Name: Gesundes Gehirn-Hypophysen-Scheiben für Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen in Teleost Fische (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Lernen Sie die Präparation lebensfähiger Gehirn-Hypophysen-Scheiben aus Medaka (Oryzias latipes) für elektrophysiologische Untersuchungen mittels Patch-Clamp-Technik. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Kommunikation und Reaktionen auf Gehirnsignale im neuroendokrinen Kontext.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Frau LourdesCarreon G Tan für ihre Hilfe, die Aufrechterhaltung der Medaka Anlage und Anthony Peltier für die anschaulichen Zahlen. Diese Arbeit wurde von NMBU und der Forschung Rat von Norwegen, Grantnummern 244461 (Aquakultur-Programm) und 248828 (Digitalleben Norwegen-Programm) finanziert.

Alle Tier Handhabung wurde entsprechend den Empfehlungen für die Pflege und das Wohlergehen der Versuchstiere an der Norwegian University Life Sciences und unter der Aufsicht der autorisierte Ermittler durchgeführt.
1. Vorbereitung der Instrumente und Lösungen
Hinweis: Alle Lösungen sollten steril sein. Sorgfältige Augenmerk auf den pH-Wert und die Osmolalität (Osmol/kg Wasser) aller Lösungen, die sorgfältig die extrazellulären Umwelt der untersuchten Arten angepasst werden sollte. pH-Wert und Osmolalität sollte mit präzisen elektronischen Geräten wie pH-Meter und Gefrierpunkt XR angepasst werden.
<ol><li>
500 mL der extrazellulären Lösung ohne Ca2 + zu machen (Ca2 + gratis EG): 150 mM NaCl, KCl, 1,3 mM MgCl2, 5 mM 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreinen 61,89 mg (0,055 uS / cm bei 25 ° C, der Widerstand von 18,2 MOhm) H2O in ein Becherglas mit einem magnetischen Rührer.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
500 mL der extrazellulären Lösung (EG) zu machen: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 147,01 mg CaCl2, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
500 mL der extrazellulären Lösung mit 0,1 % Rinderserumalbumin (EG mit BSA) zu machen: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, 4 mM Glukose, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Lösen Sie 4,38 g NaCl, 186,37 mg KCl, 147,01 mg CaCl2, 61,89 mg MgCl2, 360,32 mg Glucose und 1,19 g HEPES in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit NaOH.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 290 – 300 mOsm mit Mannit. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter. Fügen Sie 50 mg BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
250 mL der intrazellulären Lösung (IC) zu machen: 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, 20 mM Saccharose.
	<ol>
<li>Lösen Sie 1,54 g KOH, KCl 327,75 mg, 595,75 mg HEPES und 1,712 g Saccharose in 450 mL hochreines H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2 mit (N-Morpholino) Ethan Sulfo (MES) Säure.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lösung in einem 250 mL volumetrischen Kolben. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 250 mL.</li>
		<li>Mischen Sie die Lösung gut vor der Messung der Osmolalität. Passen Sie auf 280 – 290 mOsm (niedriger als EG 10 mOsm) mit Saccharose. Filter zu sterilisieren die Lösung mit Wasser Vakuumsystem und 0,2 µm-Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Machen Sie 100 mL 2 % niedrig schmelzende Agarose-Lösung in Ca2 + und BSA frei EG (2 g niedrig schmelzende Agarose in 100 mL Ca2 + gratis EG). Lösen Sie mit Hilfe einer Mikrowelle auf und legen Sie die geschmolzene Agarose in einem Wasserbad bei 40 ° C. Lassen Sie sie abkühlen, bis 40 ° C vor dem Gebrauch auf das Gewebe erreicht. Hinweis: EG, Ca2 + kostenlose EG bei 4 ° C für mehrere Wochen, wenn steril und IC-Lösungen bei-20 ° C, für mehrere Monate gelagert werden kann. Agarose pro Woche bei 4 ° C gelagert werden und durch kurz Mikrowelle 3 – 5 Mal wiederverwendet werden kann. Übermäßige Wiederverwendung führt zur Verdunstung und Veränderung der Agarose und Salzkonzentration und Qualität.</li>
	<li>
Agar-Brücke zu machen:
	<ol>
<li>Erhitzen Sie 7,5 mm lange Borosilikatglas Kapillaren mit Außendurchmesser (Außendurchmesser) 2 mm und Innendurchmesser (ID) 1,16 mm mit dem Bunsenbrenner auf einen fokalen Punkt ca. 1/3 von einem Ende bis das Glas beginnt zu beugen. Entfernen Sie das Glas von der Flamme und lassen Sie das Glas mit einem Winkel von etwa 120 Grad (Abb. 2A) beugen.</li>
		<li>Schmelzen Sie 2 % Agar in normalen EG ohne Glukose mit Hilfe einer Mikrowelle, und während die Agarose Flüssigkeit zu füllen ist das vorgefertigte Glas-Kapillare mit Kapillarität zwingt, indem eines der Enden des Glases in die Flüssigkeit und warten einige Minuten. Brücken bis zur Verwendung bei 4 ° C im EG ohne Glukose zu speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie Borosilikatglas mit Glühfaden Patch Pipetten mit einem geeigneten Pipette Abzieher vor. Finden Sie die Pipette Puller Handbuch der gewünschten elektrodenwiderstand zu erhalten. Hinweis: Die Verjüngung der Pipette sollte so kurz wie möglich sein. Kurze Pipette Kegel wird mit 4 – 6 ziehende Schritte erreicht. Der elektrodenwiderstand sollte zwischen 2 und 6 MΩ je nach Größe der Zellen.</li>
