Name: Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Lernen Sie die optogenetische Einzelzellableitung in wachen Mäusen mit einer maßgefertigten Glas-Optrode. Diese Methode ermöglicht zuverlässige in vivo Identifizierung von GABAergen und glutamatergen Neuronen im Colliculus inferior.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Unterstützt wurden die Autoren von der Japan Society for Promotion of Science KAKENHI Grant JP16K11200 und 17 H 02223 und der Zuschuss für die Forschung von Kanazawa Medizinische Universität S2016-8 und C2017-3. Wir danken Yuhichi Kuda für seine Unterstützung bei der Aufnahme der Fotos.

Alle Verfahren sind im Einklang mit den Leitprinzipien der physiologischen Gesellschaft von Japan und mit Zustimmung der Animal Care Ausschuss von Kanazawa medizinischen Universität durchgeführt.
(1) Bau von Optrode Glashalter
Hinweis: Um ein Glashalter Optrode zu bauen, eine kommerzielle Elektrodenhalter verwendet (Abbildung 1A).
<ol><li>Ziehen Sie das Stahlrohr für Druckregelung vorsichtig aus dem Faß des Inhabers.</li>
	<li>Durch Bohren, das Loch des Pin-Sitz-Seite in den Lauf des Inhabers zu erweitern. Machen Sie das Loch 3 mm im Durchmesser und 12 mm in der Tiefe.</li>
	<li>Setzen Sie ein Edelstahl-Rohr (Durchmesser 3 mm, 0,5 mm dick und 8 mm Länge; Abbildung 1A ( 2) in das Loch.</li>
	<li>Legen Sie eine Keramik Paarung Hülse für ⌀2.5 mm Ferrulen (Abbildung 1A1) in das Loch aufgeteilt.</li>
	<li>Befestigen Sie den Lauf des elektrodenhalters zu einem L-förmigen Falz mit Epoxy-Kleber.</li>
	<li>Machen Sie die Löcher (3 mm im Durchmesser) in den Falz und an einem Manipulator mit Schrauben befestigen.</li>
</ol>2. Leiter Post Installation
<ol><li>Bereiten Sie einen speziell angefertigten Kopf Beitrag gemacht der eine Leiterplatte Abstandhalter vor. Machen Sie den säulenförmigen Leiterplatte Abstandhalter in Form eines quaderförmigen mit einer Fräse und schneiden Sie es in 2 Kopf stellen mit einer Säge (Abbildung 1 b). Glätten Sie die Unterseite der Kopf Post mit einer Fräse.</li>
	<li>Bereiten Sie die transgenen Tieres, in denen eine lichtempfindliche Opsin in ein bestimmtes Neuron-Typ für die Studie zum Ausdruck kommt. In dieser Arbeit wird die transgenen Maus (VGAT-ChR2 Mäuse) in der hemmenden Neuronen Channelrhodopsin-2 (ChR2)11 Ausdrücken verwendet.</li>
	<li>Betäuben Sie das Tier mit einer Mischung von 0,3 mg/kg Medetomidine, 4,0 mg/kg Midazolam und 5,0 mg/kg Butorphanol durch intraperitoneale Verwaltung. Um zu bestätigen, dass das Tier vollständig betäubt ist, testen Sie seine Reaktionen um die Rute einklemmen.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einem stereotaktischen Rahmen auf ein Heizkissen. Sauberen pad der stereotaktischen Rahmen und die Heizung mit 70 % Alkohol im voraus. Stellen Sie die Zähne in das Loch von der Snack-Bar, und ziehen Sie die Nase Spannbacke leicht an. Befestigen Sie beide Seiten des Kopfes mit Ohr-Stangen. Wenn der Kopf richtig durch die Ohr-Balken befestigt ist, ziehen Sie die Nase Spannbacke an. Anwenden einer ophthalmologischen Salbe für die Augen.</li>
