Name: Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Lernen Sie die Induktion und Validierung zellulärer Seneszenz in primären humanen Fibroblasten. Diese reproduzierbare Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und eignet sich für Alters- und Krebsforschung.

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Wir danken Mitglieder des Demaria Labors für fruchtbare Diskussionen und Thijmen van Vliet für den Austausch von Daten und das Protokoll auf der UV-induzierten Seneszenz.

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Muñoz-Espín, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nrm3823">Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Correia-Melo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+required+for+pro-ageing+features+of+the+senescent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype.</a> The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).</li>
<li>Loaiza, N., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+tumor+promotion%3A+Is+aging+the+key%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> Elife. 4, e12997(2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Soto-Gamez, A., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+for+aging%3A+the+case+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence.</a> Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).</li>
<li>Childs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%3A+an+emerging+target+for+diseases+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+genes+and+pathways+in+primary+human+fibroblast+strains+undergoing+replicative+and+radiation+induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence.</a> Biological Research. 49, 34(2016).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Senescence+Associated+Genes+and+Pathways+in+Primary+Human+Fibroblasts+Detected+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq.</a> PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+Transcriptional+Heterogeneity+in+Senescent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.</a> Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).</li>
<li>Le, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+long-term+expression+of+senescence+markers+in+mice+is+independent+of+p53+and+immune+status%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status.</a> Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).</li>
<li>Hall, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+regulates+CRL4%28Cdt2%29-mediated+degradation+of+p21+in+response+to+UVB-induced+DNA+damage+to+control+the+G1%2FS+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint.</a> Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).</li>
<li>Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+topoisomerase+II+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).</li>
<li>Pazolli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+underlies+the+senescence-+associated+secretory+phenotype+of+tumor+stromal+fibroblasts+that+supports+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression.</a> Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).</li>
<li>Venturelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+apoptosis+and+senescence+by+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+5-azacytidine+and+5-aza-2%27-deoxycytidine+in+solid+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Trypan+Blue+Technique+for+Determination+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.</a> Transplantation. 2, 685-694 (1964).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%CE%B2-galactosidase+is+lysosomal+%CE%B2-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase.</a> Aging Cell. 5, 187-195 (2006).</li>
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<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
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<li>Bunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+p53+and+p21+to+sustain+G2+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage.</a> Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).</li>
<li>Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+beta-galactosidase+staining+a+marker+of+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo.</a> Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).</li>
<li>Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+replicative+senescence+in+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells.</a> Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).</li>
<li>Blazer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose-induced+replicative+senescence%3A+point+of+no+return+and+effect+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).</li>
<li>Wiley, C. D., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Ancient+Pathways+to+Aging+Cells-Connecting+Metabolism+and+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).</li>
<li>Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+senescence+in+primary+glioblastoma+cells+by+serum+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).</li>
<li>Hypoxia Blagosklonny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTOR+and+autophagy%3A+converging+on+senescence+or+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence.</a> Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).</li>
<li>Meuter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cellular+senescence+are+elevated+in+murine+blastocysts+cultured+in+vitro%3A+molecular+consequences+of+culture+in+atmospheric+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-like+senescence-associated+secretory+phenotype+is+conserved+in+mouse+cells+dependent+on+physiological+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen.</a> PLoS One. 5 (2), e9188(2010).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+time-series+gene+expression+profiles+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence.</a> Aging Cell. 12, 622-634 (2013).</li>
</ol>

Die hier erläuterten Protokolle wurden optimiert für menschliche primäre Fibroblasten, besonders BJ und WI-38 Zellen. Die Protokolle für replikative Seneszenz, ionisierende Strahlung und Doxorubicin, worden erfolgreich angewandt, um andere Arten von Fibroblasten (HCA2 und IMR90) und in andere Zelltypen (nämlich neonatale Melanozyten und Keratinozyten oder iPSC-abgeleitete Herzmuskelzellen) in unserem Labor. Anpassungen für weitere Zelltypen können jedoch durch Anpassung einige Details wie die Anzahl der gesetzten Zellen,...