	<li>
Zur Vermeidung von Bewegung des Gewebes während der Patch-Clamp-Experimenten Mantel der Oberfläche der Aufnahme Kammer mit 0,1 % der Polyethylenimine (PEI) in Borat-Puffer.
	<ol>
<li>Bereiten Sie 500 mL Borat Puffer (25 mM):<ol>
<li>Lösen Sie 4,768 g Na2B4O710 H2O in 450 mL von hochreinen H2O in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührwerk auf.</li>
			<li>PH-Wert auf 8,4 mit HCl anpassen.</li>
			<li>Übertragen Sie die Lösung in eine Volumetrische 500 mL-Flasche. Füllen Sie den volumetrischen Kolben mit hochreinen H2O bis 500 mL und 0,2 µm-Filter die Lösung mit Wasser Vakuumsystem sterilisieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Endnutzung eine 1 %-Stammlösung von PEI (1 mL 50 % PEI auf 49 mL 25 mM Borat Puffer) und eine 0,1 % PEI Verdünnung durch Verdünnung 10 µL der Stammlösung 1 % in 100 µL Puffer Borat vorbereiten.</li>
		<li>2 mL 0,1 % PEI auf dem Glas des Inhabers Scheibe und lassen Sie die Beschichtung für 1 Minute inkubieren. Dann kurz waschen Sie das Glas zweimal mit 5 mL des hochreinen H2O und lassen Sie Luft bis zum Gebrauch trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amphotericin B Lösungen vorzubereiten.
	<ol>
<li>Machen Sie 60 mg/mL Stammlösung durch Auflösen von 3 mg Amphotericin B Pulver in 50 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) in einer 1-mL-Tube vor Licht geschützt werden. Strudel mit der maximalen Geschwindigkeit für 30 s und für 15 min zum Homogenisieren beschallen. Speichern Sie Aliquote in 3 – 5 Röhrchen bei-20 ° C und verwenden Sie einer Teilprobe pro Tag. Hinweis: Wenn Vorratslösung Amphotericin B nicht klar und gelb ist Farbe, sondern milchig (noch gelb) nach 15 – 20 min. Beschallung stellen eine neue Stammlösung.</li>
		<li>Machen Sie IC-Lösung mit Amphotericin B durch pipettieren 2 mL des IC in ein sauberes Glasgefäß mit mehr als 10 mL Fassungsvermögen. 8 µL der Stammlösung Amphotericin B in die Pipette Lösung und Mischen von pipettieren. Wickeln Sie das Becherglas mit Aluminiumfolie und Platz auf dem Eis bis zur Verwendung und erneuern Sie alle 3 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Präparation und Schneiden mit Vibratome
<ol><li>Bereiten Sie die Dissektion Werkzeuge vor sezieren, darunter eine scharfe und eine starke Zange mit einer Schere. Reinigen Sie die Werkzeuge (Gewebe-Halter, Bürste, Zange) mit Ethanol und stellen Sie sicher, dass sie nur zu Zwecken der Dissektion und nie in Kontakt mit festen Gewebe verwendet werden. Halten sie in einem separaten Feld zur Vermeidung von Kontaminationen.</li>
	<li>Den Fisch in kaltem Eiswasser für 1 min einschläfern.</li>
	<li>
Befolgen Sie die nachfolgenden Schritte aus, um schnell die Medaka Gehirn und Hypophyse mit scharfen Zangen zergliedern (verwenden Sie nicht mehr als 3 min).
	<ol>
<li>Halten die Fische mit der starken Zange schwere die beiden Sehnerven hinter den Augen mit einer Schere oder Pinzette scharf.</li>
		<li>Öffnen Sie die dorsalen Teil des Schädels aus der hinteren an der vorderen Seite durch Brechen der Schädelknochen Schritt für Schritt mit starker Zange.</li>
		<li>Der Schädel auf der einen Seite mit starker Zange abziehen.</li>
		<li>Schwere des Rückenmarks mit einer Schere oder scharfen Zange.</li>
		<li>Sanft, das Rückenmark mit der Zange greifen, das Gehirn vom hinteren zum vorderen flip und legen Sie sie in eine Schüssel mit eiskaltem Ca2 + Kostenlose ec</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füllen Sie eine 1,5 – 2 cm3 Metallform mit flüssige Agarose und legen Sie es auf dem Eis.</li>
	<li>Kurz bevor die Agarose (bei ca. 25 – 30 ° C) erstarrt, sanft greifen Sie das Gehirn durch das Rückenmark mit der Zange, trocknen Sie die Zange mit einem Stück feines Papier und legen Sie das Gewebe in der Agarose. Mischen Sie schnell die Agarose um die Spuren der EG Links rund um das Gewebe zu verdünnen und das Gewebe zu orientieren und lassen die Form auf dem Eis für ein paar Sekunden bis die Agarose härtet. Anmerkung: Es ist wichtig für diesen Schritt schnell sein. Die Agarose erstarrt schnell wie die Metallform durch das Eis abgekühlt ist.</li>
	<li>Schneiden Sie ein Quadrat von Agarose, enthält das Gewebe mit einer Skalpellklinge und Vibratome Probenhalter mit Chirurgie (ungiftig) Kleber aufkleben.</li>
	<li>Füllen Sie die Küvette der Vibratome erhalten (Gehirn-Hypophyse) Probenhalter mit eiskalten Ca2 + kostenlose EG.</li>
	<li>Probenhalter in der Vibratome und schneiden Sie die Agarose-Block um parasagittalen Abschnitte von 150 µm, mit hoher Frequenz und niedriger Drehzahl für den Schnitt zu machen. Sammeln Sie die ausgewählten Abschnitte zu und legen Sie sie in die Patch-Clamp-Aufnahme-Kammer mit 3 mL eiskaltes Ca2 + kostenlose EG</li>