	<li>Rasieren Sie die Kopfhaut mit einer kleinen Schere und Reinigen der Kopfhaut mit einem Wattestäbchen von Chlorhexidin Gluconat. Sterilisieren Sie vor der Operation alles, was, die der chirurgischen Instrumente und einen Kopf mit Autoklav (121 ° C, 15 min Posten).</li>
	<li>Die Kopfhaut entlang der Mittellinie mit einer Schere schneiden und zur Seite schieben. Den Schnitt von der Rückseite des Kopfes, der Augen (ca. 20 mm) zu machen. Entfernen Sie das Periost mit einem Wattestäbchen in 70 % Alkohol getaucht und trocknen Sie den Schädel.</li>
	<li>Legen Sie die Kopf Post auf der Manipulator. Positionieren Sie den Kopf Pfosten flach auf den Schädel um die Bregma mit der Manipulator.</li>
	<li>Mischen Sie das Monomer (4 Tropfen), Katalysator (1 Tropfen) und Polymer (1 kleiner Löffel) dental Zement auf einen kleinen Teller, der vorher im Kühlschrank gekühlt wird. Dental Zement (unter 1 g) legte die frontalen und parietalen Knochen des Schädels, die Kopf Post an den Schädel zu beheben.</li>
	<li>Nach der zahnärztliche Zement hart wird, entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen. Setzen Sie eine antibiotische Salbe auf die Haut. Spritzen Sie Medetomidine Antagonist (0,3 mg/kg) und Antibiotika (Oxytetracycline; 20 mg/kg). Platzieren überwachen Sie die Maus auf das Wärmekissen in einem Käfig zu, bis er erwacht und schicken Sie es an einem Gehäuse-Käfig.</li>
	<li>Haus das Tier in einem einzelnen Gehäuse-Käfig mit einigen Bereicherung Gerät. Ändern der tierischen Papiers Betten täglich, um den Käfig sauber zu halten und eine Infektion verhindern. Überprüfen Sie sorgfältig, ob das Tier Anzeichen von Unwohlsein zeigt. Soweit Lidocain auf die Wunde Schmerzen vermutet wird. Verwalten Meloxicam oder Carprofen einmal alle 24 h für 48 h nach beide Leiter-Installation und Kraniotomie Operationen Post. Die lokale Lidocain zusätzlich gegeben werden kann, wenn die NSAR nicht ausreicht.
</li>
</ol>(3) Akklimatisierung
<ol><li>Akklimatisieren Sie (mindestens) zwei Tage nach der Erholung von der Narkose, die Tiere in den Kopf fixiert Zustand in der Aufnahme-Kammer. Führen Sie die Akklimatisierung Sitzungen für mindestens 5 Tage.</li>
	<li>Während der Akklimatisierung-Sessions legen Sie das Tier in der Aufnahme-Kammer mit dem Kopf Beitrag an einer speziell angefertigten Klemme befestigt. Während der Sitzung, um Bewegung zu begrenzen Abdeckung des Körpers mit einem maßgeschneiderten Harz Halbschlauch (Abbildung 1), machte mit einem 3D-Drucker. Hinweis: Am 1. Tag, sollte die Akklimatisierung Session 5 min lang sein. Es wird dann täglich um 10, 20, 40 und 60 min für Tage 2, 3, 4 und 5, bzw. erhöht.</li>
	<li>Am Ende jeder Sitzung belohnen Sie dem Tier essen. Wenn das Tier ständig während der Akklimatisierung kämpft, beenden Sie die Sitzung.</li>
</ol>4. Kraniotomie
Hinweis: Nach der Akklimatisierung ist eine Kraniotomie über die Gehirnregion für die Aufnahme gemacht. Die Kraniotomie erfolgt in der stereotaktischen Rahmen unter Narkose, da mit dem Kopf Installation Posten. Die Post-operative Verfahren ist das gleiche wie die Leiter Installation Post.
<ol><li>Reinigen Sie vor der Kraniotomie den Schädel mit einem Wattestäbchen mit Chlorhexidin Gluconat und 70 % Alkohol.</li>
