Membran Umbau des riesigen Vesikel in Reaktion auf lokalisierte Kalzium Ionen-Gradienten

Wir stellen eine Technik zur Manipulation von Riesenvesikeln unter Verwendung lokalisierter Kalziumionengradienten vor. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die völlig berührungslose Stimulation der Vesikeloberfläche und die direkte Visualisierung des Umbaus der Lipidmembran bei Wechselwirkung mit Kalziumionen. Unser Ansatz führt ein Mittel ein, um die Details der Wechselwirkungen zwischen Kalziumionenmembranen zu untersuchen, und bietet neue Möglichkeiten, die Mechanismen der Umformung der Zellmembran bei Veränderungen in der Zellmikroumgebung zu untersuchen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Lösung von Lipiden in Chloroform vor. Die Endkonzentration von Lipiden in Chloroform beträgt ein Milligramm pro Milliliter und die Endmasse 0,6 Milligramm. Wickeln Sie das Glasfläschchen mit der Lipidmischung mit Metallfolie ein, um den Inhalt vor Umgebungslicht zu schützen.

Legen Sie das in Metallfolie eingewickelte Probenfläschchen in ein Glasbecherglas. Um das Chloroform zu entfernen, wird das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer drei Stunden lang verdampft, wobei der Druck bei 80 U/min ein Vakuum von sieben Kilopascal erreicht. Nach der Verdampfung bildet sich am Boden des Glasfläschchens ein trockener Lipidfilm.

Geben Sie langsam 600 Mikroliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung auf den getrockneten Lipidfilm. Nach der Zugabe des Puffers werden vorsichtig sechs Mikroliter Glycerin hinzugefügt, um die Probe vor vollständiger Dehydrierung während der Bildung eines riesigen unilamellären Vesikels zu schützen, das mit einem mehrlamellären Vesikel oder GUV-MLV verbunden ist. Verschließen Sie das Glasfläschchen mit Parafilm.

Und mit Metallfolie abdecken, um sie vor Umgebungslicht zu schützen. Lagern Sie das Fläschchen über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag wird das Glasfläschchen mit der Lösung eine Minute lang mit einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur beschallt.

Entfernen Sie den Parafilm und pipettieren Sie, bis eine visuell gleichmäßige Lösung aus kleinen Lipidvesikeln gebildet ist. Aliquotieren Sie 30 Mikroliter der erhaltenen kleinen Lipidvesikellösung in einzelne 0,5 Milliliter Kunststoffröhrchen. Ein Kunststoffröhrchen, das ein Aliquot der gefrorenen Suspension kleiner Lipidvesikel enthält, wird bei Raumtemperatur aufgetaut.

Wirbeln Sie das Rohr viermal für ein bis zwei Sekunden mit einem Vortex-Mischer bei maximaler Geschwindigkeit auf. Geben Sie fünf Mikroliter der kleinen Lipidvesikelsuspension auf die Oberfläche eines Glasdeckglases, um ein kleines, rundes Tröpfchen zu bilden. Verwenden Sie ein Deckglas ohne Vorreinigung.

Legen Sie nun das Deckglas für 20 Minuten in einen Vakuumexsikkator. Lagern Sie den getrockneten Lipidfilm vier Minuten bei Raumtemperatur. Pipettieren Sie dann langsam 50 Mikroliter 10 millimolaren HEPES-Puffer auf den trockenen Lipidfilm, um ihn zu rehydrieren.

Warten Sie fünf Minuten, um die GUV-MLV-Komplexe vorzuformen. Zentrieren Sie ein gläsernes Deckglas auf dem Tisch des Mikroskops. Pipettieren Sie dann 300 Mikroliter HEPES-Puffer darauf und positionieren Sie die Mitte des Tröpfchens über dem Objektiv.