	<li>Legen Sie die Raster-Harfe (Abbildung 2B) auf dem Gewebe. Hinweis: Die Harfe wird zusammen mit der Beschichtung stabilisieren das Gewebe und verhindern, dass es während der Patch-Clamp-Aufnahmen bewegt.</li>
	<li>Nachdem die Harfe vorhanden ist, ändern Sie die Ca2 + freie EG Mitte in der normalen EG mit Ca2 + und BSA. Lassen Sie die Gewebe 10 min ruhen.</li>
</ol>(3) perforiert, Patch-Clamp und elektrophysiologische Aufnahmen
<ol><li>Vor Beginn des Experiments, Chlorid Silber Draht Elektroden mit den folgenden Schritten: zunächst ein feines Schleifpapier (p180) verwenden, um die Silberdraht-Elektroden reinigen. Zweitens mit 2 mL 70 % igem Ethanol spülen. Drittens: Tauchen Sie die Drähte in 2 mL, 2 – 5 % Chlor für 10 min. Zu guter Letzt spülen Sie mit 2 mL, hochreine H2O.</li>
	<li>Legen Sie die Aufnahme Kammer mit der Gehirn-Hypophysen-Scheibe in den Mikroskoptisch und suchen Sie den Zielbereich (Hypophyse) mit 10 X-Objektiv und Inspizieren Sie die Zellen mit 40 X Objektiv. Hinweis: Wenn die Vorbereitung erfolgreich ist, sollte sehr wenige Rundzellen sichtbar sein. Diese Runde Zellen sind in der Regel beschädigte Zellen, die aus dem Gewebe lösen werden.</li>
	<li>Legen Sie die Erdung Elektrode durch die 2 % Agar-Brücke in das EG-Bad.</li>
	<li>Suchen Sie eine gesunde Zelle mit 40 X Objektiv. Hinweis: Eine gesunde Zelle sollte fest an das Gewebe Slice und nicht aufgerundet und losgelöst von der Scheibe.</li>
	<li>Einstellen des Verstärkers in Voltage-Clamp (VC; Abbildung 4A Nummer 1) Modus. Offenen testen die Dichtung Fenster und drücken Sie das Bad Konfiguration (Abbildung 4 b Punkt 1 und 2. Nutzen Sie ein 5-mV Pulse Pipette Widerstand (Abbildung 4 b Ziffer 3) zu überwachen.</li>
	<li>Abgleich der Patch PIPETTENSPITZE mit Antimykotika kostenlose IC-Lösung vor dem Hinzufügen der IC-Lösung mit Amphotericin B mit einer Mikro-Füller-Spritze (siehe Abbildung 3).</li>
	<li>Fügen Sie einen leicht positiver Luftdruck in der Patch-Pipette mit 1 mL Spritze. Hinweis: Dadurch wird eine kleine Flüssigkeitsstrom aus der Patch-Pipette, die Vermeidung von Kontaminationen der Spitze.</li>
	<li>Einmal in der Badewanne, bewerten Sie den Patch Pipette Widerstand zu und stellen Sie sicher, dass keine Partikel an der Spitze der Pipette (Abbildung 4) verbunden sind. Hinweis: Ein kleines Stück Klebeband ist auf den Monitor Anzeige der video-Aufnahme-Form das Sichtfeld angebracht. Dies macht die Positionierung der Patch Pipette relativ Zelle einfacher wenn das Ziel nicht auf die Zelle richtet.</li>
	<li>Führen Sie die Patch-Pipette auf die Zelle mit Mikromanipulatoren. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Pipette ist sauber von der Suche nach kleinen Teilchen, die an der Spitze der Pipette angebracht haben können. Plötzliche Änderungen im Widerstand möglicherweise auch eine Folge der Partikel in der Pipettenspitze stecken.</li>
	<li>Passen Sie die Pipette, wenn wenige Mikrometer über der Zelle damit die Spitze der Pipette die Zelle 1/3 von der Mitte der Zelle, berühren wird, wie in Abbildung 5dargestellt. Wenn die Zelle berühren, lassen Sie den Druck und gelten Sie die sanfte Saugwirkung um eine Dichtung zu machen. Hinweis: Die Zeit aus der Patch-Pipette betritt das Bad zu einem erfolgreichen Dichtung sollte so kurz wie möglich gehalten werden. Nicht mehr als 1 – 1,5 min zur Vermeidung von Amphotericin B erreichen die Spitze der Pipette und Leck in die Wanne.</li>
	<li>Sofort wechseln Sie zum Fenster " Patch " in der Patch-Clamp-Software (Abbildung 4 D Punkt 1) und haben Sie eine Holding Potential zwischen-50 und-60 mV (Abbildung 4 Punkt 2). NULL heraus aus der Glaspipette (Abbildung 4 Punkt 3) die schnelle Kapazität zusammensetzt.</li>
	<li>Wechseln Sie in die Zelle -Fenster in Patch-Clamp-Software (Abbildung 4E Punkt 1 und 2) und starten Sie die Überwachung Zugang Widerstand, Ra, erscheint im Fenster. NULL, die Kapazität der Membran in der Verstärker-Software (Abbildung 4E Punkt 3) nach ausreichender Zugang. Hinweis: Ausreichender Zugang dauert 10 bis 30 min (Abbildung 4E Punkt 2). Ein guter Zugang zur aktuellen Klemme Aufnahmen sollte unter 20 M liegen.</li>
	<li>Wechseln Sie zur zangenstromwandler, IC, in Verstärker Software-Fenster (Abbildung 4F Punkt 1). Passen Sie die schnell-kapazitive Ströme im Fenster Klemme der Verstärker Software (Abbildung 4F Punkt 2 und 3) auf den gleichen Wert wie in 3.12. Überprüfen Sie die Membran Potenzial (Abbildung 4F Punkt 1). Hinweis: Wichtig ist, wenn das Membranpotential seicht ist (typische über-35 mV) die Zelle beschädigt werden. Die Aufnahme abbrechen und eine neue Zelle zu finden.</li>
	<li>Nach der Suche nach einer gesunden Zelle (fest des Gewebes mit Membranpotential unter-40 mV), beginnen die experimentelle Aufnahmen wie in des Herstellers Protokoll 33,34.</li>
</ol>