	<li>Kratzen Sie sorgfältig den Schädel über die Aufnahme-Website mit einem Zahnbohrer. Sobald die Knochen dünn genug ist, schneiden Sie es mit der Spitze des Skalpells und entfernen Sie es.</li>
	<li>Dental Zement um der exponierten Region gelegt, um den Schädel zu stärken.</li>
	<li>Decken Sie die exponierte Hirnareal mit Silikonkleber, nachdem der dental Zement hart wird. Nach der Operation verläuft wie in Schritt 2.8 beschrieben.</li>
</ol>5. elektrophysiologische Aufnahme
<ol><li>Lassen Sie das Tier, für mindestens 1 Tag nach der Kraniotomie vor der Durchführung der elektrophysiologischen Aufnahme erholen. Legen Sie das Tier in der Aufnahme-Kammer, in der gleichen Weise, die es während der Akklimatisierung-Sessions gemacht wurde, wenn die Aufnahme beginnt.</li>
	<li>Glaspipetten aus Borosilikatglas Kapillaren zu machen (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm 90,0 mm lang) auf eine Elektrode Puller gezogen. Ihr Tipp-Durchmesser beträgt 2 – 3 µm, und ihr Widerstand ist 4 – 6 MΩ, wenn sie mit 10 mM PBS gefüllt sind. Die Länge der Elektrode ist 40-50 mm. In manchen Aufnahmen ergänzt, 2 % Neurobiotin 10 mM PBS.</li>
	<li>Die maßgeschneiderte Optrode Halter die gefüllten Glaspipette zuordnen.</li>
	<li>Die Glaspipette Ag-Cl beschichtet Silberdraht (0,2 mm im Durchmesser) umgesetzt. Verbinden Sie den Silberdraht mit ein Stift über eine dünne beschichtete Elektrokabel. Verbinden Sie die Pin mit der Headstage des Verstärkers Aufnahme.</li>
	<li>Die LWL-Patchkabel verbinden (Kern = 960 µm Verkleidung = 1.000 µm, NA = 0,63) mit einem Zirkonia zwinge (OD = 2,5 mm) nach der Paarung Hülse auf dem Optrode Halter Split. Drücken Sie die Patch-Kabel in die Hülse, bis die Spitze der zwinge am Ende die Glaspipette Kontakte. Die Patch-Kabel liefert das Licht (Wellenlänge = 465 nm) von LED. Das LED-Licht wird durch ein Einkanal-LED-Treiber gesteuert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Silikonkleber über die Kraniotomie. Put angewärmte Kochsalzlösung (38 ° C) auf der Oberfläche des Gehirns in regelmäßigen Abständen zu verhindern, dass die Gehirn Oberfläche Trocknen während der Aufnahme-Session. Falls erforderlich, entfernen Sie die Dura mit scharfen Pinzette.</li>
	<li>Legen Sie die Glaselektrode in das Hirngewebe mit einem Manipulator. Der elektrodenwiderstand zu überwachen, wenn sie eingefügt wird. Die Elektrode zu ersetzen, wenn der Widerstand niedriger ist als erwartet, da die Elektrodenspitze möglicherweise beschädigt. Suchen Sie in einer Tiefe von Interesse und isolieren Sie die Einheit Spikes durch die Tiefe in 2 bis 5 µm Schritten anpassen.</li>
	<li>Nachdem die Einheit isoliert ist, liefern Sie die LED-Leuchte und beobachten Sie die Reaktion auf die lichtreize.</li>
	<li>Notieren Sie die neuronalen Aktivitäten nach der Identifizierung der Zelltypen. Führen Sie die Aufnahmen für 2 – 3 h. Erfolgt die Aufnahme an aufeinander folgenden Tagen (maximal 2 Tage), decken Sie die Kraniotomie mit Silikonkleber. Wenn die Aufnahme beendet ist, und das Tier geopfert, die Kopf Post abrufen und steckte es in Aceton zu waschen und wiederverwenden.</li>
</ol>

