Optogenetik Identifikation eines neuronalen Typs mit einer Glas-Optrode wach Mäuse

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die Funktionen verschiedener Arten von Neuronen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die verschiedenen Arten von Neuronen in vivo mit kostengünstigen und zugänglichen Materialien zuverlässig zu identifizieren. Ich werde das Verfahren zusammen mit Shinji Muramoto, unserem Techniker, und Lanlan Ma, unserem Assistenzprofessor aus unserem Labor, demonstrieren.

Um diesen Vorgang zu starten, ziehen Sie das Stahlrohr zur Druckkontrolle vorsichtig aus dem Lauf des Halters heraus. Erweitern Sie das Loch der Stiftsitzseite im Lauf des Halters durch Bohren. Setze dann ein Edelstahlrohr in das Loch ein.

Führen Sie anschließend eine geteilte Keramik-Gegenhülse für eine Ferrule mit einem Durchmesser von 2,5 Millimetern in das Loch ein. Machen Sie ein Loch in ein L-förmiges Kaninchen und befestigen Sie den Zylinder des Elektrodenhalters mit Epoxidkleber am Kaninchen. Befestigen Sie es anschließend mit Schrauben an einem Manipulator.

Bereiten Sie einen individuell angefertigten Kopfpfosten vor, indem Sie den Abstandshalter für die Säulenplatine mit einem Fräser in quaderförmige Form bringen und mit einer Säge in zwei Kopfpfosten schneiden. Glätten Sie dann die Unterseite des Kopfpfostens mit einem Fräser. Sterilisieren Sie vor der Operation alle chirurgischen Instrumente und einen Kopfpfosten mit einem Autoklaven.

Reinigen Sie den stereotaktischen Rahmen und das Heizkissen mit 70 Prozent Alkohol. Als nächstes betäuben Sie die Maus und platzieren Sie sie im stereotaktischen Rahmen auf einem Heizkissen. In diesem Experiment wird eine transgene Maus verwendet, bei der die inhibitorischen Neuronen Channelrhodopsin-II exprimieren.

Setzen Sie die Zähne in das Loch der Beißstange ein und ziehen Sie die Nasenklemme leicht fest. Fixieren Sie anschließend beide Seiten des Kopfes mit Ohrstangen. Wenn der Kopf durch die Ohrbügel richtig fixiert ist, ziehen Sie die Nasenklemme fest.

Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf. Schneiden Sie das Haar mit einer kleinen Schere über den Kopf und reinigen Sie die Kopfhaut mit einem Wattestäbchen aus Chlorhexidingluconat. Schneide dann die Kopfhaut entlang der Mittellinie ab und schiebe sie beiseite.

Entfernen Sie das Periost mit einem in 70 Prozent Alkohol getauchten Wattestäbchen und lassen Sie den Schädel trocknen. Befestigen Sie dann den Kopfpfosten am Manipulator. Positionieren Sie den Kopfpfosten mit dem Manipulator flach auf dem Schädel um das Bregma herum.

Mischen Sie vier Tropfen des Monomers, einen Tropfen Katalysator und einen kleinen Löffel Polymer auf eine kleine Schüssel, die im Kühlschrank gekühlt wird. Tragen Sie Zahnzement auf das Stirn- und Scheitelbein auf und befestigen Sie den Kopfpfosten am Schädel. Nachdem der Zahnzement ausgehärtet ist, entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen.

Tragen Sie eine antibiotische Salbe auf die exponierte Haut auf und injizieren Sie einen Cocktail aus Medetomidin-Antagonisten und Antibiotikum. Platzieren Sie dann die Maus auf dem Wärmekissen in einem Käfig, bis sie aufwacht, und setzen Sie sie wieder in einen Käfig mit Anreicherungen ein. Um eine Kraniotomie über der Zielhirnregion für die Aufzeichnung durchzuführen, reinigen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen, das mit Chlorhexidingluconat und 70 Prozent Alkohol getränkt ist.

Kratzen Sie den Schädel vorsichtig mit einem Zahnbohrer über die Aufnahmestelle. Wenn der Knochen dünn genug ist, schneide ihn mit der Spitze des Skalpells ab und entferne ihn. Tragen Sie dann Zahnzement um die freiliegende Stelle auf, um den Schädel zu stärken.

Decken Sie den freiliegenden Hirnbereich mit Silikonkleber ab, nachdem der Zahnzement ausgehärtet ist. Setzen Sie das Tier dann auf das Wärmekissen in einen Käfig, bis es aufwacht, und bringen Sie es in einen Käfig zurück. Lassen Sie das Tier nach der Kraniotomie mindestens einen Tag lang genesen, bevor Sie die elektrophysiologische Aufzeichnung durchführen.

Bevor Sie die elektrophysiologische Aufzeichnung durchführen, stellen Sie mit einem Elektrodenabzieher einige Glaspipetten aus Borosilikatglaskapillaren her. Füllen Sie die Pipetten mit 10 millimolaren PBS. In einigen Aufzeichnungen werden zwei Prozent Neurobiotin zu den 10 Millimolaren PBS hinzugefügt.

Setze das Tier dann in die Aufnahmekammer. Befestigen Sie eine gefüllte Glaspipette an der maßgefertigten optrode-Halterung. Führen Sie einen mit Silberchlorid beschichteten Draht in die Glaspipette ein.

Verbinden Sie anschließend den Pin mit der Kopfstufe des Aufnahmeverstärkers. Verbinden Sie anschließend das LWL-Patchkabel mit einer Zirkonoxid-Ferrule mit der geteilten Gegenhülse am optrode-Halter. Schieben Sie das Patchkabel in die Hülle, bis die Spitze der Ferrule die Rückseite der Glaspipette berührt.

Das Patchkabel liefert das Licht von LED, das von einem Einkanal-LED-Treiber gesteuert wird. Entfernen Sie anschließend den Silikonkleber über der Kraniotomie. Tragen Sie regelmäßig warme Kochsalzlösung auf die Gehirnoberfläche auf, um zu verhindern, dass die Gehirnoberfläche während der Aufnahmesitzung austrocknet.

Entfernen Sie bei Bedarf die Dura mit einer scharfen Pinzette. Hier wurden die Spike-Antworten im Colliculus inferior der wachen VGAT-Kanalrhodopsin-II-Mäuse aufgezeichnet. Im Colliculus inferior der VGAT-Kanalrhodopsin-II-Mäuse exprimieren die GABAergen Neuronen spezifisch Kanalrhodopsin-II.

Bei den wachen Mäusen wurden sowohl die GABAergen als auch die glutamatergen Neuronen angeregt bzw. unterdrückt, wenn sie Lichtreize erhielten. Wenn der Lichtreiz durch die Glaselektrode abgegeben wird, löst er in einigen Neuronen Spike-Reaktionen aus. Im Gegensatz dazu unterdrückten die Lichtreize in anderen Neuronen die Spike-Reaktionen, die durch Schallreize hervorgerufen wurden.

Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Glasoptrode die gut isolierte Einzelaktivität aufzeichnen und die aufgezeichneten Neuronen zuverlässig durch Licht stimulieren kann. Nach der Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, um zu erforschen, wie verschiedene Arten von Neuronen in der neuronalen Pfanne verschiedener Gehirnregionen funktionieren.