyase-Mischung eingeführt werden können (das Enzym wird aus groben Extrakten gereinigt und RNase enthalten kann (Verunreinigungen). Daher empfehlen wir die Menge der VRC wie entnehmen Sie bitte unserem Protokoll oder sogar höhere Konzentrationen von VRC für Optimierung.
Ein erheblicher Teil der Zellen kann während Waschschritten in Puffer B und die Formamid Waschpuffer verloren. Um Zellverlust zu reduzieren, könnte man die Zentrifugation Geschwindigkeit erhöhen. In unserem Fall wäscht mit einer hohen Geschwindigkeit (21.000 x g) zu unseren Proben innerhalb der Puffer B Pellets deutlich reduzierten Zellverlust. Jedoch werden die Zellen sehr zerbrechlich nach Zymolyase Verdauung, daher Zentrifugation Geschwindigkeit ändern nicht empfohlen. Stattdessen empfehlen wir die niedrigem Kraftschlußbeiwert Rohre aus USA, die wesentlich dazu beitragen, die Zellen während der Wäschen in der Formamid Waschpuffer pellet. Insgesamt kann unser Protokoll konsequent eine Monolage Zellen dicht genug für die effiziente Bildgebung generieren. In der Regel 7 Gesichtsfelder nachgeben sollte > 130 Zellen geeignet für Quantifizierung.
Zu guter Letzt ist es wichtig zu bestimmen, die optimale Parameter für und die Ausgänge von Bildanalyse erforderlich. Um SmFISH Flecken zu erkennen, veröffentlichten Analyse-Programme häufig filtern die raw-Bilder mit "glockenförmig" Kernel um Hintergrundsignal zu entfernen, und fordern Sie die Benutzer zu bestimmen, das Signal-Rausch-Verhältnis, für jeden Satz von Bildern2,17zu verwenden. Leider gibt es derzeit kein einheitlichen Standard die richtigen Parametern bestimmt, und so einige empirische Tests diese unterschiedlichen Einstellungen ist notwendig. Zur Einstellung der Parameter für jeden dieser Schritte benötigt, braucht man iterativ unterschiedliche Parameter eingeben und überprüfen, wie gut die Ergebnisse aus jedem Satz entspricht, die von der manuellen Zählung in ein paar repräsentative Zellen. Sobald eine Reihe von Parametern gefunden wird, kann es für den Großteil der Bilder, die trotz unterschiedlichen Wachstumsbedingungen und genetische Hintergründe verwendet werden.
Darüber hinaus kann man testen, ob maximale Intensität Projektion der SmFISH Bilder vor der Quantifizierung22durchgeführt werden kann. Dieser Schritt den spot Erkennungsalgorithmus vereinfacht und reduziert bildgebenden Zeit, allerdings auf Kosten der potenziell nützliche Informationen zu einzelnen Flecken, wie ihre subzelluläre Lokalisation. In unserem Fall war die Anzahl der mRNA-Moleküle, die durch das NDC80 -gen produziert niedrig genug, dass die Flecken gut, nach dieser Bearbeitung (nicht selten getrennt wurden für Transkripte in angehende-3,7 Hefe). In Fällen, in denen die ns1 Analyse entscheidend ist, muss die Analyse Pipeline zur Bestimmung der Position jeder SmFISH Stelle in jedem Kanal ns1 beurteilen. Je nach den konkreten Fragen gestellt, weitere Informationen wie die Intensität von jedem Fleck möglicherweise auch die Pipeline zur weiteren Analyse entnommen werden. Optimierung des Schlüssels Schritte in das Protokoll und die Bild-Analyse-Pipeline ist entscheidend bei der Beschaffung von hohen Qualität der SmFISH Daten, die Frage von Interesse zu studieren.