Im Jahr 1961 berichtet Hayflick und Moorhead, dass primäre Fibroblasten in Kultur ihr proliferative Potential nach aufeinanderfolgenden Passagen1zu verlieren. Dieser Prozess wird durch die fortlaufende Verkürzung der Telomere nach jeder Zellteilung verursacht. Wenn die Telomere eine kritisch kurze Länge erreichen, sie sind anerkannt durch die DNA-Schäden-Antwort (DDR), die eine irreversible Verhaftung der Proliferation aktiviert – auch als replikative Seneszenz definiert. Replikative Seneszenz ist derzeit eines der vielen Reize, die bekannt sind, um einen Zustand der permanenten Zellzyklus Festnahme zu induzieren, die Zellen unempfindlich auf Mitogene und Apoptotic Signale2,3 macht. Die Seneszenz-Programm zeichnet sich normalerweise durch zusätzliche Eigenschaften einschließlich lysosomale hochaktiver, mitochondriale Dysfunktion, nukleare Änderungen, Chromatin Umgestaltungen, endoplasmatische Retikulum Stress, DNA-Schäden und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP)3,4. Alternde Zellen haben mehrere Funktionen im Körper: Entwicklung, Wunde heilen und Tumor Unterdrückung2. Ebenso sind sie bekannt, eine wichtige Rolle im Altern und paradoxerweise im Tumor Progression5. Die negativen und teilweise widersprüchlichen Auswirkungen der Seneszenz werden oft die SASP6zugeschrieben.
Vor kurzem zeigte sich, dass die Beseitigung der alternde Zellen von Mäusen zur Lebensdauerverlängerung und zur Beseitigung vieler der Alterung Funktionen7,8,9,10,11, führt 12. auf die gleiche Weise wurden mehrere Medikamente entwickelt, alternde Zellen (Senolytics) entweder zu beseitigen oder die SASP13,14Zielen. Das therapeutische Potenzial von Anti-Aging hat vor kurzem mehr Aufmerksamkeit auf das Feld angezogen.
Die Untersuchung der Mechanismen, die zelluläre Seneszenz zugeordnet und die Vorführungen für pharmakologische Interventionen angewiesen auf ex-Vivo -Modelle, vor allem auf menschliche primäre Fibroblasten. Zwar gibt es einige gemeinsame Merkmale, die durch vielfältige Seneszenz Induktoren aktiviert, ist eine große Variabilität in der Seneszenz Phänotyp beobachteten und abhängig von verschiedenen Faktoren ab, einschließlich der Zelle Art, Impuls und Zeit Punkt3,15, 16,17. Es ist zwingend notwendig, um die Heterogenität für Studium und targeting seneszenten Zellen betrachten. Dieses Protokoll soll daher eine Reihe von Methoden zur Seneszenz in primäre Fibroblasten zu induzieren, indem mit verschiedenen Behandlungen zu bieten. Wie es erklärt wird, können die Methoden leicht zu anderen Zelltypen angepasst werden.
Abgesehen von replikative Seneszenz, beschreiben wir fünf Seneszenz-induzierende Behandlungen: ionisierende Strahlung, ultraviolettes (UV) Strahlung, Doxorubicin, oxidativer Stress und epigenetische Veränderungen (nämlich die Förderung von Histon Acetylierung oder DNA Demethylierung) . Ionisierende Strahlung sowohl UV-Bestrahlung direkte DNA-Schäden verursachen, und bei der entsprechenden Dosis auslösen Seneszenz18,19. Doxorubicin verursacht auch Seneszenz hauptsächlich durch DNA-Schäden durch verschuppen in die DNA und Topoisomerase-II-Funktion zu stören und damit stoppen DNA Reparatur Mechanismen20. Die Expression von Genen für Seneszenz wird normalerweise von Histon Acetylierung und DNA-Methylierung gesteuert. Folglich auslösen Histon-Deacetylase-Hemmer (z.B.Natrium-Butyrat und SAHA) und DNA-demethylating (z. B. 5-Aza) Agenten Seneszenz sonst normalen Zellen21,22.
Zu guter letzt vier der am häufigsten verwendeten Marker, die alternde Zellen erläutert werden: Aktivität der Seneszenz verbunden-β-Galaktosidase (SA-β-gal), Rate der DNA-Synthese durch EdU Einbeziehung Assay, Überexpression von den Regulatoren des Zellzyklus und Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitoren p16 p21, Überexpression und und Sekretion von Mitgliedern der SASP.