<ol><li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons%3A+triumphs+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757(2016).</li>
<li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-assisted+patching%3A+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099(2009).</li>
<li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit%3A+effects+of+sodium+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li>
<li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse%3A+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li>
<li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus%3A+impact+of+aging+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li>
<li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li>
<li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li>
<li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li>
<li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Optogenetik ist ein leistungsfähiges Werkzeug in den Neurowissenschaften geworden. Es ist verwendet worden, für bestimmtes Neuron Typen in Vivo zu identifizieren sowie die Aktivitäten der spezifischen neuronalen Bahnen zu manipulieren. Die Klärung der neuronalen Aktivitäten der verschiedenen neuronalen Arten fördert das Verständnis des Mechanismus der neuronalen Schaltkreise. Hier haben wir eine Methode, um das Licht um die Aufnahme-Site durch eine Glaselektrode im IC von wach VGAT-ChR2 Mäusen zu liefern.
<p...

Das zentrale Nervensystem besteht aus verschiedenen Arten von Neuronen, die unterschiedliche Funktionen haben. Wie diese verschiedenen Arten von Neuronen innerhalb der neuronalen Schaltung funktionieren, ist eines der wichtigsten Anliegen in den Neurowissenschaften. In vielen Regionen des Gehirns war es jedoch unmöglich, die neuronalen Typen in in-Vivo -Aufnahmen der elektrischen Aktivitäten zu unterscheiden, denn es keinen klaren Unterschied in der elektrischen Spike-Signal selbst, mit einigen Ausnahmen gibt. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben einen Durchbruch1,2. Mit transgenen Tieren in der lichtempfindlichen Opsin (z.B.Channelrhodopsin-2) in bestimmten neuronalen Arten ausgedrückt ist, wurde es möglich, die neuronalen Arten effizient in in Vivo Aufnahmen3, 4,5,6. Bei diesen Tieren die Neuronen mit lichtempfindlichen Opsin sind durch lichtreize während der elektrische Aufnahmen geben aufgeregt, aber anderen Neuronen sind nicht. Opsin-positiven Neuronen, zeichnen daher leicht von anderen Neuron durch ihre Reaktionen auf Licht.
Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Als nicht-invasive Methode richtet das Licht oft von Oberfläche des Gehirns. Jedoch weil das Licht Stärke verringert während es Hirngewebe durchläuft, ist es schwer, die tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns zu stimulieren. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Elektrophysiologische Experimente wurden oft an narkotisierten Tieren durchgeführt, weil die Bewegung des Körpers Lärm in den Aufnahmen verursacht. Wie gut dokumentiert ist, ist jedoch Anästhesie bekannt, um die neuronalen Antworten7,8,9,10zu ändern. Daher ist es notwendig, wach Tiere zu nutzen, um neuronale Reaktionen ohne künstliche Effekte der Narkose zu studieren. Im Gegensatz zu den Experimenten mit narkotisierten Tieren werden die elektrophysiologischen Aufnahmen nach der Erholung von der Operation in den Experimenten mit wach Tieren durchgeführt. Während der Zeit zwischen der Operation und die Aufnahmen Gewebe Exsudat oft sammelt sich auf der Oberfläche des Gehirns und macht die optische Transparenz von der Oberfläche des Gehirns gering.
Hier beschreiben wir eine Methode um Monoblock-Aufnahmen aus einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.

<table><tbody><tr><td>Elektrodenhalter</td><td>Molecular Device</td><td>1-HL-U</td><td>Pipettenhalter für Mikroelektrodenverstärker</td></tr><tr><td>Keramische geteilte Gegenhülse</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2,5 mm Ferrule</td></tr><tr><td>Leiterplattenabstandshalter</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8,0 mm, 20,0 mm lang</td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen für Mäuse</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Stereotaktische Instrumente für Mäuse</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Manueller Manipulator</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>Zahnadhäsivharz</td></tr><tr><td>Zement Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>3D-Drucker</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Silikonkleber mit geringer Toxizität</td></tr><tr><td>Borosilikatglaskapillaren</td><td>Narishige</td><td>GD-1,5</td><td>OD 1,5 mm, ID 0,9 mm, 90,0 mm lang</td></tr><tr><td>LWL-Patchkabel</td><td>Doric Lenses</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Monofiberoptik-Patchkabel, OD, 2,5 mm, Kern = 960 mm, Cladding = 1000 mm, NA = 0,63</td></tr><tr><td>Angeschlossene LED</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>Zentrale Wellenlänge = 465 nm, Ausgangsleistung = 45 mW (Core 960 mm 0,63 NA )</td></tr><tr><td>LED-Treiber</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>1 Kanal LED-Treiber, maximale Leistung = 1000 mA</td></tr><tr><td>Elektrodenabzieher</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Zweistufiger Glas-Mikropipettenabzieher</td></tr><tr><td>Borosilikatglas Kapillare</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Bolosilikatglaskapillare, OD, 1,5 mm, ID, 0,9 mm, 90,0 mm lang</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Antibiotische Salbe</td></tr><tr><td>Terramycin&reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxytetracyclin</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>VGAT-ChR2 Mäuse</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td>2500-0157</td><td>Mikroelektrodenverstärker</td></tr></tbody></table>

optogenetik identifikation eines neuronalen typs mit einer glas-optrode wach mäuse