<ol><li>Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+signaling+in+the+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Ion channels and signaling in the pituitary gland.</a> Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).</li>
<li>Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+basis+of+pituitary+cell+type-specific+Ca2%2B+signaling-secretion+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling.</a> Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).</li>
<li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-D2+actions+on+voltage-dependent+calcium+current+and+gonadotropin-II+secretion+in+cultured+goldfish+gonadotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroendocrinol%22%5BJournal%5D)">Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs.</a> J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).</li>
<li>Chang, J. P., Pemberton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+GnRH-Stimulated+signal+transduction+in+the+vertebrate+pituitary+-+Contributions+from+teleost+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems.</a> Mol Cell Endocrinol. , (2017).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inward+membrane+currents+and+electrophysiological+responses+to+GnRH+in+ovine+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).</li>
<li>Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+as+a+Prolactin+%28PRL%29+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor.</a> Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).</li>
<li>Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GnRH-Induced+%5BCa2%2B%5Di-signalling+patterns+in+mouse+gonadotrophs+recorded+from+acute+pituitary+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro.</a> Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeher%2C+E+%22Techniques+in+cellular+physiology%22">Techniques in cellular physiology</a>. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Cahalan, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques: an overview.</a> Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).</li>
<li>Marty, A., Neher, E. <a target="_blank" href="NULL">Single Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).</li>
<li>Lindau, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2417125">IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels.</a> Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
<li>Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+access+resistance+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).</li>
<li>Fan, J. S., Palade, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9799421">Perforated patch recording with beta-escin.</a> Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).</li>
<li>Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22705036">Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH.</a> Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="https://www.springer.com/us/book/9780306448706">Single-Channel Recording</a>. , Springer. US. 3-35 (1983).</li>
<li>Andersen, P. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/trends/neurosciences/abstract/0166-2236(81)90019-9">Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness.</a> Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).</li>
<li>Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+spontaneous+Ca2%2B+transients+in+acute+anterior+pituitary+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).</li>
<li>Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotonic+coupling+in+the+anterior+pituitary+of+a+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish.</a> Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).</li>
<li>Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+the+rat+anterior+pituitary%3A+morphology%2C+physiology+and+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication.</a> J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).</li>
<li>Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ionic+currents+and+electrophysiological+properties+of+goldfish+somatotropes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture.</a> Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).</li>
<li>Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-activated+ionic+currents+in+goldfish+pituitary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).</li>
<li>Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+membrane+properties+and+ionic+currents+in+cultured+goldfish+gonadotrophs%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs.</a> Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).</li>
<li>Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitance+increases+of+dissociated+tilapia+prolactin+cells+in+response+to+hyposmotic+and+depolarizing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli.</a> Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).</li>
<li>Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+properties+of+pituitary+cells+in+primary+culture+from+Atlantic+cod+%28Gadus+morhua%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).</li>
<li>Strandabo, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+involved+in+GnRH2-stimulation+of+identified+LH-producing+gonadotropes+from+lhb-GFP+transgenic+medaka+%28Oryzias+latipes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes).</a> Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).</li>
<li>Hodne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+differences+between+fshb-+and+lhb-expressing+gonadotropes+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture.</a> Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).</li>
<li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka--a+model+organism+from+the+far+East%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).</li>
<li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes%2C+amphibians%2C+and+reptiles%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).</li>
<li>pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. <a target="_blank" href="NULL">Molecular Devices Corporation</a>. , (2006).</li>
<li>MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. <a target="_blank" href="NULL">Axon Instruments / Molecular Devices Corp</a>. , (2005).</li>
<li>Dominguez-Mancera, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+regulation+of+inward+membrane+currents%2C+electrical+activity+and+LH+release+in+isolated+bovine+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).</li>
<li>Schmidt-Nielsen, K. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books/about/Animal_Physiology.html?id=Af7IwQWJoCMC">Animal Physiology : adptation and environment fifth edition</a>. , Cambridge university press. 613(1997).</li>
<li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+determinants+of+normal+arterial+plasma+pH+in+ectothermic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates.</a> J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).</li>
<li>Burton, R. F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0300962995021027">The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).</li>
<li>Heming, T. A., Blumhagen, K. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0166445X88900306">Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments.</a> Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).</li>
<li>Reeves, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+body+temperature+and+acid-base+balance+in+ectothermic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates.</a> Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).</li>
<li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature%3A+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li>
<li>Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+seawater+experience+enhances+seawater+adaptability+in+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Lett%22%5BJournal%5D)">Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes.</a> Zoological Lett. 2, 12(2016).</li>
<li>Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ion+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).</li>
<li>Holz, R., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water+and+nonelectrolyte+permeability+induced+in+thin+lipid+membranes+by+the+polyene+antibiotics+nystatin+and+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B.</a> J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Elektrophysiologische Aufnahmen mit der Patch-Clamp-Technik auf Gehirn-Hypophysen Scheiben benötigen sorgfältige Optimierung. Gut optimierte Protokolle für Leben-Zelle Untersuchungen insbesondere umkonstruiert beschränken sich die meisten Publikationen mit Protokollen auf Basis von Säugetier-Systemen. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Tatsache, dass mehrere physiologische Parameter wie pH-Wert und Osmolalität kennen nicht nur Arten angewiesen, aber auch sehr stark abhängig ob der betreffende Organismus lebt auf ...