<table><tbody><tr><td>DMEM Media - GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum-Hyklon</td><td></td><td>SV30160,03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S; 10.000 U/ml)</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SC-202581</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser (nicht DEPC-behandelt)</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>T75 Kolben</td><td>Sarstedt</td><td>833911002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Lösung</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletten</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>13mm runde Deckgläser</td><td>Sarstedt</td><td>83.1840.002</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip</td><td>Merck Chemicals</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Cäsium137-Quelle</td><td></td><td></td><td>IBL 637 Cäsium-137&Gamma;-Strahlungsgerät</td></tr><tr><td>UV-Strahlungskammer</td><td></td><td></td><td>Opsytec, Dr. G&ouml; bel BS-02</td></tr><tr><td>Doxorubicin-Dihydrochlorid&nbsp;</td><td>BioAustralis Fine Chemicals</td><td>BIA-D1202-1</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>5-aza-2'-Desoxycytidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3656</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0061</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranosid)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7240-90-6</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäuremonohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Dibasisches Natriumphosphat</td><td>Acros organics</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanid&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid</td><td>Fisher Scientific</td><td>13746-66-2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Merck Millipore</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fisher Chemicals</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>25% Glutaraldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>111-30-8,7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd (w/v)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-Ethinyl-2'-desoxyuridin)</td><td>Lumiprobe</td><td>10540</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-Cyanin3-azid (Sulfo-Cy3-azid)</td><td>Lumiprobe</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>Natriumascorbat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat (Cu(II)SO4.5H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Base</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiwell Plate 384, weiß&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 Siegelfolie&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>Sensifast Probe Lo-ROX Kit&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-84020</td><td></td></tr><tr><td>UPL Sondenbibliothek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Verschiedenes</td><td></td></tr><tr><td>Humanes IL-6 DuoSet ELISA</td><td>R& D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zählobjektträger</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0017</td><td></td></tr><tr><td>Trockenbrutschrank</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>Heratherm</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamid</td><td>Merck Millipore</td><td>1.10983</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 'M' Laborfilm</td><td>Bemis&nbsp;</td><td></td><td></td>#PM992</tr><tr><td>Pinzettennadeln</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

induktion und validierung der zellulären seneszenz in primären humanen zellen

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des permanenten Zellzyklus Festnahme in Reaktion auf verschiedene schädliche Reize aktiviert. Aktivierung der zellulären Seneszenz ist ein Markenzeichen von diversen pathophysiologischen Bedingungen auch den Tumor Unterdrückung, Gewebe, Umbau und Alterung. Die Induktoren der zellulären Seneszenz in Vivo zeichnen sich nach wie vor schlecht. Eine Reihe von Reizen kann jedoch verwendet werden, Förderung der zellulären Seneszenz ex Vivo. Darunter sind die häufigsten Seneszenz-Induktoren replikativen Erschöpfung, ionisierender und nichtionisierender Strahlung, genotoxisch Drogen, oxidativen Stress und demethylating und acetylieren Agenten. Hier bieten wir detaillierte Anweisungen zur Verwendung dieser Reize, um Fibroblasten in Seneszenz zu induzieren. Dieses Protokoll kann problemlos für verschiedene Arten von Primärzellen und Zelllinien, einschließlich Krebszellen angepasst werden. Wir beschreiben auch verschiedene Methoden für die Validierung der Seneszenz Induktion. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die Messung der Aktivität des lysosomalen Enzyms Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-gal), die Rate der DNA-Synthese mit 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine (EdU) Einbeziehung Assay, die Höhe der Expression des Zellzyklus Inhibitoren p16 p21, und der Ausdruck und Sekretion von Mitgliedern der Senescence-Associated sekretorischen Phänotyp (SASP). Endlich, wir bieten Beispielergebnisse und besprechen weitere Anwendungen dieser Protokolle.