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Es ist ein wichtiges Anliegen in den Neurowissenschaften wie verschiedene Arten von Neuronen arbeiten auf neuronale Schaltkreise. Jüngste Fortschritte in der optogenetik haben die Identifizierung des neuronalen in in Vivo elektrophysiologischer Experimente in breiten Hirnregionen aktiviert. Optogenetik Experimente ist es wichtig, die Licht auf die Aufnahme-Website zu bieten. Jedoch ist es oft schwer zu Anregung Licht an den tiefen Hirnregionen von Oberfläche des Gehirns liefern. Vor allem, ist es schwierig für die Stimulation Licht, die tiefen Hirnregionen zu erreichen, wenn die optische Transparenz der Oberfläche Gehirn niedrig ist, wie oft der Fall mit Aufnahmen von Tieren, wach ist. Hier beschreiben wir eine Methode um Spike Antworten auf das Licht von einer wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode aufzuzeichnen. Bei dieser Methode ist das Licht durch die Aufnahme Glaselektrode geliefert, so dass man zuverlässig die aufgezeichneten Neuron mit Licht in den tiefen Hirnregionen stimulieren kann. Dieses maßgeschneiderte Optrode-System besteht aus zugänglich und preiswerten Materialien und ist leicht zu montieren.

In Abbildung 2untersuchten wir die Auswirkungen der Werkzeugspitze ändern und die Länge der glaspipetten auf die Lichtleistung an der Spitze der Pipetten (Abbildung 2A-B). Die Lichtleistung wurde durch eine optische Leistungsmesser platziert 1 mm von der Spitze gemessen. Die volle Länge wurde auf 50 ± 2 mm eingestellt, wenn die Spitzengröße variiert während der Werkzeugspitze ändern bis 2,5 µm festgelegt wurde, w...

Diese Arbeit stellt eine Methode, um eine optogenetische Monoblock-Aufnahme zuverlässig aus einem wach Maus über eine maßgeschneiderte Glas Optrode durchführen.

Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die Funktionen verschiedener Arten von Neuronen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die verschiedenen Arten von Neuronen in vivo mit kostengünstigen und zugänglichen Materialien zuverlässig zu identifizieren. Ich werde das Verfahren zusammen mit Shinji Muramoto, unserem Techniker, und Lanlan Ma, unserem Assistenzprofessor aus unserem Labor, demonstrieren.Um diesen Vorgang zu starten, ziehen Sie das Stahlrohr zur Druckkontrolle vorsichtig aus dem Lauf des Halters heraus. Erweitern Sie das Loch der Stiftsitzseite im Lauf des Halters durch Bohren. Setze dann ein Edelstahlrohr in das Loch ein.Führen Sie anschließend eine geteilte Keramik-Gegenhülse für eine Ferrule mit einem Durchmesser von 2,5 Millimetern in das Loch ein. Machen Sie ein Loch in ein L-förmiges Kaninchen und befestigen Sie den Zylinder des Elektrodenhalters mit Epoxidkleber am Kaninchen. Befestigen Sie es anschließend mit Schrauben an einem Manipulator.Bereiten Sie einen individuell angefertigten Kopfpfosten vor, indem Sie den Abstandshalter für die Säulenplatine mit einem Fräser in quaderförmige Form bringen und mit einer Säge in zwei Kopfpfosten schneiden. Glätten Sie dann die Unterseite des Kopfpfostens mit einem Fräser. Sterilisieren Sie vor der Operation alle chirurgischen Instrumente und einen Kopfpfosten mit einem Autoklaven.Reinigen Sie den stereotaktischen Rahmen und das Heizkissen mit 70 Prozent Alkohol. Als nächstes betäuben Sie die Maus und platzieren Sie sie im stereotaktischen Rahmen auf einem Heizkissen. In diesem Experiment wird eine transgene Maus verwendet, bei der die inhibitorischen Neuronen Channelrhodopsin-II exprimieren.Setzen Sie die Zähne in das Loch der Beißstange ein und ziehen Sie die Nasenklemme leicht fest. Fixieren Sie anschließend beide Seiten des Kopfes mit Ohrstangen. Wenn der Kopf durch die Ohrbügel richtig fixiert ist, ziehen Sie die Nasenklemme fest.Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf. Schneiden Sie das Haar mit einer kleinen Schere über den Kopf und reinigen Sie die Kopfhaut mit einem Wattestäbchen aus Chlorhexidingluconat. Schneide dann die Kopfhaut entlang der Mittellinie ab und schiebe sie beiseite.Entfernen Sie das Periost mit einem in 70 Prozent Alkohol getauchten Wattestäbchen und lassen Sie den Schädel trocknen. Befestigen Sie dann den Kopfpfosten am Manipulator. Positionieren Sie den Kopfpfosten mit dem Manipulator flach auf dem Schädel um das Bregma herum.Mischen Sie vier Tropfen des Monomers, einen Tropfen Katalysator und einen kleinen Löffel Polymer auf eine kleine Schüssel, die im Kühlschrank gekühlt wird. Tragen Sie Zahnzement auf das Stirn- und Scheitelbein auf und befestigen Sie den Kopfpfosten am Schädel. Nachdem der Zahnzement ausgehärtet ist, entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen.Tragen Sie eine antibiotische Salbe auf die exponierte Haut auf und injizieren Sie einen Cocktail aus Medetomidin-Antagonisten und Antibiotikum. Platzieren Sie dann die Maus auf dem Wärmekissen in einem Käfig, bis sie aufwacht, und setzen Sie sie wieder in einen Käfig mit Anreicherungen ein. Um eine Kraniotomie über der Zielhirnregion für die Aufzeichnung durchzuführen, reinigen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen, das mit Chlorhexidingluconat und 70 Prozent Alkohol getränkt ist.Kratzen Sie den Schädel vorsichtig mit einem Zahnbohrer über die Aufnahmestelle. Wenn der Knochen dünn genug ist, schneide ihn mit der Spitze des Skalpells ab und entferne ihn. Tragen Sie dann Zahnzement um die freiliegende Stelle auf, um den Schädel zu stärken.Decken Sie den freiliegenden Hirnbereich mit Silikonkleber ab, nachdem der Zahnzement ausgehärtet ist. Setzen Sie das Tier dann auf das Wärmekissen in einen Käfig, bis es aufwacht, und bringen Sie es in einen Käfig zurück. Lassen Sie das Tier nach der Kraniotomie mindestens einen Tag lang genesen, bevor Sie die elektrophysiologische Aufzeichnung durchführen.Bevor Sie die elektrophysiologische Aufzeichnung durchführen, stellen Sie mit einem Elektrodenabzieher einige Glaspipetten aus Borosilikatglaskapillaren her. Füllen Sie die Pipetten mit 10 millimolaren PBS. In einigen Aufzeichnungen werden zwei Prozent Neurobiotin zu den 10 Millimolaren PBS hinzugefügt.Setze das Tier dann in die Aufnahmekammer. Befestigen Sie eine gefüllte Glaspipette an der maßgefertigten optrode-Halterung. Führen Sie einen mit Silberchlorid beschichteten Draht in die Glaspipette ein.Verbinden Sie anschließend den Pin mit der Kopfstufe des Aufnahmeverstärkers. Verbinden Sie anschließend das LWL-Patchkabel mit einer Zirkonoxid-Ferrule mit der geteilten Gegenhülse am optrode-Halter. Schieben Sie das Patchkabel in die Hülle, bis die Spitze der Ferrule die Rückseite der Glaspipette berührt.Das Patchkabel liefert das Licht von LED, das von einem Einkanal-LED-Treiber gesteuert wird. Entfernen Sie anschließend den Silikonkleber über der Kraniotomie. Tragen Sie regelmäßig warme Kochsalzlösung auf die Gehirnoberfläche auf, um zu verhindern, dass die Gehirnoberfläche während der Aufnahmesitzung austrocknet.Entfernen Sie bei Bedarf die Dura mit einer scharfen Pinzette. Hier wurden die Spike-Antworten im Colliculus inferior der wachen VGAT-Kanalrhodopsin-II-Mäuse aufgezeichnet. Im Colliculus inferior der VGAT-Kanalrhodopsin-II-Mäuse exprimieren die GABAergen Neuronen spezifisch Kanalrhodopsin-II.Bei den wachen Mäusen wurden sowohl die GABAergen als auch die glutamatergen Neuronen angeregt bzw. unterdrückt, wenn sie Lichtreize erhielten. Wenn der Lichtreiz durch die Glaselektrode abgegeben wird, löst er in einigen Neuronen Spike-Reaktionen aus. Im Gegensatz dazu unterdrückten die Lichtreize in anderen Neuronen die Spike-Reaktionen, die durch Schallreize hervorgerufen wurden.Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Glasoptrode die gut isolierte Einzelaktivität aufzeichnen und die aufgezeichneten Neuronen zuverlässig durch Licht stimulieren kann. Nach der Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, um zu erforschen, wie verschiedene Arten von Neuronen in der neuronalen Pfanne verschiedener Gehirnregionen funktionieren.