Die Hypophyse ist ein wichtiger endokrine Organ bei Wirbeltieren unterhalb des Hypothalamus und posterior, die Optik Chiasmus. Es produziert und sondert sechs bis acht Hormone aus der spezifischen Zelltypen. Hypophyse Hormone bilden ein Zwischenprodukt zwischen Gehirn und periphere Organe und fahren zahlreiche essentielle physiologische Prozesse einschließlich Wachstum, Fortpflanzung und Regelung der Homöostase. Ähnlich wie bei Neuronen, endokrinen Zellen der Hypophyse sind elektrisch erregbare mit der Fähigkeit, spontan Aktionspotentiale abzufeuern 1. Die Rolle der diese Aktionspotentiale ist Zelle angewiesen. In verschiedenen Zelltypen der Säugetier-Hypophyse können Aktionspotentiale der intrazellulären Ca2 + ausreichend für ein verzögerter Freisetzung des Hormons 2erheben. Darüber hinaus erhält die Hypophyse stimulierende und hemmende Informationen aus dem Gehirn, das das Membrane Potential der Zellen 3,4,5,6betrifft. In der Regel stimulierende Eingang erhöht die Erregbarkeit und oft beinhaltet die Freisetzung von Ca2 + von intrazellulären speichern sowie erhöhte Frequenz 7feuern. Verstehen, wie die Zelle nutzt die Ionen-Kanal-Komposition und passt sich diese Signale aus dem Gehirn ist Schlüssel zum Verständnis der hormonsynthese und Freigabe.
Die Patch-Clamp-Technik wurde in den späten 1970er Jahren von Sakmann und Neher 8,9,10 entwickelt und weiter verbessert, indem Hamill 11, und ermöglicht detaillierte Untersuchungen der elektrophysiologischen Eigenschaften von Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Darüber hinaus kann die Technik verwendet werden, für das Studium von Strom und Spannung. Patch-Klemmung ist heute der Goldstandard für die Messung von elektrophysiologischer Eigenschaften der Zelle. Vier wichtige Konfigurationen von dicht-Patch-Clamp-Technik wurden entwickelten 11; der Zelle angebracht, Inside-Out, die außen-Out und die gesamte Zelle Patch. Die drei ersten Konfigurationen sind in der Regel für einzelne Ionen-Kanal Untersuchungen verwendet. Für die vierte, von der Zelle-attached Konfiguration wird ein Loch in der Zellmembran mit Sub-atmosphärischen Druck hergestellt. Diese Konfiguration ermöglicht auch Untersuchungen der Ionen-Kanal Zusammensetzung der ganzen Zelle 12. Eine Einschränkung dieser Technik ist jedoch, dass zytoplasmatischen Moleküle durch den Patch Pipette Lösung 13 (Abb. 1A), was sich auf die elektrische und physiologischen Reaktionen der untersuchten Zellen verdünnt werden. In der Tat können einige von diesen Molekülen eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion des Signals oder bei der Regulierung der verschiedenen Ionenkanäle spielen. Um dies zu vermeiden, Lindau und Fernandez 14 eine Methode entwickelt, wo eine Pore-forming Verbindung zu den Patch-Pipette hinzugefügt. Im Anschluss an die Zelle-attached Konfiguration wird die Verbindung in der Plasmamembran unter den Patch integrieren und langsam Perforieren die Membran Erstellung elektrischen Kontakt mit dem Zytosol (Abbildung 1B). Mehrere verschiedene Antimykotika wie Nystatin 15 und Amphotericin B 16oder Tenside wie Saponin Beta-Aescin 17,18 können verwendet werden. Diese Verbindungen erstellen Poren groß genug, um monovalente kationen und Cl– Diffusion zwischen dem Cytosol und die Patch-Pipette unter Beibehaltung der cytosolischen Ebenen von Makromolekülen und größeren Ionen wie Ca2 + 15zu ermöglichen, 16.
Die Herausforderung der Verwendung von perforierten Patch ist der potenziell hohen Reihenwiderstand. Vorwiderstand (R-s) oder Zugang Widerstand ist der Gesamtwiderstand über die Patch-Pipette im Verhältnis zum Boden. Während Patch-Clamp-Aufnahmen, die R-s werden parallel mit Membran-Widerstand (Rm). Rm und Rs in Parallele Arbeit als Spannungsteiler. Mit dem hohen R-s, fällt die Spannung über die R-s geben Fehler in den Aufnahmen. Der Fehler wird mit größeren Strömungen erfasst größer geworden. Darüber hinaus ist der Spannungsteiler auch frequenzabhängig einen Tiefpass-Filter, was sich auf die zeitliche Auflösung zu schaffen. In der Tat kann der perforierten Patch nicht immer zulassen Aufnahmen von großen und schnellen Strömungen wie die Spannung Na+ Strömungen Gated (für detaillierte Messwerte Referenz 19 Siehe) Rs kann auch während der Patch-Clamp-Aufnahmen, wieder führt zu Veränderungen in den aufgenommenen Strom variieren. So können Fehlalarme in Situationen auftreten wo Rs während der Zulassungsantrag ändert.
