Name: Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Erfahren Sie die β-Galaktosidase-Nachweismethode in ganzen Mausembryonen zur Untersuchung der Genexpression während der Embryonalentwicklung. Dieses empfindliche Protokoll ermöglicht direkte Visualisierung und ist für Entwicklungsbiologen leicht anwendbar.

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Wir möchten die histopathologische Service für ihre technische Unterstützung an das Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) bedanken. Wir danken auch Dr. Motoharu Seiki freundlicherweise die Mt4-MmpLacZ -Mäuse und Dr. Alicia G. Arroyo für unser Projekt zu unterstützen und ihre kritische Lektüre des Manuskripts. Wir wünschen Peter Bonney für Korrekturlesen dieses Artikels danken. Diese Arbeit wurde von Universidad Europea de Madrid durch ein Stipendium (# 2017UEM01), C.S.C unterstützt.

Alle experimentelle Verfahren wurden vom Ausschuss für Ethik von Tierversuchen CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) und der Comunidad Autónoma de Madrid gewährleisten minimalen Tierleid genehmigt.
1. Sammlung von Embryonen von schwangeren Mäusen (von E8.5 bis E12.5)
<ol><li>Schwangere Mäusen durch zervikale Dislokation oder CO2 -Inhalation zu opfern. Am Tag der ersten beobachtet vaginalen Stecker galt embryonalen Tag 0,5 (E0.5).</li>
	<li>Legen Sie das Tier in der Rückenlage auf das Saugkissen und reinigen Sie die Bauchhaut der Maus mit 70 % Ethanol. Hinweis: Sterilität ist in den folgenden Schritten nicht erforderlich.</li>
	<li>Kneifen Sie und heben Sie die Bauchhaut mit Maus-Zahn-Pinzette.</li>
	<li>Machen Sie einen Schnitt durch die Haut und die Bauchdecke, 2 bis 4 cm vertikal über der Mittellinie des Bauches mit einer chirurgischen Schere.</li>
	<li>Setzen Sie den Bauch und entfernen Sie die uterine Hörner von der Mutter mit Zange schneiden Blutgefäße entlang der inneren Krümmung des Uterus mit Chirurgische Schere.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zeichenfolge von Embryonen und überträgt es auf einer Petrischale auf Eis mit 10 mL eiskaltes 0,01 M Phosphat-Puffer Kochsalzlösung pH-Wert 7,4 (PBS).</li>
	<li>Die Embryonen aus der Gebärmutter unter einem Stereomikroskop in einer Petrischale mit 10 mL frisches eiskaltem PBS sorgfältig zu sezieren. Fassen Sie die muskelwand mit Uhrmacher Pinzette die Fruchtblase aussetzen und dann reißen Sie die amniotische Membrane um die eingeschlossenen Embryo und der Dottersack mit den Spitzen der Zange zu entfernen.</li>
	<li>Sammle die stellt Embryonen von schwangeren Mäusen in frühen Stadien (von E8.5 bis E12.5) (Abbildung 2).</li>
	<li>Transfer der Embryonen nach ein frisches Gericht mit 10 mL kalten 1 X PBS mit gebogenen Pinzette oder für sehr kleine Embryonen (E8.5-E9.5), Kunststoff Transfer Pipetten verwenden, um die Proben ohne Embryo Schaden nehmen.</li>
	<li>Vor dem Start der Fixierung nehmen Sie eine embryonale Probe in einem Microcentrifuge Schlauch für die Genotypisierung indem Sie schneiden ein kleines Stück des Embryos oder die amniotische Membrane in die kleinste Embryonen (von E8.5 bis E9.5) mit der Uhrmacher Pinzette. Hinweis: LacZ Genotypisierung wird bestimmt durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Primer: vorwärts, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; umkehren, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.</li>
</ol>2. Fixierung von Mäuseembryonen