Dynamische Regulation der Genexpression treibt die Entwicklung eines Organismus, sowie seine Reaktion auf Umwelteinflüsse, Infektionen und Veränderungen im Stoffwechsel. Studien, die sich auf transcriptional Regelung setzen auf Technologien, die RNA Fülle zu messen. Eine solche Methode, als einzelnes Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) dient zur Erkennung von einzelnen RNA-Moleküle in einzelne Zellen1,2. Diese Methode ermöglicht die Messung der Zell-Zell-Variabilität in der Genexpression und Bestimmung der intrazellulären RNA-Lokalisierung.
In der am häufigsten verwendeten SmFISH-Technik erfordert Erkennung von einem einzelnen RNA-Molekül mehrere kurze DNA-Sonden (oft ~ 48 20-Mer Sonden), die komplementär zu der Ziel-RNA und sind auf der gleichen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert. Bindung von einzelnen fluoreszierende Sonden führt zu schwaches Signal, aber das Signal aus dem Ensemble der Sonden ist robust. Diese Funktion verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis, denn obwohl eine einzelne Sonde Ziel Bindung aufweisen kann, solches Signal erwartet wird sehr schwach im Vergleich zu der der Ziel-RNA-Molekül3. Innerhalb Fehler erkennen kann die Anzahl der RNA-Moleküle gezählt und verglichen, in ganz verschiedenen Wachstumsbedingungen und unter verschiedenen Mutanten.
Seit seiner ersten Entwicklung ist SmFISH angepasst worden, um verschiedene Aspekte der Gene Expression4, z. B. Transkription Dehnung1,2,5,6, transkriptionelle platzen7 Spleißen studieren , 8 , 9, intrazelluläre allelic Ausdruck10,11,12und RNA Lokalisierung13,14,15. Vor kurzem haben wir diese Methode verwendet, um die Expression von zwei Transkript Isoformen des gleichen Gens, in dem studieren der kurzen Transkript Isoform (NDC80ORF) hat seine gesamte Sequenz gemeinsam mit der langen Isoform (NDC80Luti )16. Zur eindeutigen Identifizierung der beiden Isoformen von mRNA, wir verwendeten Sonde zweierlei: ein Satz bezieht sich auf die einzigartige Abfolge der NDC80Lutiund die andere Gruppe, zu einem anderen Fluoreszenzfarbstoff konjugiert bindet an die gemeinsame Region der beiden Isoformen. NDC80Luti RNA wird als ein colocalized Ort mit beide fluoreszierende Signale identifiziert, während die NDC80ORF RNA ist derjenige, der nur das Signal aus dem gemeinsamen Sonde Set enthält. Da die Anzahl der der NDC80ORF Abschriften wird berechnet, indem eine "Subtraktion" Methode, hohe Effizienz der Sonde Hybridisierung und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis sind notwendig, um selbstbewusst SmFISH Flecken erkennen und reduzieren Fehler Ausbreitung.
Dieses Whitepaper beschreibt ein optimiertes Protokoll für die Durchführung von SmFISH in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae. In dieses Protokoll, die Zellenzahl, Fixierzeit, Dauer der Verdauung, Verdauung Puffer, Sonde Konzentration und Hybridisierung Puffer für die SmFISH Experimente verwendet wurden optimiert für den SK1 Stamm Hintergrund S. Cerevisiae unterziehen vegetative Wachstum oder Meiose. Allerdings haben wir auch in diesem Manuskript beachten: (1) die Methode zum Überprüfen der Qualität der SmFISH Daten nach der Bildaufnahme und (2) die Schritte in das Protokoll, die zusätzliche Optimierung für verschiedene Belastungen Hintergründe und Wachstumsbedingungen erfordern.