Bereicherung der SA-β-gal-Färbung in seneszenten Fibroblasten
Β-Galaktosidase (β-gal) ist eine lysosomale Enzym, das drückt sich in allen Zellen und hat einen optimalen pH-Wert von 4,025,26. Jedoch während der Seneszenz, Lysosomen an Größe zunehmen und infolgedessen seneszenten Zellen ansammeln β-gal. Die erhöhten Mengen dieses Enzyms machen es möglich, seine Tätigkeit auch...

Hier diskutieren wir eine Reihe von Protokollen für die Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in kultivierten Zellen. Wir konzentrieren uns auf unterschiedlichen Seneszenz-induzierende Stimuli und beschreiben die Quantifizierung der gemeinsamen Seneszenz-assoziierten Marker. Wir bieten technische Details mit Fibroblasten als Modell, aber die Protokolle können verschiedene zelluläre Modelle angepasst werden.

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich des Alterns und der Krebserkrankung zu beantworten, z. B. wie gängige Techniken zur Induktion der zellulären Seneszenz durchgeführt werden und wie der Seneszenz-Phänotyp bewertet werden kann. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie einfach zu befolgen ist, hochgradig reproduzierbar ist, keine spezielle oder teure Ausrüstung erfordert und bei mindestens 50% der Zellbevölkerung zur Induktion der Seneszenz führt. Dieses Verfahren wird von Alejandra Hernandez-Segura, einer Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert.Zu Beginn säen Sie sieben mal 10 bis zum fünften lebensfähigen primären Fibroblasten mit einer niedrigen Populationsverdopplung oder PD in einem T75-Kolben aus, der 10 Milliliter D10 enthält. Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 5% Sauerstoff über Nacht. 11 Mikroliter der 1.000-fachen Doxorubicin-Stammlösung in 11 Millilitern D10 auf eine Endkonzentration von 250 Nanomolar verdünnen.Anschließend saugen Sie das Medium aus den Zellen ab und ersetzen es durch 10 Milliliter D10 plus Doxorubicin. Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 5 % Sauerstoff für genau 24 Stunden. Aspirieren Sie dann das Medium und verwenden Sie 10 Milliliter D10, um die Zellen einmal vorsichtig zu waschen.Inkubieren Sie die Zellen weitere sechs Tage lang in 10 Millilitern D10 und wechseln Sie das Medium regelmäßig, etwa alle drei Tage. Um eine Beta-Galactosidase-Färbung durchzuführen, säen Sie für jede Probe einmal 10 bis die vierten Zellen in mindestens eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 500 Mikroliter D10 enthält, so dass die Zellen spärlich sind. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 5% Sauerstoff über Nacht.Verwenden Sie am nächsten Tag 500 Mikroliter PBS, um die Zellen zweimal zu waschen. Fügen Sie dann 500 Mikroliter 2 % Formaldehyd plus 0,2 % Glutaraldehyd in PBS pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen drei bis fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um sie zu fixieren. Verwenden Sie dann 500 Mikroliter PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.Fügen Sie nach der Zubereitung einer frischen Färbelösung 500 Mikroliter pro Vertiefung hinzu und verwenden Sie Parafilm, um die Platte zu versiegeln, um eine Verdunstung zu vermeiden, die zur Bildung von Kristallen führen kann. Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln bei 37 Grad Celsius in einem Trockenbrutkasten ohne Kohlendioxid für 12 bis 16 Stunden. Verwenden Sie dann 500 Mikroliter PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.Überprüfen Sie die Zellen unter einem normalen Lichtmikroskop, um die Ergebnisse zu beurteilen, bei denen positive Zellen mit blauer paranukleärer Färbung erscheinen. Um die Visualisierung und Quantifizierung einzelner Zellen zu erleichtern, verwenden Sie DAPI als Gegenfärbung. Bestimmen Sie dann mit einem Fluoreszenzmikroskop den Prozentsatz positiver Zellen im Vergleich zur Gesamtzahl der Zellen, die mehrere Bilder derselben Probe aufnehmen, um mindestens 100 einzelne Zellen zu bewerten.Legen Sie für jede Probe oder Bedingung ein Deckglas pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte. Säen Sie eine mal 10 bis zur vierten Zellte mit 500 Mikrolitern D10 pro Vertiefung aus, so dass die Zellen spärlich sind. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 5% Sauerstoff über Nacht.Bereiten Sie genügend 20-mikromolare EdU-Lösung und D10 vor, so dass jede Probe 250 Mikroliter erhält. Entfernen Sie die Hälfte des Mediums aus jeder zu behandelnden Vertiefung und ersetzen Sie es durch EdU D10-Lösung. Die endgültige EdU-Konzentration beträgt 10 Mikromolare.Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 5 % Sauerstoff für 18 bis 24 Stunden. Verwenden Sie die gleiche Inkubationszeit für Kontroll- und seneszente Zellen. Verwenden Sie nach der Inkubation 500 Mikroliter PBS, um die Zellen zweimal zu waschen.Fügen Sie dann 500 Mikroliter 4%iges Formaldehyd in PBS hinzu und inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang, um sie zu fixieren. Nach der Fixierung werden 500 Mikroliter 100 millimolare Tris pH 7,6 zu den Proben gegeben und fünf Minuten lang inkubiert. Geben Sie anschließend 500 Mikroliter 0,1% Triton X-100 in PBS zu den Zellen und permeabilisieren Sie sie 10 Minuten lang.Waschen Sie die Proben dann mit PBS dreimal. Bereiten Sie 50 Mikroliter Etikettenmischung für jedes Deckglas vor und fügen Sie die Komponenten in der folgenden Reihenfolge hinzu: 44,45 Mikroliter PBS, 0,5 Mikroliter Kupfer(II)sulfat, 0,05 Mikroliter Sulfo-cy3-azid und fünf Mikroliter Natriumascorbat. Pipettieren Sie 50 Mikroliter der Etikettenmischung auf ein Stück Parafilm.Heben Sie dann mit einer Pinzette und einer Nadel das Deckglas an und legen Sie es mit der Zellseite nach unten auf die Etikettenmischung. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind und dass die gesamte Oberfläche des Deckglases die Etikettenmischung berührt. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang im Dunkeln.Legen Sie die Zellen zurück in die Vertiefungen der 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Verwenden Sie dann Eindeckmedium mit DAPI, um die Proben zu mounten und über Nacht trocknen zu lassen. Zu Beginn säen sieben mal 10 bis zum fünften lebensfähigen primären Fibroblasten mit einer geringen Populationsverdopplung oder.Stellen Sie mindestens 100 Zellen pro Bedingung dar. Quantifizieren Sie abschließend den Prozentsatz der Zellen, die EdU integriert haben, indem Sie die folgende Formel verwenden. Durchführung von Gen- und Proteinexpressionsstudien gemäß dem Textprotokoll.Hier sind repräsentative Bilder der SA-beta-Gal-Färbung in proliferierenden und seneszenten primären Fibroblasten zu sehen. Seneszente Zellen sehen in einem normalen Zellkörper vergrößert aus. Wie bereits erwähnt, kann es schwierig sein, einzelne Zellen zu unterscheiden.Daher erleichtert die Co-Färbung mit DAPI die Visualisierung und Zellzählung. In diesem Experiment wurde Suflo-cy3-azid verwendet, um eine kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition in der Population durchzuführen. Wenn die Kopplung des Azids an das Alkin stattgefunden hat, zeigen die Zellen unter einem cy3-Filter eine Fluoreszenz, die proliferierende von nicht proliferierenden Zellen unterscheidet.Einmal gemeistert, kann diese Technik in 36 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, beim Umgang mit Zellen außerhalb des Inkubators so schnell wie möglich zu sein, da Schwankungen in der Sauerstoffkonzentration die Ergebnisse beeinträchtigen können. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Zytokin-Array oder Western Blot durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Menge der sezernierten Proteine oder das Verständnis spezifischer Signalwege zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Alterns und der Krebsforschung, um zu erforschen, wie seneszente Zellen an physiologischen und pathologischen Zuständen bei Säugetieren beteiligt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Seneszenz in Primärzellen reproduzierbar induzieren und wie Sie ihren Seneszenzstatus beurteilen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.

Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll, beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen während der Induktion in Vivo Umprogrammierung. Diese Methode eignet sich für die Bewertung der Rolle der zellulären Seneszenz während der Geweberegeneration und Umprogrammierung in Vivo.

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Intrazellulären ROS hat nachweislich eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz. Hier beschreiben wir einen sensible Assay zur Quantifizierung der ROS Ebenen während der zellulären Seneszenz. Wir bieten auch Protokolle für die Beurteilung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, was angeblich zu verschiedenen altersbedingte Funktionsstörungen beiträgt.

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

Zelluläre Seneszenz ist der Schlüsselfaktor bei der Entwicklung chronischer altersbedingter Pathologien. Die Identifizierung von Therapeutika, die auf seneszente Zellen abzielen, verspricht, eine gesunde Alterung zu verlängern. Hier präsentieren wir einen neuartigen Test zur Identifizierung von Senotherapeutika auf der Grundlage der Messung der seneszenzassoziierten Galactosidase-Aktivität in Einzelzellen.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Multiplexierte Immunfluoreszenz ermöglicht die sequentielle Markierung mehrerer Antikörpermarker innerhalb eines einzelnen Gewebeschnitts, um die räumliche Analyse der Gewebearchitektur und Zellpopulationen zu unterstützen. Hier wird ein Arbeitsablauf zur Multiplexerkennung von seneszenzassoziierten, strukturellen und immunen Markern präsentiert, einschließlich manueller und automatisierter Objektträgervorbereitung, iterativer Bildgebung und Einzelzellanalyse mit digitaler Pathologiesoftware.

Multiplexierter Immunfluoreszenz-Assay zur räumlichen Bewertung von Altersmarkern in vivo

Dieses Protokoll bietet eine reflektierte-licht-konfokale Mikroskopie zur objektiven, einzelzelligen Detektion der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-gal) Aktivität in der stromalen Gefäßfraktion, die aus menschlichem Fettgewebe isoliert ist. Die Methode ist mit der Immunzytochemie kompatibel, beinhaltet pH-Kontrollen zur quantitativen Beurteilung und bietet zudem eine sensiblere und weniger subjektive Alternative zur herkömmlichen SA-β-gal-Färbung.

Seneszenzdetektion mit reflektiertem Licht in der fettreichen stromalen Gefäßfraktion

Ein standardisiertes Protokoll zur Induzierung vorzeitiger Alterung bei HNM mittels tBHP, standardisierte Protokolle zur Analyse wichtiger Senezenzmarker, einschließlich Wachstumsstillstand, SA-β-Galaktosidase-Aktivität und SASP-Faktoren.

Ein standardisiertes Protokoll zur Induzierung stressbedingter vorzeitiger Seneszenz in primären menschlichen Melanozyten mittels Tert-Butylhydroperoxid

Dieser Artikel stellt ein lebendzelliges LysoTracker-Protokoll zur Messung der lysosomalen Remodellierung während der Seneszenz in humanen Fibroblasten von IMR-90 vor.

Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Diese Methode untersucht, wie seneszente Hautfibroblasten gesunde Fibroblasten beeinflussen. Die Seneszenz wird durch UVB-Exposition induziert, und das konditionierte Medium wird auf normale Fibroblasten angewendet. Sie hilft dabei, bioaktive Verbindungen zu bewerten, die auf veränderte Zell-zu-Zell-Kommunikation bei der Hautalterung abzielen.

Neue Kombination von Antioxidantien zur Wiederherstellung gesunder interzellulärer Kommunikation in einem in-vitro-Modell unter Verwendung eines konditionierten Mediums aus alter Zellen

Lernen Sie die Induktion und Validierung zellulärer Seneszenz in primären humanen Fibroblasten. Diese reproduzierbare Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und eignet sich für Alters- und Krebsforschung.

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

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