Übertragen Sie die 50 Mikroliter der vorgeformten GUV-MLV-Lösung in die HEPES-Lösung. Warten Sie 25 Minuten, damit die spärlich geformten GUV-MLV-Komplexe fest auf der Oberfläche des Glasdeckglases haften können. Runden Sie die Ränder der Kapillaren aus Borosilikatglas ab, indem Sie die Kapillarenden vorsichtig in die Flamme einer Kerze stecken, um zu verhindern, dass die Mikropipette beim Befestigen an der Mikropipettenhalterung zerbricht.

Ziehen Sie mindestens drei Glaskapillaren mit einem automatischen Laserabzieher. Verwenden Sie die im Text erwähnten Kapillaren aus Borosilikatglas, um eine Mikropipette mit einer Spitzenöffnung von ca. 0,3 Mikrometern Durchmesser zu erhalten. Um ein Verstopfen der Pipettenspitze zu vermeiden, filtrieren Sie vor der Verwendung eine fünf Millimolare Calciumchloridlösung in HEPES-Pufferlösung mit einem 0,2 bis 0,5 Mikrometer Spritzenfilter.

Füllen Sie dann jede Mikropipette mit einem Microloader mit acht Mikrolitern der Calciumchloridlösung zurück. Verbinden Sie einen Mikropipettenhalter mit einem Mikromanipulator. Montieren Sie die Mikropipette fest in den Mikropipettenhalter.

Verbinden Sie dann die Einspritzpumpe und den Kapillarhalter über den Zuleitungsschlauch. Stellen Sie nach dem Starten der Injektionspumpe die Einstellungen an der Injektionspumpe auf einen Injektionsdruck von 20 Hektopascal ein. Stellen Sie außerdem einen Ausgleichsdruck von fünf Hektopascal ein.

Stellen Sie das Mikroskop auf den Hellfeldmodus ein. Konfigurieren Sie es für den differentiellen Interferenzkontrast. Verwenden Sie den groben Mikromanipulator, um die Mikropipette über dem Tröpfchen mit den GUV-MLV-Komplexen zu positionieren.

Platzieren Sie die Spitze der Mikropipette über dem Objektiv und bringen Sie die Pipette mit dem groben Mikromanipulator zum Tröpfchen. Stellen Sie das Mikroskop auf den Fluoreszenzmodus ein. Positionieren Sie die Mikropipettenspitze in einem Abstand von drei Mikrometern von der Membranoberfläche, während Sie die Calciumchloridlösung aus der Mikropipette injizieren, damit sich MTPs bilden können.

Um das MTPS entlang der GUV-Oberfläche zu verschieben, bewegen Sie die Pipettenspitze mit dem feinen Mikromanipulator langsam um die GUV-Oberfläche. Halten Sie ungefähr den gleichen Abstand zwischen der GUV-Oberfläche und der Mikropipettenspitze ein, während Sie die Calciumioneninjektion fortsetzen. Um die Mikroinjektion zu stoppen, schalten Sie die Einspritzpumpe aus.

Hier ist eine repräsentative fluoreszierende Mikroskopieaufnahme eines GUV-MLV-Komplexes zu sehen, der auf der Oberfläche eines Glasdeckglases immobilisiert ist. Die röhrenförmigen Ausstülpungen der Membran, die bei der lokalisierten Injektion von Kalziumionen an der Oberfläche des GUV entstehen, sind in diesen Bildern zu sehen. Die Verschiebung der Mikropipettenspitze um die Membranoberfläche, wie durch den Pfeil angezeigt, löst eine Bewegung der röhrenförmigen Vorsprünge der Membran in Richtung der Kalziumionenquelle aus.

Zusammenfassend schlagen wir eine Technik vor, die einen kontaktlosen Membranumbau von riesigen Lipidvesikeln ermöglicht, was bei lokalisierter Stimulation mit Kalziumionen zur Bildung von röhrenförmigen Membranvorsprüngen führte. Zu den zukünftigen Anwendungen dieser Methode gehören der Übergang von synthetischen Lipidvesikeln zu nativen biologischen Membranen oder die Anwendung dieses Ansatzes auf polymere Systeme mit dem Ziel, kontaktlose Mikromanipulationsplattformen zu entwickeln.