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieser Artikel zeigt die Aufzeichnung der einzelnen Zellen aus fluoreszenzmarkierten neuronaler Populationen im intakten Maus Netzhaut. Durch die Verwendung von Zwei-Photonen-Anregung Infrarot transgenetically markierten Zellen wurden für Patch-Clamp-Aufzeichnung gezielt ihr Licht Antworten rezeptiven Feld Eigenschaften und Morphologie zu studieren.

Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Quelle: Kodani, S., et.al. Optogenetische Manipulation neuronaler Schaltkreise bei der Überwachung von Schlaf-/Wachzuständen bei Mäusen. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die optogenetische Manipulation neuronaler Schaltkreise, die am Übergang vom Schlaf in den Wachzustand bei Mäusen beteiligt sind. Bei dem Verfahren werden eine optische Faser und Elektroden chirurgisch in das Gehirn und die Muskeln implantiert, um eine Lichtstimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung zu ermöglichen.

Optogenetische Manipulation neuronaler Schaltkreise für den Übergang vom Schlaf in den Wachzustand bei Mäusen

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität des Gehirns durch ein optisches Fenster in transgenen Mäusen. Die Mäuse exprimieren ein fluoreszierendes Protein, das den Nachweis neuronaler Aktivitäten ermöglicht. Ein kleiner Teil des Schädels wird vorsichtig entfernt, um ein optisches Fenster zu installieren, und der Schädel wird dann mit schwarzem Zement bedeckt, um das Licht vor der Bildgebung zu blockieren.

Installation von optischen Fenstern im Gehirn transgener Mäuse zur Abbildung neuronaler Aktivitäten

Wir beschreiben eine Methode zur Charakterisierung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften von Vorderhirnschaltkreisen unter Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur Photostimulation neuronaler Populationen in vitro.

Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

Optogenetik ist zu einem mächtigen Werkzeug für den Einsatz in verhaltensneurowissenschaftlichen Experimenten geworden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Design und die Einrichtung von Lasersystemen und bietet ein vollständiges Protokoll für die Durchführung mehrerer und gleichzeitiger optogenetischer In-vivo-Stimulationen, die mit den meisten Verhaltenstestparadigmen von Nagetieren kompatibel sind.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

Hier beschreiben wir unsere Strategie, um stabile, gut isolierte Einzelaufnahmen von identifizierten inhibitorischen Interneuronen in der anästhesierten Mausrinde zu erhalten. Neuronen, die ChR2 exprimieren, werden durch ihre Reaktion auf blaues Licht identifiziert. Die Methode verwendet standardmäßige extrazelluläre Aufzeichnungsgeräte und dient als kostengünstige Alternative zur Kalziumbildgebung oder visuell gesteuerten Pflasterung.

Ein Leitfaden zur In vivo Single-Unit-Aufnahme von Optogenetically Identifizierte kortikalen inhibitorischen Inter

Hier beschreiben wir Methoden der optogenetischen Manipulation bestimmter Arten von Neuronen bei der Überwachung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen und stellen unsere jüngsten Arbeiten am Bettkern der Stria terminalis als Beispiel vor.

Optogenetische Manipulation von neuronalen Schaltkreisen während der Überwachung von Schlaf-/Wachzustanden bei Mäusen

Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Hier stellen wir das Herstellungsverfahren eines Optrode-Systems mit optischen Fasern für die Lichtabgabe und einem Elektrodenarray für die neuronale Aufzeichnung vor. In-vivo-Experimente mit transgenen Mäusen, die Kanalrhodopsin-2 exprimieren, zeigen die Machbarkeit des Systems für die gleichzeitige optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung.

Optroden-Array zur simultanen optogenetischen Modulation und elektrischen neuronalen Aufzeichnung

Lernen Sie die optogenetische Einzelzellableitung in wachen Mäusen mit einer maßgefertigten Glas-Optrode. Diese Methode ermöglicht zuverlässige in vivo Identifizierung von GABAergen und glutamatergen Neuronen im Colliculus inferior.

Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse

Weitere Videos entdecken