<ol><li>Übertragen Sie jeder Embryo in einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer runden Basis, enthält 1 mL 1 X PBS. Hinweis: Führen Sie alle Schritte im Protokoll dieser Röhren unter Rühren mit einem rollenden Shaker.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen mit 1 X PBS-Puffer für 1 min bei Raumtemperatur, das restliche Blut zu beseitigen. Einsatz Kunststoff Transfer Pipetten, Flüssigkeiten in den Rohren zu ändern.</li>
	<li>Befestigen Sie den Embryo in 1 mL 0,125 % Glutaraldehyd auf Eis. Hinweis: Die Zeit der Befestigung hängt von der Größe des Embryos: 20 min für E8.5-E9.5 Embryonen, 30 min für E10.5 Embryonen und 1 h für E12.5 Embryonen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fixiermittel zu und waschen Sie die Embryonen in 1 X PBS zweimal für 10 min bei Raumtemperatur vor der Verarbeitung der Probenmaterials für X-gal-Färbung.</li>
</ol>(3) ganze Mount β-Galaktosidase Histochemie von Mäuseembryonen
<ol><li>Bereiten Sie X-Gal spülen Puffer und X-Gal-Färbelösung vor Beginn des Verfahrens (siehe Tabelle 1 und Tabelle der Materialien). Verwenden Sie ein Wildtyp (WT) stellt Embryonen als Negativkontrollen für die enzymatische Reaktion.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Embryonen im X-Gal spülen Puffer für 10 min bei Raumtemperatur (Abbildung 2).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Embryonen in X-Gal-Färbelösung 2 h über Nacht bei 37 ° C, vor Licht geschützt werden. Überwachen Sie die Farbreaktion in regelmäßigen Abständen über einen sezierenden Mikroskop bis ausreichender Intensität der Blaufärbung ohne den Hintergrund des Embryos beobachtet wird. Halten Sie den pH-Wert der Lösung zwischen 8 und 9, Hintergrund während der ganzen Färbung zu reduzieren. Wenn die Färbelösung Licht zu drehen beginnt, ersetzen sie durch frisches Substrat-Lösung, die enzymatische Reaktion zu verlängern.</li>
	<li>Die Reaktion zu stoppen, wenn das gewünschte Signal entsteht durch Waschen Embryonen in einem Microcentrifuge Schlauch mit 1 mL 1 X PBS zweimal für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Transferieren Sie die gefärbte Embryonen zu 1 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) zu beheben, neu für 1 h bei 4 ° c über Nacht Hinweis: Embryonen können gespeichert werden, bei 4 % PFA/PBS für längere Zeit bei 4 ° C oder für Schnitt sofort verarbeitet werden können. Dieser endgültige Fixierung-Schritt ist entscheidend für den langfristigen Erhalt des Musters Färbung.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen in 1 mL 1 X PBS zweimal für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Option 1: Deaktivieren Sie Embryonen durch Eintauchen in eine Reihe von Lösungen mit steigenden Konzentrationen des Glycerins (20 %, 40 %, 60 % und 80 % Glycerin in 1 X PBS) für 1 h bei Raumtemperatur in jeder Lösung. Hinweis: Waschen Embryonen in 80 % Glycerin für längere Zeit, sogar Tage, bis sie gelöscht werden, und dann Sie sie in 80 % Glycerin bei 4 ° C bei diesem Schritt (Abbildung 2 speichern). Eine sehr kleine Menge von Natrium-azid Ora Kristall von Thymol hinzufügen die Embryonen, die bei 4 ° C in Glycerin oder 1 X gespeichert wird PBS empfohlen, um Schimmelbildung zu verhindern. Nach der Reinigung, können ganze Berg Embryonen verwendet werden, für das Fotografieren (Schritt 4).</li>
	<li>Option 2: Prozess Embryonen für Paraffin einbetten und Schneiden mit einem Mikrotom (Abbildung 2). Dokumentieren Sie das Muster des Ausdrucks im ganzen gefärbten Embryonen vor schneiden (Schritte 4 und 5).</li>
