Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der mRNA-Biologie zu beantworten, z. B. ob ein in silico vorhergesagtes mRNA-Ziel direkt mit einer bestimmten zellulären microRNA interagieren kann. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass biotinylierte Nachahmer verwendet werden, um die Ziel-mRNA herunterzuziehen. Und diese biotinylierten Nachahmer verfügen über gesperrte Nukleinsäuren oder LNA-basierte Nachahmungschemie, die bei der Bildung sehr stabiler Oligonukleotide mit einer sehr hohen Affinität hilft, die die Spezifität der Reaktion verbessern können.

Die Implikationen dieser Methodik sind, dass sie vom Verständnis der Biologie der microRNA zu microRNA-basierten Therapeutika beitragen kann. Dies liegt vor allem daran, dass wir alle wissen, dass microRNAs in jedem Aspekt der Zellbiologie eine entscheidende Rolle spielen. Indem wir also die Ziele der microRNAs, also die mRNAs, identifizieren, können wir sicherlich kritisches Wissen liefern, das für die Entdeckung und Therapie wichtig wäre.

Sabyasachi Dash, ein Doktorand aus unserem Labor, wird das Protokoll vorführen. Um die magnetischen Kügelchen mit Streptavidin zu beschichten, wirbeln Sie die Kügelchen zunächst gründlich durch, um sie wieder zu resuspendieren. Übertragen Sie dann 30 Mikroliter der resuspendierten Kügelchen in ein zwei Millimeter großes nukleasefreies Mikrofuge-Röhrchen.

Lassen Sie das mit der Magnetperlensuspension gefüllte Rohr zwei Minuten lang auf dem Magneten. Entfernen Sie nach zwei Minuten den Überstand mit Hilfe einer Mikropipette, wenn die Kügelchen an die Seite des Röhrchens gezogen werden, die mit dem Magneten in Berührung kommt. Geben Sie dann 100 Mikroliter Waschpuffer zu den Kügelchen.

Nachdem Sie den Waschpuffer hinzugefügt haben, entfernen Sie das Rohr vom Magneten. Wirf dann die Perlen 15 Sekunden lang in einen Strudel, um sie zu waschen. Übertragen Sie dann das Röhrchen mit den Magnetkügelchen für zwei Minuten auf den Magneten.

Nachdem die Inkubation beendet ist, pipettieren Sie den Überstand heraus und entsorgen Sie ihn. Geben Sie dann 100 Mikroliter RNase-Befreiungslösung zu den Kügelchen. Wirbeln Sie die Kügelchen 15 Sekunden lang vortexen, um die RNase-Lösung zu mischen.

Inkubieren Sie die Kügelchen dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach fünf Minuten Inkubation übertragen Sie das Röhrchen mit den Magnetkügelchen für zwei Minuten auf den Magneten. Nach der Inkubation pipettieren Sie den Überstand aus und entsorgen Sie ihn.

Geben Sie dann 100 Mikroliter Resuspensionslösung zu den Kügelchen und wirbeln Sie sie 15 Sekunden lang ein. Nach dem Vortexen das Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie nach fünf Minuten das Röhrchen mit den Magnetkügelchen für zwei Minuten auf den Magneten.

Nach zwei Minuten pipettieren Sie den Überstand heraus und entsorgen Sie ihn. Geben Sie anschließend 200 Mikroliter Bead-Blocking-Lösung zu den Beads. Um die Kügelchen in der Blockierungslösung wieder zu suspendieren, wirbeln Sie sie 15 Sekunden lang gründlich bei Raumtemperatur ein.

Lassen Sie die Röhre dann 16 Stunden lang bei vier Grad Celsius auf einem Mehrrohrrotator. Um das Lysat herzustellen, verwenden Sie einen Zellschaber und kratzen Sie die transfizierten HEK293T Zellen unter der laminaren Haube ab. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein zwei Milliliter Mikrofuge-Röhrchen.

Anschließend wird die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 1.500 g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation das Zellpellet in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung auflösen, die bei pH 7,2 gehalten wird. Wiederholen Sie den Vorgang der Zentrifugation, um ein restmediumfreies Pellet zu erhalten.

Nachdem die Zentrifugation beendet ist, das Pellet schnell auf Eis übertragen. Bereiten Sie als Nächstes frischen Zelllysepuffer vor. Nach der Vorbereitung des Puffers geben Sie 260 Mikroliter vollständigen Zelllysepuffer in das Mikrofurchenröhrchen in die Probe.

Pipettieren Sie das Küvettenpellet mehrmals, um eine homogene Suspension zu erhalten. Um die Zellen zu lysieren, inkubieren Sie die Röhrchen 10 bis 15 Minuten lang bei 80 Grad Celsius. Lassen Sie die Zellen dann auf Eis.

Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang bei 16.000 g fünf Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation wird der lysathaltige Überstand in einem sterilen 1,7-Milliliter-Mikrofugeröhrchen auf Eis überführt und das Pellet ausgestoßen. Dem Überstand werden fünf molare Natriumchloride zugesetzt, um eine Endkonzentration von einem molaren zu erreichen.