Die Elektrophysiologie auf das geschnittene Gewebe wurde erstmals von Andersen-Lab, elektrophysiologische Eigenschaften der Nervenzellen im Gehirn 20zu studieren. Die Technik ebnete den Weg für detaillierte Untersuchungen der Einzelzellen sowie Zellezelle Kommunikation und Zelle Schaltungen in einem mehr intakten Umwelt. Eine ähnliche Technik für die Herstellung von Hypophyse Scheiben wurde von Guérineau Et Al. 1998 eingeführt. 21. es war jedoch nicht vor 2005 wurde dieser Gehirn-Hypophysen Slice-Vorbereitung für Patch-Clamp-Studien in teleost 22erfolgreich eingesetzt. In dieser Studie berichteten die Autoren auch die Verwendung von perforierten Patch-Clamp-Aufnahmen. Allerdings wurden bei weitem die meisten elektrophysiologischen Untersuchungen der Hypophysen Zellen bei Säugetieren, und nur eine Handvoll anderer Wirbeltiere, einschließlich teleost Fische 1,2,22,23 durchgeführt . Im umkonstruiert wurden fast alle Studien am primären dissoziierten Zellen 24,25,26,27,28,29,30 durchgeführt. .
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Zubereitung von gesunden Gehirn-Hypophysen-Scheiben aus dem Modell Fisch Medaka. Der Ansatz stellt mehrere Vorteile im Vergleich zu primären dissoziierten Zellkulturen. Zuerst werden die Zellen in einer relativ geschützten Umgebung im Vergleich zu Zelle Kulturbedingungen getrennt erfasst. Zweitens erlauben Slice Vorbereitungen uns indirekte Wege vermittelt durch Zell-Zell-Kommunikation- 22, das ist nicht möglich in dissoziierten Zelle Kulturbedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus führen wir elektrophysiologische Aufnahmen auf die erhaltenen Gewebe-Scheiben mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik mit Amphotericin B als die porenbildner durchzuführen.
Medaka ist eine kleine Süßwasserfische aus Asien, vor allem in Japan gefunden. Physiologie, Embryologie und Genetik von Medaka wurden für mehr als 100 Jahren 31ausgiebig untersucht, und es ist eine häufig verwendete Forschungsmodell in vielen Laboratorien. Für dieses Papier von besonderer Bedeutung ist die deutliche morphologische Organisation der Hypothalamus-Hypophysen-Komplex in teleost Fische: während in Säugetiere und Vögel der Hypothalamus Neuronen ihre Neuro-Hormone regulieren Hypophyse endokrine Zellen freigeben in das Portal die mediane Eminenz ist eine direkte nervöse Projektion des Hypothalamus Neuronen auf die endokrinen Zellen der Hypophyse in teleost Fische 32. Deshalb sorgfältig durchgeführte Gehirn-Hypophysen Schneiden von besonderer Bedeutung in Fisch, ermöglicht es uns, elektrophysiologische Eigenschaften der Hypophysen Zellen in einem gut erhaltenen Gehirn-Hypophysen-Netzwerk und insbesondere wie Hypophysen Zellen untersuchen Steuern Sie ihre Erregbarkeit und damit Ca2 + Homöostase.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgischer Kleber</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond Tissue</td></tr><tr><td>Adhesive Klingen aus rostfreiem Stahl</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Metallformen</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>Stahlharfe</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hochreine LMP Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>Patch-Pipetten</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10HP</td><td>Borosilikatglas mit Filament Außendurchmesser:1,5 mm, Innendurchmesser:1,10 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop Slicescope</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>Software</td></tr><tr><td>Digitizer Digidata 1550A1</td><td>Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Verstärker Multiclap 700B Kopftisch CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH Trifluoracetatsalz&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>porenbildendes Antibiotikum</td></tr><tr><td>Polyethylenimin</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI Lösung</td></tr><tr><td>Mikrofiler</td><td>Spritze WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>Glas für die</td><td>Agarbrücke Sutter Instrument</td><td>BF200-116-15</td><td>Borosilikatglas mit Filament Außendurchmesser:2,0 mm, Innendurchmesser:1,16 mm Feuerpolierte</td></tr><tr><td>Micro-Manager Software</td><td></td><td></td><td>Open Source Mikroskopie Software</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS Kamera</td><td>Qimaging</td><td>&nbsp; 01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Elma</td><td>D-7700 singen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-Säure</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