</ol>4. Fotografie der ganze Berg Embryonen
<ol><li>Ganzen Berg gebeizt Embryonen vor dem Schneiden zu fotografieren, übertragen Sie sie auf einer Petrischale vorbereitet mit einer Grundfläche von verfestigt 1-2 % Agarose in 1 X PBS.</li>
	<li>Decken Sie den Embryo komplett mit 10 mL 1 X PBS in der Agarose-beschichtete Gerichte, Dehydrierung und Reflexion beim Fotografieren durch die Flüssigkeit zu verhindern.</li>
	<li>Den Embryo mitten in 1 X PBS mit Pinzette zu orientieren. Machen Sie für ältere Embryonen (E10.5-E12.5) ein kleines Loch in der Agarose mit Zangen, platzieren und positionieren Sie die Probe innerhalb es in verschiedenen Winkeln und der frei schwebenden beim Fotografieren zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie die Schale auf der Bühne Stereomikroskop mit übertragen (unter Stufe) Licht. Wechsel zwischen "dunkel-Feld" und "Hellfeld" Anpassungen, legen Sie die gewünschte Beleuchtung beim Fotografieren und die Lichtdurchlässigkeit der Probe zu optimieren. Hinweis: Verwenden Sie Fiber optic Beleuchtung für späteren Zeitpunkt Embryonen Reflexion an der Oberfläche des Embryos zu vermeiden. Beim Fotografieren von gerodeter Embryos das gleiche Verfahren aber übertragen Sie sie auf einer Petrischale mit 100 % Glycerin und tauche sie ein vollständig.</li>
</ol>(5) Paraffin einbetten und Schneiden von X-gal gebeizt Embryonen
<ol><li>Paraffin Wachs einbetten<ol>
<li>Entfernen Sie die X-gal gebeizt Embryonen von 4 ° C (Schritt 3.5) zu und waschen Sie sie mit 1 mL 1 X PBS dreimal um die Überschreitung des fixiermittels zu beseitigen.</li>
		<li>Übertragen Sie jedes Embryo eine Histologie-Kassette mit Pinzette.</li>
		<li>Legen Sie die Kassetten mit den Embryonen in ein Becherglas und dann austrocknen, indem man sie durch eine abgestufte Ethanol-Reihe bei Raumtemperatur: 70 % Ethanol, einmal für 30 min; 96 % Ethanol, zweimal für jeweils 30 min.; 100 % Ethanol, zweimal für jeweils 30 min.. Hinweis: Embryonen können für eine unbestimmte Zeit bei 4 ° C bis der Dehydrierung beginnen in 70 % igem Ethanol gespeichert werden.</li>
		<li>Inkubieren Sie die ganze Kassette in Isopropanol für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Übertragen Sie durch die Verwendung einer Pinzette die Kassetten zu einem Glas Färbung Trog mit vorgewärmten Isopropanol und im Ofen bei 60 ° C für 30 min lassen.</li>
		<li>Legen Sie die Kassetten in ein neues Glas Färbung Trog mit einer Mischung aus 50 % Isopropanol / 50 % Paraffinwachs geschmolzen und für 4 h in einem 60 ° C Ofen verlassen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Kassetten mit den Embryonen mit zwei Änderungen von geschmolzenem Paraffinwachs, 30 min bei 60 ° C.</li>
		<li>Am Ende des letzten Paraffin waschen Öffnen der Kassette und jedes Embryo eine separate Gewebe einbetten Form, um die Probe unter einem Stereomikroskop zu übertragen.</li>
		<li>Füllen Sie den Brunnen mit geschmolzenem Paraffinwachs bei 60 ° C. Verwenden Sie beheizte Zangen halten das Wachs geschmolzen und vorsichtig den Embryo in der Form orientieren. Hinweis: Die korrekte Ausrichtung der Probe ist ein entscheidender Schritt für den Embryo in der gewünschten Fläche schneiden.</li>
		<li>Bevor Paraffin in der Kokille erstarrt, legen Sie eine Kassette ohne Deckel oben auf dem Block und füllen Sie es mit geschmolzenem Paraffinwachs. Lassen Sie das restliche Wachs Abkühlen bis über Nacht bei Raumtemperatur erstarrt.</li>