<table><tbody><tr><td>BSA, RNase-frei (50 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Bei -20 μC lagern.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C für kurzfristig. Vor Gebrauch vortexen.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Lagern bei -20 &deg; C nach Rekonstitution in Wasser. Vor Licht schützen.</td></tr><tr><td>50% Dextransulfat</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Bei Raumtemperatur lagern. Sehr viskose Flüssigkeit. Gehen Sie mit Geduld vor.</td></tr><tr><td>E. coli tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Bei -20 &deg lagern; C in Aliquoten nach Rekonstitution in Wasser.</td></tr><tr><td>Ethanol (100%, 200 proof)</td><td>diverse</td><td></td><td>Entzündlich.</td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Bei Raumtemperatur lagern. Giftig. Verwenden und entsorgen Sie es mit Vorsicht.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Bei 4 °C lagern. Öffnen, nachdem sich die Temperatur an die Raumtemperatur angepasst hat, um eine Oxidation zu verhindern. Giftig. Verwenden und entsorgen Sie es mit Vorsicht.</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>verschieden</td><td></td><td>Bei 4 & Grad lagern; C nach dem Auflösen in nukleasefreiem Wasser.</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Bei -20 & Grad lagern; C in Aliquoten nach Rekonstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat (einbasig und zweibasig)verschiedenes</td><td></td><td></td> <td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Sondenbibliothek, verdünnt in TE, pH 8,0&nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Store bei -20 &deg; C in Aliquoten (5 &micro; L) nach Rekonstitution in TE pH 8,0 gemäß den Anweisungen des Herstellers. Vor Licht schützen.</td></tr><tr><td>Sorbit</td><td>verschiedenes</td><td></td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>TE, pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Lagern bei -20 > C in Aliquoten.</td></tr><tr><td>200 mM Vanadyl-Ribonukleosid-Komplex (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Bei -20 μg lagern; C in Aliquoten nach der Rekonstitution gemäß den Anweisungen des Herstellers.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Lagern bei -20 & Grad; C in Aliquoten nach Rekonstitution in Wasser.</td></tr><tr><td>Tuben mit geringer Adhäsion</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr></tbody></table>

einzigen molekül fluoreszenz in situ hybridisierung (smfish) analyse in knospen hefe vegetativen wachstums und meiose

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Einzelnes Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) ist eine leistungsstarke Technik, Genexpression in Einzelzellen aufgrund seiner Fähigkeit, zu erkennen und zählen die einzelnen RNA-Moleküle zu studieren. Ergänzend zu deep Sequencing-basierte Methoden, SmFISH liefert Informationen über die Zell-Zell-Variation im Transkript Überfluss und die subzelluläre Lokalisation einer bestimmten RNA. Vor kurzem haben wir SmFISH verwendet, um die Expression des Gens NDC80 während der Meiose in der angehenden Hefe zu studieren, in welche zwei Niederschrift Isoformen vorhanden und kurze Niederschrift Isoform hat seine gesamte Sequenz mit der langen Isoform geteilt. Um jede Abschrift Isoform selbstbewusst zu identifizieren, wir optimierte bekannt SmFISH Protokolle und erzielt hohe Konsistenz und Qualität der SmFISH Daten für die Proben während angehende erworben Hefe Meiose. Hier beschreiben wir diese optimierte Protokoll, die Kriterien, die wir verwenden, um festzustellen, ob hoher Datenqualität SmFISH gewonnen wird, und ein paar Tipps für die Durchführung dieses Protokolls in anderen Hefestämme und Wachstumsbedingungen.

Dieses Molekül Fluoreszenz in Situ Hybridisierung Protokoll ist optimiert, um die Anzahl der RNA-Moleküle in der angehenden Hefe während des vegetativen Wachstums und Meiose zu quantifizieren.