gesundes gehirn-hypophysen-scheiben für elektrophysiologische untersuchungen der hypophysen zellen in teleost fische

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen wurden in zahlreichen Wirbeltierarten, aber nur sehr wenige in den teleost Fischen durchgeführt. Unter diesen sind die klare Mehrheit an dissoziierten Primärzellen durchgeführt worden. Um zu einem besseren Verständnis der wie teleost Hypophysen Zellen, in einem mehr biologisch relevante Umfeld Verhalten, veranschaulicht dieses Protokolls lebensfähige Gehirn-Hypophysen-Scheiben mit kleinen Süßwasserfische Medaka (Oryzias Latipes) vorzubereiten. Machen die Gehirn-Hypophysen-Scheiben, wurden pH-Wert und Osmolalität aller Lösungen auf Werte in Körperflüssigkeiten von Süßwasserfischen Leben bei 25 bis 28 ° c eingestellt Nach Vorbereitung der Scheibe veranschaulicht das Protokoll führen elektrophysiologische Aufnahmen mit perforierten ganze Zelle Patch-Clamp-Technik. Die Patch-Clamp-Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, mit noch nie da gewesenen zeitlicher Auflösung und Empfindlichkeit, so dass die Untersuchung der elektrischen Eigenschaften von intakten ganze Zellen bis auf einzelne Ionenkanäle. Perforierten Patch ist einzigartig, da es hält die intrazelluläre Umwelt intakt zu verhindern, dass sich regulatorische Elemente in das Zytosol durch die Patch-Pipette-Elektrode-Lösung verdünnt wird. Im Gegensatz dazu wurde bei der gesamten Zelle Bauform es beobachtet, dass Medaka Hypophysen Zellen schnell ihre Fähigkeit verlieren, Aktionspotentiale abzufeuern. Unter den verschiedenen Perforation-Techniken veranschaulicht dieses Protokoll zu Perforation der gepatchten Membran mit Fungizid Amphotericin b.