		<li>Sobald das Paraffin vollständig erstarrt ist, entfernen Sie den massiven Block aus der Form und speichern Sie der Paraffin-Blöcke bei Raumtemperatur oder bei 4 ° C bis14-Schnitt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paraffin-Schnitt<ol>
<li>Richten Sie das Blade am Mikrotom und 5-7 µm Dicke eingerichtet. 5.2.2. kühlen Sie paraffinblock auf dem Eis ab und schneiden Sie es um einen Würfel oder eine Pyramide zu produzieren.</li>
		<li>Das Mikrotom-Inhaber zuordnen Sie den Block mithilfe eine kleine Menge geschmolzenes Wachs.</li>
		<li>Die Block für den optimalen Schnitt zu orientieren. Abschnitt der Paraffin-Blöcke in 5-7 µm dicke Scheiben bei Raumtemperatur mit standard Mikrotom.</li>
		<li>Mit einem feinen Pinsel, legen Sie die Abschnitte in einem Wasserbad bei Raumtemperatur für Manipulation und Scheiben auswählen.</li>
		<li>Abschnitte aus dem Wasserbad mit einem Mikroskop-Objektträger abholen und in einem Wasserbad bei 42 ° C für stretching überführen.</li>
		<li>Abschnitte aus dem Wasserbad nehmen und vorsichtig auf Adhäsion Objektträger legen.</li>
		<li>Trocknen Sie die Folien auch in einem Ofen bei 37 ° C über Nacht zu den Abschnitten vollständig einzuhalten, andernfalls können sie verloren gehen während der Färbung. Hinweis: Bewahren Sie die Folien bei 4 ° C bis Färbung Verfahren ab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4.wenn und X-Gal-gefärbten Paraffin Abschnitte Gegenfärbung<ol>
<li>Legen Sie die Folien auf einem Objektträger Tablett in einem Ofen bei 60 ° C für mindestens 45 Minuten, das Paraffinwachs flüssiger zu machen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Folien auf einem Gestell und Glas Färbung Gerichte verwenden, um die folgenden Schritte ausführen: Tauchen Sie die Zahnstange in die färbeküvetten mit Alkoholen der abnehmenden Konzentrationen für komplette Paraffin entfernen und Hydratation des Gewebes: Isopropanol für 5 min bei 60 ° C; Isopropanol für 3 min; 100 % Ethanol für 2 min; 96 % Ethanol für 1 min; 70 % Ethanol für 1 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Spülen Sie Abschnitte in destilliertem Wasser zweimal, um sicherzustellen, dass es keine Alkohol-Rückstände gibt.</li>
		<li>Gegenfärbung Abschnitte mit einem Fleck (z.B. Nuclear-schnell rot-Lösung) für 5 min (in der Regel zwischen 3-8 min) bei Raumtemperatur (Abbildung 2). Hinweis: Diese Färbung hilft, um allgemeine Gewebestruktur in den Abschnitten zu offenbaren.</li>
		<li>Nach dem Färben, waschen Sie die Folien in destilliertem Wasser für 1 min und überprüfen Sie Abschnitt Färbung im Mikroskop zu. Hinweis: Wenn die gewünschte Färbung zu schwach ist, Abschnitte gegenfärbung wieder für eine längere Zeit.</li>
		<li>Abschnitte in der folgenden Serie mit steigenden Konzentrationen von Ethanol zu entwässern: zwei Wäschen in 95 % igem Ethanol für 2 min, zwei wäscht in 100 % igem Ethanol für 2 min, und um zu vermeiden, löst die blaue Farbe ausfällt, nur eine schnelle Wäsche in Xylol.</li>
		<li>Entfernen Sie die Folien aus dem Rack eins nach dem anderen, und legen Sie sie auf ein Stück Papier. Dann schieben Sie Mount und Deckglas mit einem synthetischen, dauerhafte Montage Medium. Hinweis: Xylol Produkt ist ein brennbarer deren Dämpfe ärgerlich und schädlich für die menschliche Gesundheit und für Wasserorganismen sind. Es muss innerhalb einer Kapuze manipuliert werden und erfordert den Einsatz der richtigen Schutzausrüstung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierendes finanzielles Interesse haben.