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Das übergeordnete Ziel dieser optimierten Einzelmolekül-RNA-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist es, einzelne RNA-Moleküle während des vegetativen Wachstums und der Meiose von knospenden Hefen pro Zelle zu detektieren und zu quantifizieren. Diese Methode zeigt die Variabilität der Genexpression von Zelle zu Zelle bei der subzellulären RNA-Lokalisierung auf und ist daher eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der Genregulation. Abgesehen von den einzigartigen Informationen, die durch smFISH preisgegeben werden können, besteht der Hauptvorteil der Technik darin, dass sie, sobald sie optimiert ist, robust und hochgradig reproduzierbar ist.Für die Demonstration dieses Protokolls wird eine meiotische Kultur verwendet. Um die Kultur in 3 % Formaldehyd zu fixieren, fügen Sie 1840 Mikroliter der Kultur zu 160 Mikrolitern 37 % Formaldehyd in einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Zum Mischen etwa fünfmal umkehren.Legen Sie das Rohr 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf eine Rolltrommel. Nach 20 Minuten bei vier Grad Celsius mit Rotation über Nacht weiter fixieren. Bereiten Sie sich am nächsten Tag auf den Aufschluss vor, indem Sie zunächst 200 millimolare Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe (VRC) mindestens 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius auftauen.Zur Herstellung des Aufschlussmastermixes pipettieren Sie zunächst 2125 Mikroliter Puffer B in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Wirbeln Sie dann das warme VRC fünf Sekunden lang vortexen, um es vollständig zu resuspendieren, und fügen Sie dem 15-Milliliter-Röhrchen 200 Mikroliter VRC hinzu. Die Mischung sollte eine hellbräunlich-grüne Farbe haben.Die meiotische Probe wird bei 21.000 x g eineinhalb Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und platzieren Sie die Vakuumspitze auf der gegenüberliegenden Seite des Pellets, um das Pellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen in eineinhalb Millilitern kaltem Puffer B, indem Sie zum Mischen auf und ab pipettieren.Bei 21.000 x g eineinhalb Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie den Großteil der Flüssigkeit durch Vakuumaspiration, so dass etwa 100 Mikroliter zurückbleiben. Resuspendieren Sie die Zellen in eineinhalb Millilitern Kaltpuffer B. Zentrifugieren Sie die Proben, entfernen Sie die Flüssigkeit und resuspendieren Sie die Zellen erneut in eineinhalb Millilitern Kaltpuffer B.Bei 21.000 x g eineinhalb Minuten zentrifugieren. Saugen Sie die Flüssigkeit durch Pipettieren vollständig ab. Die Zellen in 425 Mikrolitern Verdauungsmastermix resuspendieren und kurz vortexen.Geben Sie fünf Mikroliter Zymolyase in das Röhrchen und wirbeln Sie es zwei bis drei Sekunden lang, um es zu mischen. Stellen Sie das Röhrchen auf eine Rolltrommel und verdauen Sie es 15 bis 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Nach 15 Minuten kontrollieren Sie die Zellen alle fünf Minuten mikroskopisch und stoppen die Verdauung, wenn etwa 80% der Zellen undurchsichtig und nicht refraktiv erscheinen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 376 x g für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand vollständig. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter Puffer B, indem Sie ein- bis zweimal auf und ab pipettieren, um zu mischen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen und entfernen Sie den Puffer. Die Zellen werden vorsichtig in einem Milliliter 70%igem Ethanol resuspendiert und dreieinhalb bis vier Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Um das Hybridisierungsverfahren zu beginnen, zentrifugieren Sie das Zellröhrchen bei 376 x g für drei Minuten.Entfernen Sie 500 Mikroliter des 70%igen Ethanols aus der Tube. Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die verbleibenden Zellen wieder zu resuspendieren, und übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen mit geringer Adhäsion. Das Überführen der Probe in ein Röhrchen mit geringer Adhäsion ist entscheidend, um einen übermäßigen Zellverlust während der nachfolgenden Formamid-Waschungen zu verhindern.Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit geringer Haftung und entfernen Sie das gesamte Ethanol. Geben Sie einen Milliliter 10%igen Formamid-Waschpuffer in das Röhrchen und pipettieren Sie vorsichtig zwei- bis dreimal auf und ab, um die Zellen wieder zu resuspendieren. Lassen Sie die Zellen etwa 20 Minuten lang bei Raumtemperatur aushärten, während Sie die Hybridisierungslösungen vorbereiten, wie im Textprotokoll beschrieben.Die Probe zentrifugieren und den Überstand in den Sondermüll entfernen. Geben Sie mindestens 50 Mikroliter jeder Hybridisierungslösung in das Röhrchen und schnippen Sie das Röhrchen zum Mischen. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius auf einer Walzentrommel für mindestens 16 Stunden im Dunkeln.Wenn die Hybridisierung abgeschlossen ist, legen Sie die Röhre mit den Zellen in eine mit Folie abgedeckte Box, um sie vor Licht zu schützen. Die Probe wird bei 376 x g drei Minuten lang zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren in den Sondermüll.Resuspendieren Sie die Probe in einem Milliliter 10%iger Formamid-Waschpuffer, indem Sie zwei- bis dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren. Legen Sie das Röhrchen mit den Zellen zum Schutz vor Licht wieder in eine mit Folie bedeckte Box und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die Probe.Entfernen Sie den Überstand zu Sonderabfällen durch Pipettieren, wobei etwa 50 Mikroliter übrig bleiben. Resuspendieren Sie die Probe in einem Milliliter DAPI-Lösung, indem Sie zwei- bis dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren. Legen Sie das Röhrchen mit den Zellen erneut in die mit Folie bedeckte Box und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius.Die Probe zentrifugieren und den Überstand durch Pipettieren vollständig entfernen. Bei Proben, die nicht sofort abgebildet werden, resuspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern GLOX-Puffer ohne Enzyme. Pipettieren Sie drei- bis viermal auf und ab, um zu mischen.In der mit Folie abgedeckten Schachtel bei vier Grad Celsius aufbewahren, bis das Bild fertig ist. Für Proben, die sofort abgebildet werden, fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter GLOX-Puffer mit Enzymen hinzu. Pipettieren Sie fünf Mikroliter auf ein Deckglas und legen Sie das Deckglas auf einen Objektträger.Legen Sie ein Labortuch auf den Objektträger, auf dem sich der Deckglas befindet. Drücken Sie vorsichtig auf das Tuch, um den Schieber einzustellen. Legen Sie den Objektträger in eine mit Aluminiumfolie bedeckte Schachtel, um ihn in den Mikroskopraum zu bringen.Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Expression des NDC80-Gens zu untersuchen, das zwei mRNA-Isoformen exprimiert. Die lange, undekodierte Transkript-Isoform hat im Vergleich zur kurzen Isoform eine Ausdehnung von 400 Basenpaaren mit fünf Primzahlen. Es wurden zwei Sondensätze entwickelt.Die CF 590-Menge bindet an die einzigartige Fünf-Primzahl-Region der langen Isoform, und die Q 670-Menge bindet an die gemeinsame Region beider Isoformen. Unter optimierten Bedingungen wurden für beide Sondensätze unterschiedliche smFISH-Spots eindeutig identifiziert. Die beiden Sondensets wurden verwendet, um die NDC80-Expression während des vegetativen Wachstums und der Meiose zu untersuchen.In vegetativen Zellen wurde ein robustes Signal vom Sondenset Q 670 detektiert, nicht jedoch vom Sondenset CF 590. Im Gegensatz dazu wurde ein robustes Signal von beiden Sondensätzen in der meiotischen Prophase detektiert, und die Mehrzahl der Spots hatte ein co-lokalisiertes Signal. Die Northern-Blot-Analyse bestätigte, dass die lange Isoform spezifisch in der Meiose exprimiert wurde.Es wurde festgestellt, dass vegetative Zellen einen Median von fünf kurzen Isoform-Transkripten pro Zelle aufwiesen, während in meiotischen Prophase-Zellen der Median signifikant auf vier Transkripte pro Zelle sank. In der meiotischen Prophase betrug die mediane Anzahl langer Isoform-Transkripte pro Zelle 21 und 100% der Zellen exprimierten das Transkript. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 72 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, zunächst die Aufschlussdauer und die Konzentration der smFISH-Sonden zu optimieren, die erforderlich sind, um das optimale Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Denken Sie außerdem daran, VRC während der Verdauung und der Hybridisierung über Nacht hinzuzufügen, um die Nukleaseaktivität zu verhindern. Mit dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, die dynamische Genregulation und die Lokalisierung subzellulärer RNA zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelmolekulare RNA-FISH bei knospenden Hefemeiosen durchführt.

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

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Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

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Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

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