Dieses Protokoll zeigt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll wie zuverlässige elektrophysiologische Aufnahmen aus Zellen der Hypophyse (Gonadotrope), mit einer Medaka transgene Linie [Tg (Lhb- HrGfpII)], wo Zellen das Ziel (Gonadotropine Lh-Produktion) mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) beschriftet sind.
Zunächst wurden die elektrophysiologischen Untersuchungen mit ganz-Zell Konfiguration durchgeführt. Jedoch wurden s...

Der Artikel beschreibt eine optimierte Protokoll für machen lebensfähigen Gehirn-Hypophysen Gewebe Scheiben schneiden, mit den teleost Fische Medaka (Oryzias Latipes), gefolgt von elektrophysiologischen Aufzeichnungen von Hypophysen Zellen mithilfe der Patch-Clamp-Technik mit der perforierten Patch Konfiguration.

Gesundes Gehirn-Hypophysen-Scheiben für Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen in Teleost Fische

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroendokrinologie zu beantworten. Zum Beispiel, wie kommunizieren Hypophysenzellen, reagieren auf Freisetzungsfaktoren aus dem Gehirn? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass dieses Verfahren im Vergleich zu dieser ersten primären Zellkultur die Untersuchung von Zellen in einer intakteren Umgebung ermöglicht.Diese Methode kann jedoch einen Einblick in die elektrischen Eigenschaften der luteinisierenden hormonproduzierenden Zellen in Medaka geben. Mit nur geringfügigen Anpassungen kann es auch für andere Zelltypen oder für andere Fischarten verwendet werden. Während Sie einen euthanasierten Teleost-Fisch mit einer ethanolsterilisierten starken Pinzette unter ein Präpariermikroskop halten, durchtrennen Sie mit einer scharfen Pinzette die beiden Sehnerven hinter den Augen und brechen die Schädelknochen von der hinteren zur vorderen Seite.Benutze die Pinzette, um den Schädel abzuziehen und das Rückenmark zu durchtrennen. Greifen Sie vorsichtig mit der Pinzette nach dem Rückenmark, drehen Sie das Gehirn von der hinteren in die vordere Ausrichtung und legen Sie das Organ in eine Schale, die mit eiskaltem, kalziumfrei

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir nutzen die Patch-Clamp-Technik, um GABA-aktivierte Einkanal-Ströme (GABAA-Kanälen, GABAA-Rezeptoren) und die synaptischen und Tonic Ströme erzeugen sie in Neuronen zu messen. Aktivierung der Kanäle sinkt neuronale Erregbarkeit in Gesundheit und...

GABA-aktivierten Single-Channel-und Tonic Currents in Hirnschnitten der Ratte

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Agar-embedded Netzhaut Scheiben, die sich für Elektrophysiologie und Ca2 +-Imaging sind. Diese Methode erlaubt es, Band-Typ Synapsen der Netzhaut Mikroschaltungen mit direkten Patch-Clamp Messungen von einzelnen präsynaptischen Nervenendigungen zu studieren.

Patch-Clamp Kapazitätsmessungen und Ca 2 + Imaging bei Single Nervenendigungen in Retinal Slices

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie die elektrische Aktivität von einzelnen Neuronen identifiziert in einer ganzen Gehirn Vorbereitung, die komplexe neuronale Schaltkreise bewahrt aufzeichnen. Wir verwenden transgene Fische in der Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) Neuronen genetisch mit einem fluoreszierenden Protein zur Identifikation der intakten Zubereitung markiert sind.

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Es werden Verfahren beschrieben, um gleichzeitige Aufzeichnungen des Membranpotentials oder -stroms und Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration durchzuführen. Neuronen des suprachiasmatischen Kerns werden mit dem Kalziumindikator Bis-Fura-2 unter Verwendung einer Patch-Clamp-Elektrode in der Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration gefüllt.

Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung und Calcium-Bildgebung von Neuronen des suprachiasmatischen Kerns

Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, um Aufnahmen und Manipulation der neuronalen Aktivität in einem intakten Tier zu ermöglichen.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Hypophyse primären Zellkulturen von Medaka (Oryzias Latipes) zu erhalten. Die optimierte Bedingungen in diesem Protokoll nehmen wichtige Parameter wie Temperatur, Osmolalität und pH berücksichtigt durch die Nachahmung der physiologischen Bedingungen der Fische, wodurch es physiologisch mehr aussagekräftige Ergebnisse.

Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Primärzelle Kultur von Fisch Hypophysen

Hier stellen wir Protokolle zur Herstellung von akuten Hirnscheiben vor, die den lateralen Geniculate-Kern enthalten, und die elektrophysiologische Untersuchung der Funktion retinogenes und kortikogener Synapsen. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, Synapsen mit der hohen Freisetzungs- und Low-Release-Wahrscheinlichkeit in den gleichen akuten Gehirnscheiben zu untersuchen.

Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion

Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll für die Beschriftung von Blutgefäßen in einem teleost Fisch durch Herzvermischung von DiI verdünnt in Fixierung, mit medaka(Oryziaslatipes) als Modell und die Konzentration auf Gehirn und Hypophyse Gewebe.

Kennzeichnung von Blutgefäßen im Teleost Gehirn und Pituitary mit Herz-Perfusion mit einem DiI-Fixative

Eine neuartige drahtlose Technik zur Aufzeichnung extrazellulärer neuronaler Signale aus dem Gehirn frei schwimmender Goldfische wird vorgestellt. Das Aufnahmegerät besteht aus zwei Tetrodes, einem Microdrive, einem neuronalen Datenlogger und einem wasserdichten Gehäuse. Alle Teile sind mit Ausnahme des Datenloggers und seines Anschlusses maßgeschneidert.

Drahtlose elektrophysiologische Aufzeichnung von Neuronen durch bewegliche Tetrodes in frei schwimmenden Fischen

Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Transport und die Vorbereitung von resektiertem menschlichen Hippocampusgewebe mit dem ultimativen Ziel, lebenswichtige Hirnscheiben als präklinisches Bewertungsinstrument für potenzielle antiepileptikatische Substanzen zu verwenden.

Vorbereitung von akuten menschlichen Hippocampusscheiben für elektrophysiologische Aufnahmen

Lernen Sie die Präparation lebensfähiger Gehirn-Hypophysen-Scheiben aus Medaka (Oryzias latipes) für elektrophysiologische Untersuchungen mittels Patch-Clamp-Technik. Diese Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Kommunikation und Reaktionen auf Gehirnsignale im neuroendokrinen Kontext.

Gesundes Gehirn-Hypophysen-Scheiben für Elektrophysiologische Untersuchungen der Hypophysen Zellen in Teleost Fische

Weitere Videos entdecken