Das E. Coli LacZ gen hat als Reporter im Studium der Gen-Expression-Muster aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit und einfache Erkennung verbreitet. Dieses Protokoll beschreibt eine klassische Methode zur Erkennung von β-gal Ausdruck basiert auf einer enzymatischen Reaktion, das einfach und schnell sowie kostengünstig durchführen. Diese Methode kann auch ohne große Änderungen im ganzen Berg Embryonen, intakt Organe, Kryostat Gewebeschnitte oder kultivierten Zellen angewendet werden.
Ge...

Um spezifische gen Expressionsmuster zu beschreiben, ist die Verwendung von Reporter-Gene als Marker von Drosophila , Säugetiere von größter Bedeutung gewesen. In Experimenten mit transgenen und Knockout Tieren ist das bakterielle β-galaktosidase-Gen (LacZ) von Escherichia coli (E. Coli) eines der am weitesten verbreitete1,2,3, 4. β-Galaktosidase (β-gal) katalysiert die Hydrolyse von β-galactosiden (z. B. Laktose) in seine Monosaccharide (Glukose und Galaktose)5. Die am häufigsten verwendeten Substrat wird X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), ein Glykosid, das durch β-Galaktosidase geben Anlass zu 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole und Galactose hydrolysiert wird. Die erste ist in ein Dimer oxidiert, bei Verwendung in Kombination mit Kalium Ferri- und Ferro-Cyanid, produziert eine charakteristische unlöslich, blauer Farbe Niederschlag (Abbildung 1)6.
Das LacZ gen begonnen, als ein Reportergen vor über dreißig Jahren verwendet werden7,8. In der Regel LacZ eingefügt nachgeschaltet eine endogene Veranstalter an die Stelle der offenen Leserahmen, sodass es in Zelle und bakterielle Kultur, Zellen mit einem bestimmten Einsatz zu visualisieren sowie bei transgenen Tieren als Tracer von endogenen verwendet werden kann gen Expressionsmuster während Entwicklung9. In diesem Zusammenhang ist die Visualisierung der β-Galaktosidase Aktivität beträchtlich in Drosophila benutzt worden, um zu verstehen, die Entwicklungs- und zelluläre Prozesse aus einzelnen Zellen ganze Gewebe. Drosophila Genetik zugunsten die Generation stabile Linien, in denen eine modifizierte P-Element Konstrukt, enthält das Reportergen LacZ ist nach dem Zufallsprinzip Standorte im Genom eingefügt. So kann wenn unter dem Einfluss von Enhancer-Elemente platziert es seinen Ausdruck Gewebe gezielt, fahren, die die systematische Analyse der Expressionsmuster vieler Gene während den vergangenen zwei Jahrzehnten10erlaubt hat. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von transgenen Mäusen LacZ -gen-Expression zu überwachen auch Erkennung von Gen rekombinationsereignisse von Cre-LoxP vermittelte Rekombination und Lokalisierung der mutierten embryonalen Stammzellen Derivate in Chimären Analysen 11, erleichtert die Kontrolle des LacZ Ausdruck in bestimmten Geweben sowie wie zeitlich. Auch kann im ganzen Embryonen, Erkennung der β-Galaktosidase Aktivität differentielle Färbung Muster bei verschiedenen Intensitäten produzieren, die bequem in verschiedenen Entwicklungsstadien zu zeitliche Veränderungen in der Genexpression analysieren beobachtet werden können 8,12.
In diesem Artikel präsentieren wir ein Protokoll zur Genexpression durch X-gal visualisieren im ganzen Berg Gewebe in frühen Entwicklungsstadien von mäuseembryonen Färbung. Wir präsentieren diese histochemische Methode als eine hochempfindliche und kostengünstige Technik, die präzise Erkennung der markierten Zellen im ganzen Mount Proben oder auf zellulärer Ebene begünstigt, nachdem Paraffin Gewebe oder Embryonen eingebetteten. Die Methode ermöglicht die direkte Visualisierung der Färbung im Maus-Gewebe mit dem minimalen Hintergrund im Vergleich zu anderen Methoden13.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>24137-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SCHARLAU</td><td>50004/ LE3Q2014</td><td></td></tr><tr><td>Wässriges Eindeckmedium</td><td>VECTOR LABS</td><td>H-5501</td><td></td></tr><tr><td>Synthetische Einbettmedien</td><td>MERCK</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>96% Ethanol</td><td>PROLABO</td><td></td><td></td>20824365</tr><tr><td>99,9 % Ethanol absolut</td><td>SCHARLAU</td><td>ET00021000</td><td></td></tr><tr><td>50 % Glutaraldehydlösung</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G6403-100ml</td><td></td></tr><tr><td>85 % Glycerin</td><td>MERCK</td><td>104094</td><td></td></tr><tr><td>99,9 % Glycerin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>63064</td><td></td></tr><tr><td>Nichtionisches Tensid (Nonidet P-40)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>542334</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Fast Red Gegenfärbung</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinpastillen</td><td>MERCK</td><td>111609</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Tabletten)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanat</td><td>MERCK</td><td>1049840500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferrocyanid</td><td>MERCK</td><td>1049731000</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Dihydrat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>71638</td><td></td></tr><tr><td>Thymol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>Trishydrochlorid (Tris HCl)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10812846001 (Roche)</td><td></td></tr><tr><td>X-GAL</td><td>VENN NOVA</td><td>R-0004-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>VWR CHEMICALS</td><td>VWRC28973.363</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Kryoformen aus Kunststoff 15x15x5 mm</td><td>SAKURA</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Rotatorisches Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Kassetten</td><td>Oxford Trade</td><td>OT-10-9046</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckgläser 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>AGAA000001#12E</td><td></td></tr><tr><td>Adhäsions-Objektträger</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>J1820AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Flotation Wasserbad</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Mikrotomklingen mit niedrigem Profil</td><td>Feder</td><td>UDM-R35</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinofen</td><td>J.R. SELECTA</td><td></td><td></td></tr> 2000205 <tr><td>Wachs Paraffinspender</td><td>J.R. SELECTA</td><td></td><td></td></tr> 4000490 <tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>DM500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen 2,0 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen aus Polypropylen 1,5</td><td>mL SIGMA-ALDRICH</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>IKA Labortechnik</td><td>HS250 BASIC</td><td></td></tr><tr><td>Rührplatte</td><td>Bibby</td><td>HB502</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Schüttler</td><td>IKA Labortechnik</td><td>MS1</td><td></td></tr><tr><td>Laborwaage</td><td>GRAM</td><td>FH-2000</td><td></td></tr><tr><td>Präzisionswaage</td><td>Sartorius</td><td>ISO9001</td><td></td></tr><tr><td>pHmeter</td><td>Crison</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Lichtwellenleiter</td><td>Optech</td><td>PL2000</td><td></td></tr></tbody></table>