Bereiten Sie zunächst den Pull-Down-Waschpuffer vor. Nach der Inkubation über Nacht nach dem Blockieren der Beads übertragen Sie das Röhrchen mit den magnetischen Kügelchen für zwei Minuten auf den Magneten. Entsorgen Sie den Überstand nach der Inkubationszeit.

Zu den Kügelchen 150 Mikroliter eiskalten Pull-Down-Waschpuffer geben. Dann die Kügelchen 15 Sekunden lang bei Raumtemperatur wirbeln. Und sofort bei Raumtemperatur 30 bis 60 Sekunden inkubieren.

Übertragen Sie nach einer Minute das Röhrchen mit den Magnetkügelchen für zwei Minuten auf den Magneten. Entsorgen Sie den Überstand nach der Inkubationszeit. Suspendieren Sie dann die Kügelchen in 300 Mikrolitern vollständigem Pull-Down-Waschpuffer

Nach der Zugabe von Natriumchlorid werden 300 Mikroliter des Zelllysats in ein Mikrofuge-Röhrchen gegeben, das mit 300 Mikrolitern Kügelchen gefüllt ist. Lassen Sie die Mischung dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf dem Nudelmischer. Übertragen Sie das Rohr nach einer Stunde fünf Minuten lang auf den Magneten.

Entsorgen Sie den Überstand nach der Inkubationszeit. Geben Sie anschließend 300 Mikroliter eiskalten kompletten Pull-Down-Waschpuffer zu den Kügelchen. Nachdem der Puffer hinzugefügt wurde, die Kügelchen 15 Sekunden lang bei Raumtemperatur wirbeln.

Legen Sie dann das Rohr fünf Minuten lang auf den Magneten. Entsorgen Sie den Überstand nach der Inkubationszeit. Lösen Sie dann die Kügelchen in 100 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser auf und lagern Sie sie auf Eis.

Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus den Kügelchen. Lösen Sie dann die isolierte RNA in 25 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser auf. Messen Sie als Nächstes die RNA-Konzentration im Spektralphotometer.

Bereiten Sie schließlich die Arbeitslösung aus RNA mit 50 Nanogramm pro Mikroliter vor. Verwenden Sie als Nächstes 50 Nanogramm der gesamten isolierten RNA, um komplementäre DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu synthetisieren. Fügen Sie dann Oligo-Primer bis zu einem Endvolumen von 20 Mikrolitern hinzu.

Legen Sie das PCR-Röhrchen auf den Thermocycler und starten Sie den Lauf. Nachdem die qPCR abgeschlossen ist, übertragen Sie neun Mikroliter der PCR-Reaktionsmischung in jede Vertiefung der Platte. Fügen Sie jeder Vertiefung einen Mikroliter komplementäre DNA hinzu, um ein Endvolumen von 10 Mikrolitern zu erreichen.

Verwenden Sie anschließend einen hitzebeständigen PCR-Plattenversiegeler, um die PCR-Platte zu versiegeln und den Thermocycler zu laden. Starten Sie dann das Programm auf dem Thermocycler. Um die Ziele von miR-125b zu validieren, werden die Expressionsniveaus der Ziel-mRNAs von PARP-1 und p53 untersucht.

Interessanterweise sind die Expressionsniveaus von PARP-1- und p53-mRNAs vergleichsweise höher als die der Aktin-mRNA, bei der es sich um die Negativkontrolle handelt. Andere Negativkontrollen, die im Experiment verwendet wurden, sind keine Vorlage und drei biotinylierte Prime-Sequenzen. Darüber hinaus zeigen die drei primierenden untranslatierten Regionen von PARP-1 und p53, die quantifiziert wurden, ebenfalls unterschiedliche Amplifikationsgrade.

Dies steht im Vergleich zu den Negativkontrollen wie Aktin, kein Template und drei prime-biotinylierten Scramble-Sequenzen. Diese Amplifikation von PARP-1 und p53 deutet darauf hin, dass es sich hierbei um starke Ziele von zellulärem miR-125b handelt. Einmal gemeistert, kann diese Technik, beginnend mit der Plattierung der Zellen, über die Transfektion der Biotin-markierten LNA-Nachahmer bis hin zur PCR-Analyse, innerhalb einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die mutmaßlichen mRNA-Ziele in Säugetierzellen validiert werden können. Dies kann mit einem hohen Verhältnis von Spezifität zu niedrigem Rauschen erreicht werden, indem die Transfektion der drei wichtigsten Biotin-markierten gesperrten Nukleinsäuren in den Säugetierzellen eingeführt wird. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit RNA, insbesondere mit kleinen RNAs, wie z. B. Mikro-RNAs, sehr empfindlich und anfällig für Abbau sein kann.

Daher sollten bei der Durchführung dieses Assays die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. die Verwendung von nukleasefreiem Wasser, nukleasefreien Mikrofugenröhrchen und sterilen Puffern, und frisch zubereitete Puffer und Reagenzien sollten bei der Durchführung dieses Assays in Betracht gezogen werden, um eine bessere Empfindlichkeit und bessere Ergebnisse zu erzielen.