tracing genexpression durch nachweis der aktivität der β-galaktosidase in ganze mausembryonen

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Die Escherichia coli LacZ gen, β-Galaktosidase wird weitgehend als Reporter für die Genexpression und als Tracer in Zell-Linie Studien verwendet. Die klassische histochemische Reaktion basiert auf der Hydrolyse des Substrats X-gal in Kombination mit Eisen und Eisen-Ionen, die einen unlöslichen blauen Niederschlag, das einfach produziert zu visualisieren. Daher dient β-Galaktosidase Aktivität als Marker für das Muster des Ausdrucks des Gens von Interesse, wie die Entwicklung verläuft. Hier beschreiben wir das Standardprotokoll für die Erkennung von β-Galaktosidase Aktivität in frühen ganze Maus-Embryonen und die nachfolgende Methode für Paraffin-Schnitt und gegenfärbung. Darüber hinaus ist ein Verfahren zur Klärung der ganzer Embryos zur Verfügung gestellt, um X-gal-Färbung in tiefere Regionen des Embryos besser zu visualisieren. Konsistente Ergebnisse erhält man durch die Durchführung dieses Verfahrens, obwohl Optimierung der Reaktionsbedingungen benötigt wird, um die Hintergrundaktivitäten zu minimieren. Einschränkungen in der Probe sollte betrachtet werden, insbesondere im Hinblick auf die Größe des Embryos in der ganze Berg Färbung. Unser Protokoll bietet eine sensible und eine zuverlässige Methode für β-Galaktosidase-Erkennung bei der Maus-Entwicklung, die den Kryostaten Abschnitte sowie ganze Organe weiter angewendet werden kann. So, die dynamische gen Expressionsmuster während der gesamten Entwicklung mithilfe dieses Protokolls in ganzen Embryonen leicht analysiert werden können, sondern auch detaillierte Ausdruck auf zellulärer Ebene nach Paraffin-Schnitt beurteilt werden kann.

Hier zeigen wir die Ergebnisse aus der Anwendung der standard-Protokoll für die β-Galaktosidase histochemische Reaktion mit X-gal als das Substrat im ganzen mausembryonen (Abbildung 1 und Abbildung 2). Mithilfe dieses Protokolls untersuchen wir Membran Typ 4-Matrix-Metalloproteinase (Mt4-Mmp) Ausdruck in unterschiedlichen embryonalen Entwicklungsstadien (E9.5, E11.5 und E12.5) mit Mt4-Mmp mutierte Mäuse, die die LacZ-Reporter unt...

Hier beschreiben wir das Standardprotokoll für die Erkennung von β-Galaktosidase Aktivität in frühen ganze Maus-Embryonen und die Methode für die Paraffin-Schnitt und gegenfärbung. Dies ist ein einfaches und schnelles Verfahren, Genexpression während der Entwicklung zu überwachen, auch die Gewebeschnitte, angewendet werden können, Organe oder kultivierten Zellen.

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsbiologie beantworten, wie z.B. die Untersuchung von Genexpressionsmustern während der Embryonalentwicklung. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie hochempfindlich, einfach und schnell durchzuführen ist und eine direkte Visualisierung der Färbung im gesamten Einbettgewebe oder in höherer Auflösung nach der Paraffinsektion der Probe ermöglicht. Das Verfahren wird von Dr. Maria Jose Blanco, Dr. Anabel Learte, Dr. Emma Munoz und Dr. Miguel Marchena demonstriert, die alle leitende Postdoktoranden aus meinem Labor sind. Beginnen Sie mit der Inkubation von Glutaraldehyd-fixierten transgenen Embryonen, die Galactosidase exprimieren, in frisch zubereitetem X-Gal-Spülpuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Verwendung von Wildtyp-Wurfembryonen als Negativkontrollen für die enzymatische Reaktion. Ersetzen Sie anschließend den Spülpuffer durch eine X-Gal-Färbelösung bei einem pH-Wert von 8-9. Vor Licht schützen und 2 Stunden bis über Nacht bei 37 inkubieren

tracing-gene-expression-through-detection-galactosidase-activity

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben einen Fluoreszenz-Reporter-Assay schnell zu identifizieren und zu charakterisieren, Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Selbst-Erneuerung zu regulieren.

Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate

Dieses Video zeigt eine Technik zur Beurteilung der Retinsäureaktivität in Mausembryonen. Nach der Isolierung von Zellen aus den Mausembryonen werden die Zellen mit Retinsäure (RA)-Reporterzellen co-kultiviert. Embryonale Zellen produzieren RA, die die Beta-Galactosidase-Expression in Reporterzellen induziert, was auf die RA-Aktivität in den embryonalen Zellen hinweist.

Einsatz von Reporterzellen in einer Co-Kultur zur Untersuchung der Retinsäureproduktion durch embryonale Zellen der Maus

Wir präsentieren hier ein optimiertes Protokoll zur Genotypisierung, Färbung und Vorbereitung fötaler Mäuse für die Bildgebung von peripheren Nozizeptoren-Axonprojektionen im gesamten Tier, als effektive Methode zur Beurteilung sensorischer Axonwachstumsphänotypen bei der Entwicklung gentechnisch veränderter Mäuse.

Whole-Mount-Imaging von Mouse Embryo Sinnes Axon Projektionen

Unter Ausnutzung einer binären genetischen Strategie stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verfolgung neuronaler Schaltkreise in Mäusen zur Verfügung, die komplementäre transsynaptische Tracer nach Cre-vermittelter Rekombination exprimieren. Da die zellspezifische Tracerproduktion genetisch kodiert ist, ist unser experimenteller Ansatz geeignet, um die Bildung und Reifung neuronaler Schaltkreise während der Entwicklung des embryonalen Gehirns von Mäusen mit einer Einzelzellauflösung...

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verlust- zu beschreiben und zu gewinnen-Funktionsmethode, die zur Identifizierung Neogenin als stufenspezifischen Rezeptor anwendbar ist, die und die innere Zellmasse Differenzierung in preimplantation Maus-Embryonen zu Trophektoderm führt.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Förderung der Transgen-Integration und Herstellung von Gründer Transgene Mäuse mit hoher Wirksamkeit durch eine einfache Injektion eines Lentivirale Vektors in den Perivitelline Raum einer befruchteten Eizelle.

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

Befruchtete Eier Maus und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen gen Lieferung bildet. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Perforation der Zona mit einem Laser, embryonale Zellen mit Lentivirale Vektoren transduzieren und transgene Mäuse zu schaffen.

Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier

In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Wir beschreiben Methoden zur Visualisierung der entstehenden Transkription während der zygotischen Genomaktivierung in Einzelzellen während der frühen Embryogenese.

Visualisierung der zygotischen Genomaktivierung in Einzelzellen früher Embryonen

Erfahren Sie die β-Galaktosidase-Nachweismethode in ganzen Mausembryonen zur Untersuchung der Genexpression während der Embryonalentwicklung. Dieses empfindliche Protokoll ermöglicht direkte Visualisierung und ist für Entwicklungsbiologen leicht anwendbar.

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

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